Рецептура и характеристика биологически активного агента, содержащего нанодиски

Summary

Здесь мы описываем производство и характеристику биологически активных агентов, содержащих нанодиски. Нанодиски амфотерицина B взяты в качестве примера для поэтапного описания протокола.

Abstract

Термин нанодиск относится к дискретному типу наночастицы, состоящей из двухслойного липида, белка каркаса и интегрированного биологически активного агента. Нанодиски организованы в виде дискообразного липидного бислоя, периметр которого ограничен каркасным белком, обычно входящим в семейство обменных аполипопротеинов. Многочисленные гидрофобные биологически активные агенты были эффективно растворены в нанодисках путем их интеграции в гидрофобную среду липидного бислоя частицы, в результате чего образовалась в значительной степени однородная популяция частиц в диапазоне диаметром 10-20 нм. Составление нанодисков требует точного соотношения отдельных компонентов, соответствующего последовательного добавления каждого компонента с последующим ультразвуком в ванне смеси состава. Амфипатический каркасный белок спонтанно контактирует и реорганизует дисперсный бислой, образуя смесь липидов и биологически активных веществ, образуя дискретную однородную популяцию частиц нанодиска. Во время этого процесса реакционная смесь переходит от непрозрачного, мутного вида к осветленному образцу, который при полной оптимизации не дает осадка при центрифугировании. Характеризирующие исследования включают определение эффективности солюбилизации биологически активных веществ, электронную микроскопию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафиолетовую видимую (УФ/Vis) спектроскопию поглощения и/или флуоресцентную спектроскопию. Обычно за этим следует исследование биологической активности с использованием культивируемых клеток или мышей. В случае нанодисков, содержащих антибиотик (т.е. макролидный полиеновый антибиотик амфотерицин В), их способность ингибировать рост дрожжей или грибков в зависимости от концентрации или времени может быть измерена. Относительная простота составления, универсальность по отношению к составным частям, наноразмерный размер частиц, присущая стабильность и растворимость в воде позволяют применять технологию нанодисков in vitro и in vivo . В настоящей статье мы описываем общую методологию формулирования и характеристики нанодисков, содержащих амфотерицин B, в качестве гидрофобного биологически активного агента.

Introduction

Зарождающиеся дискоидальные липопротеины высокой плотности (ЛПВП) являются естественными предшественниками гораздо более распространенных сферических ЛПВП, присутствующих в системе кровообращения человека. Эти зарождающиеся частицы, также называемые пре-ß ЛПВП, обладают уникальными и отличительными структурными свойствами¹. Действительно, вместо того, чтобы существовать как сфероидальная частица, зарождающиеся ЛПВП имеют форму диска. Обширные исследования структурных характеристик естественных и восстановленных дискоидальных ЛПВП показали, что они состоят из фосфолипидного бислоя, периметр которого ограничен амфипатическим обменным аполипопротеином (апо), таким как апоА-I. В метаболизме липопротеинов человека циркулирующие зарождающиеся ЛПВП накапливают липиды из периферических клеток и созревают в сферические ЛПВП в процессе, который зависит от ключевых белковых медиаторов, включая кассетный транспортер A1, связывающий АТФ, и лецитин: холестерин ацилтрансферс². Этот процесс представляет собой важнейший компонент обратного пути транспорта холестерина, который считается защитным от сердечных заболеваний. Вооружившись этими знаниями и способностью восстанавливать дискоидальные ЛПВП, исследователи использовали эти частицы в качестве терапевтического вмешательства для лечения атеросклероза³. По сути, вливание восстановленного ЛПВП (рЛПВП) пациентам способствует оттоку холестерина из отложений бляшек и возвращает его в печень для превращения в желчные кислоты и выведения из организма. Несколько биотехнологических/фармацевтических компаний придерживаются этой стратегии лечения⁴.

