Formulation et caractérisation d’agents bioactifs contenant des nanodisques

Summary

Nous décrivons ici la production et la caractérisation d’agents bioactifs contenant des nanodisques. Les nanodisques d’amphotéricine B sont pris comme exemple pour décrire le protocole de manière progressive.

Abstract

Le terme nanodisque fait référence à un type discret de nanoparticule composé d’un lipide formant une bicouche, d’une protéine d’échafaudage et d’un agent bioactif intégré. Les nanodisques sont organisés comme une bicouche lipidique en forme de disque dont le périmètre est circonscrit par la protéine d’échafaudage, généralement un membre de la famille des apolipoprotéines échangeables. De nombreux agents bioactifs hydrophobes ont été efficacement solubilisés dans des nanodisques par leur intégration dans le milieu hydrophobe de la bicouche lipidique de la particule, ce qui donne une population largement homogène de particules de l’ordre de 10 à 20 nm de diamètre. La formulation de nanodisques nécessite un rapport précis de composants individuels, une addition séquentielle appropriée de chaque composant, suivie d’une sonication en bain du mélange de formulation. La protéine d’échafaudage amphipathique entre spontanément en contact et réorganise le mélange bicouche dispersé formant des lipides et des agents bioactifs pour former une population discrète et homogène de particules de nanodisques. Au cours de ce processus, le mélange réactionnel passe d’un aspect opaque et trouble à un échantillon clarifié qui, lorsqu’il est entièrement optimisé, ne produit aucun précipité lors de la centrifugation. Les études de caractérisation comprennent la détermination de l’efficacité de la solubilisation des agents bioactifs, la microscopie électronique, la chromatographie par filtration sur gel, la spectroscopie d’absorbance ultraviolette visible (UV/Vis) et/ou la spectroscopie de fluorescence. Ceci est normalement suivi d’une étude de l’activité biologique utilisant des cellules ou des souris en culture. Dans le cas des nanodisques hébergeant un antibiotique (c.-à-d. l’amphotéricine B antibiotique polyène macrolide), leur capacité à inhiber la croissance de levures ou de champignons en fonction de la concentration ou du temps peut être mesurée. La relative facilité de formulation, la polyvalence en ce qui concerne les composants, la taille des particules à l’échelle nanométrique, la stabilité inhérente et la solubilité aqueuse permettent une myriade d’applications in vitro et in vivo de la technologie des nanodisques. Dans le présent article, nous décrivons une méthodologie générale pour formuler et caractériser les nanodisques contenant de l’amphotéricine B en tant qu’agent bioactif hydrophobe.

Introduction

Les lipoprotéines discoïdales naissantes de haute densité (HDL) sont des progéniteurs naturels du HDL sphérique beaucoup plus abondant présent dans le système circulatoire humain. Ces particules naissantes, également appelées pré-ß HDL, possèdent des propriétés structurelles uniques et distinctives¹. En effet, plutôt que d’exister sous forme de particule sphéroïdale, les HDL naissants sont en forme de disque. Des études approfondies de caractérisation structurale sur les HDL discoïdaux naturels et reconstitués ont révélé qu’ils sont constitués d’une bicouche phospholipide dont le périmètre est circonscrit par une apolipoprotéine échangeable amphipathique (apo), telle que l’apoA-I. Dans le métabolisme des lipoprotéines humaines, les HDL naissants circulants accumulent des lipides des cellules périphériques et mûrissent en HDL sphériques dans un processus qui dépend de médiateurs protéiques clés, y compris le transporteur de cassette de liaison ATP A1 et l’acyltransférse lécithine:cholestérol². Ce processus représente un élément essentiel de la voie de transport inverse du cholestérol qui est considérée comme protectrice contre les maladies cardiaques. Forts de ces connaissances et de la capacité de reconstituer les HDL discoïdaux, les chercheurs ont utilisé ces particules comme intervention thérapeutique pour traiter l’athérosclérose³. En substance, la perfusion de HDL reconstitué (rHDL) chez les patients favorise l’efflux de cholestérol des dépôts de plaque et le renvoie au foie pour la conversion en acides biliaires et l’excrétion du corps. Plusieurs sociétés biotechnologiques/pharmaceutiques poursuivent cette stratégie de traitement⁴.

Dans le même temps, la capacité de générer ces particules en laboratoire a déclenché une vague d’activités de recherche qui ont conduit à de nouvelles applications et à de nouvelles technologies. Une application importante implique l’utilisation de particules rHDL comme membrane miniature pour abriter des protéines transmembranaires dans un environnement de type natif⁵. À ce jour, des centaines de protéines ont été incorporées avec succès dans le rHDL discoïdal, et la recherche a démontré que ces protéines conservent à la fois la conformation native et l’activité biologique en tant que récepteurs, enzymes, transporteurs, etc. Ces particules, appelées « nanodisques », se sont également révélées se prêtant à une caractérisation structurale, souvent à haute résolution⁶. Cette approche des recherches sur les protéines transmembranaires est reconnue comme supérieure aux études sur les micelles ou les liposomes de détergent et, par conséquent, progresse rapidement. Il est important de reconnaître que deux méthodes distinctes ont été rapportées qui sont capables de former un rHDL. La méthode de « dialyse au cholate »¹³ est populaire pour les applications liées à l’incorporation de protéines transmembranaires dans la bicouche^{rHDL 5}. Essentiellement, cette méthode de formulation consiste à mélanger un phospholipide formant une bicouche, une protéine d’échafaudage et la protéine transmembranaire d’intérêt dans un tampon contenant le détergent cholate de sodium (ou désoxycholate de sodium; masse moléculaire micelle [MW] de 4 200 Da). Le détergent solubilise efficacement les différents composants de la réaction, ce qui permet de dialyser l’échantillon contre un tampon détergent. Pendant l’étape de dialyse, lorsque le détergent est retiré de l’échantillon, un rHDL se forme spontanément. Lorsque cette approche est utilisée pour piéger une protéine transmembranaire d’intérêt, les particules de produit ont été appelées nanodisques⁵. Les tentatives d’utilisation de cette méthode pour incorporer des agents bioactifs hydrophobes à petites molécules (MW <1 000 Da), cependant, ont été largement infructueuses. Contrairement aux protéines transmembranaires, les agents bioactifs à petites molécules sont capables de s’échapper du sac de dialyse avec le détergent, ce qui diminue considérablement leur efficacité d’incorporation dans les rHDL. Ce problème a été résolu en omettant les détergents du mélange de formulation¹⁴. Au lieu de cela, les composants sont ajoutés séquentiellement à un tampon aqueux, en commençant par la bicouche formant un lipide, formant un agent bioactif stable contenant du rHDL, appelé nanodisque. D’autres ont utilisé le rHDL pour l’incorporation et le transport d’agents d’imagerie in vivo ⁷. Plus récemment, des rHDL spécialisés composés d’un échafaudage d’apolipoprotéines et du glycérophospholipide anionique, la cardiolipine, ont été utilisés dans des études de liaison aux ligands. Ces particules fournissent une plate-forme pour des études de l’interaction de la cardiolipine avec divers ligands solubles dans l’eau, y compris le calcium, le cytochrome c et l’agent anticancéreux doxorubicine⁸.

La présente étude est axée sur la formulation de rHDL qui possèdent un agent bioactif hydrophobe incorporé de manière stable (c.-à-d. nanodisque). La capacité de ces agents à s’intégrer dans le milieu lipidique des particules discoïdales de rHDL leur confère efficacement une solubilité aqueuse. En tant que tels, les nanodisques ont le potentiel pour des applications thérapeutiques in vivo . Lors de la formulation de nanodisques, des conditions d’incubation / réaction spécifiques sont nécessaires pour incorporer avec succès des agents bioactifs hydrophobes discrets dans la particule du produit, et l’objectif de ce rapport est de fournir des informations pratiques détaillées qui peuvent être utilisées comme modèle fondamental pour la création de nouvelles particules de nanodisques pour des applications spécifiques. Ainsi, dans le contexte de ce manuscrit, les termes nanodisque et nanodisque ne sont pas interchangeables. Alors que nanodisque fait référence à un rHDL formulé pour contenir une protéine transmembranaire intégrée dans sa bicouche lipidique⁵, le terme nanodisque fait référence à un rHDL formulé pour incorporer des agents bioactifs hydrophobes de faible poids moléculaire (< 1 000 Da), tels que l’amphotéricine B¹⁴.

Diverses méthodes sont disponibles pour l’acquisition de protéines d’échafaudage appropriées. Il est possible d’acheter des protéines d’échafaudage auprès de fabricants [par exemple, apoA-I (SRP4693) ou apoE4 (A3234)], mais le coût peut être un facteur limitant. Une approche privilégiée consiste à exprimer des protéines d’échafaudage recombinantes dans Escherichia coli. Des protocoles sont publiés pour l’apoA-I 9⁹, l’apoE4¹⁰ humaine, ainsi que pour la protéine d’hémolymphe d’insecte apolipophorin-III¹¹. Pour les besoins des expériences décrites ici, le domaine N-terminal (NT) apoE4 humain recombinant (acides aminés 1-183) a été utilisé. La séquence nucléotidique codant pour l’apoE4-NT humain a été synthétisée et insérée dans un vecteur d’expression pET-22b (+) directement adjacent à la séquence de tête pelB codée par le vecteur. Cette construction conduit à l’expression d’une protéine de fusion pelB leader-apoE4-NT. Après la synthèse des protéines, la séquence de tête pelB bactérienne dirige la protéine nouvellement synthétisée vers l’espace périplasmique où la peptidase leader clive la séquence pelB. La protéine apoE4-NT résultante, sans marqueurs de séquence ni queues, échappe ensuite aux bactéries et s’accumule dans le milieu^{de culture 11,12,} simplifiant le traitement en aval.

Protocol

1. Transformation, expression et purification du composant protéique d’échafaudage Transformation bactérienne BL21 avec plasmide contenant de l’apoE4-NTDécongeler un tube de cellules compétentes BL21 (DE3) sur de la glace pendant 10 min. Une fois que toute la glace a fondu, mélanger doucement et soigneusement pipeter 50 μL des cellules dans un tube de transformation sur de la glace. Ajouter 5 μL contenant 50 ng d’ADN plasmidique (pour la séquence, vo…

Representative Results

Procédé de formulation de nanodisques d’agent bioactifDans la procédure de formulation ampB-nanodisque décrite, la réaction est considérée comme terminée lorsque l’aspect de l’échantillon passe de trouble à clair (Figure 1). Ce changement indique que des nanodisques se sont formés et que l’agent bioactif a été solubilisé. Souvent, les agents bioactifs absorbent la lumière dans la région de longueur d’onde visible (par exemple, ampB, curcumine, l…

Discussion

La formulation d’un agent bioactif contenant des nanodisques fournit une méthode pratique pour solubiliser des composés hydrophobes autrement insolubles. Étant donné que les nanodisques d’agents bioactifs du produit sont entièrement solubles dans les milieux aqueux, ils constituent une méthode d’administration utile pour un large éventail de molécules hydrophobes (tableau 1). Il s’agit notamment des petites molécules, des drogues naturelles et synthétiques, des phytonutriments, des horm…

Materials

Amphotericin B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin	Fisher Scientific	BP17925	Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid	GenScript	N/A	Transformation
Baffled Flask	New Brunswick Scientific	N/A	Expansion & Expression
BL21 competent E coli	New England Biolabs	C2527I	Transformation
Centrifuge bottles	Nalgene	3140-0250	Expression
Chloroform	Fisher Scientific	G607-4	ND Formulation
DMSO	Sigma Aldrich	472301	Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine	Avanti Lipids	850345P	ND Formulation
Erlenmeyer flask	Bellco Biotechnology	N/A	Expansion & Expression
Falcon Tubes	Sarstedt Ag & Co	D51588	Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes	VWR	47729-570	ND Formulation
GraphPad (Software)	Dotmatics	N/A	Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath	VWR	N/A	ND Formulaton
Heating and Nitrogen module	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Fisher Scientific	BP1755	Expression
J-25 Centrifuge	Beckman Coulter	J325-IM-2	Expression
JA-14 Rotor	Beckman Coulter	339247	Expression
Lyophilizer	Labconco	7755030	ND Formulation
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	ND Formulation
Nitrogen gas	Praxair	UN1066	ND Formulation
NZCYM media	RPI Research Products	N7200-1000.0	Expansion & Expression
Pet-22B vector	GenScript	N/A	Transformation
Petri dish	Fisher Scientific	FB0875718	Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes	Fisher Brand	14385 928A	Spectral Analysis
Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys	Thermo Scientific	66430	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	68100	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	88243	Purification
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271	Purification
Sodium Phosphate dibasic	Fisher Scientific	S374-500	Purification
Sodium Phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-500	Purification
Spectra/POR Weighted Closures	Spectrum Medical Industries	132736	Purification
Spectrophotometer	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	spectral analysis
Tabletop Centrifuge	Beckman Coulter	366816	ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)	Shimadzu	N/A	Spectral Analysis
Vacuum filter	Millipore	9004-70-0	Expression & Purification
Vacuum pump	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Expression & Purification
Vortex	Fisher Scientific	12-812	ND Formulation
Yeast	N/A	BY4741	Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose	BD	242820	Yeast Viability Assay