В то же время способность генерировать эти частицы в лаборатории вызвала шквал исследовательской деятельности, которая привела к новым приложениям и новым технологиям. Одно из известных применений включает использование частиц рЛПВП в качестве миниатюрной мембраны для размещения трансмембранных белков в нативной среде⁵. На сегодняшний день сотни белков были успешно включены в дискоидальный рЛПВП, и исследования показали, что эти белки сохраняют как нативную конформацию, так и биологическую активность в качестве рецепторов, ферментов, транспортеров и т. д. Также было показано, что эти частицы, называемые «нанодисками», поддаются структурной характеристике, часто с высоким разрешением⁶. Этот подход к исследованиям трансмембранных белков признан превосходящим исследования с моющими мицеллами или липосомами и, как следствие, быстро развивается. Важно признать, что сообщалось о двух различных методах, способных формировать рЛПВП. Метод «холатного диализа»¹³ популярен для применений, связанных с включением трансмембранных белков в бислой⁵ рЛПВП. По существу, этот способ приготовления включает смешивание двухслойного фосфолипида, белка каркаса и трансмембранного белка, представляющего интерес, в буфере, содержащем детергент холат натрия (или дезоксихолат натрия; молекулярная масса мицеллы [MW] 4,200 Да). Моющее средство эффективно растворяет различные компоненты реакции, позволяя диализовать образец против буфера, в котором отсутствует моющее средство. На этапе диализа, когда моющее средство удаляется из образца, спонтанно образуется рЛПВП. Когда этот подход используется для захвата интересующего трансмембранного белка, частицы продукта были названы нанодисками⁵. Однако попытки использовать этот метод для включения низкомолекулярных гидрофобных биологически активных агентов (MW <1000 Da) были в значительной степени безуспешными. В отличие от трансмембранных белков, низкомолекулярные биологически активные агенты способны выходить из диализного мешка вместе с детергентом, что значительно снижает эффективность их включения в рЛПВП. Эта проблема была решена путем исключения моющих средств из рецептурной смеси¹⁴. Вместо этого компоненты добавляют в водный буфер последовательно, начиная с бислоя, образующего липид, образуя стабильный биологически активный агент, содержащий рЛПВП, называемый нанодиском. Другие использовали рЛПВП для включения и транспортировки агентов визуализации in vivo ⁷. Совсем недавно специализированные рЛПВП, состоящие из каркаса аполипопротеина и анионного глицерофосфолипида, кардиолипина, использовались в исследованиях связывания лигандов. Эти частицы обеспечивают платформу для исследований взаимодействия кардиолипина с различными водорастворимыми лигандами, включая кальций, цитохром с и противоопухолевый агент доксорубицин⁸.

Основное внимание в настоящем исследовании уделяется составлению рЛПВП, которые обладают стабильно включенным гидрофобным биологически активным агентом (т.е. нанодиском). Способность этих агентов интегрироваться в липидную среду дискоидальных частиц рЛПВП эффективно придает им растворимость в воде. Таким образом, нанодиски имеют потенциал для терапевтического применения in vivo . При разработке нанодисков требуются определенные условия инкубации/реакции для успешного включения дискретных гидрофобных биологически активных агентов в частицу продукта, и целью этого отчета является предоставление подробной практической информации, которая может быть использована в качестве основополагающего шаблона для создания новых частиц нанодисков для конкретных применений. Таким образом, в контексте данной рукописи термины «нанодиск» и «нанодиск» не являются взаимозаменяемыми. В то время как нанодиск относится к рЛПВП, разработанному для содержания трансмембранного белка, встроенного в его липидный бислой⁵, термин нанодиск относится к рЛПВП, разработанному для включения низкомолекулярных (< 1000 Да) гидрофобных биологически активных агентов, таких как амфотерицин В¹⁴.

Существует множество методов получения подходящих белков каркаса. Можно приобрести каркасные белки у производителей [например, apoA-I (SRP4693) или apoE4 (A3234)], однако стоимость может быть ограничивающим фактором. Предпочтительным подходом является экспрессия рекомбинантных белков каркаса в Escherichia coli. Опубликованы протоколы для человека apoA-I⁹, apoE4¹⁰, а также белка гемолимфы насекомых аполипофорина-III¹¹. Для целей экспериментов, описанных в настоящем описании, использовали рекомбинантный N-концевой (NT) домен человека apoE4 (аминокислоты 1-183). Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий apoE4-NT, была синтезирована и вставлена в вектор экспрессии pET-22b (+), непосредственно примыкающий к векторно-кодируемой лидерной последовательности pelB. Эта конструкция приводит к экспрессии белка слияния лидерной последовательности pelB – apoE4-NT. После синтеза белка бактериальная лидерная последовательность pelB направляет вновь синтезированный белок в периплазматическое пространство, где пептидаза-лидер расщепляет последовательность pelB. Полученный белок apoE4-NT без меток последовательности или хвостов впоследствии ускользает от бактерий и накапливается в питательной среде^11,12, упрощая последующую обработку.

Protocol

1. Трансформация, экспрессия и очистка белкового компонента каркаса Бактериальная трансформация BL21 с помощью плазмиды, содержащей apoE4-NTРазморозьте пробирку с компетентными ячейками BL21 (DE3) на льду в течение 10 мин. Как только весь лед растает, аккуратно и осторожн…

Representative Results

Процесс создания нанодисков с биологически активными веществамиВ описанной процедуре приготовления ampB-нанодиска реакция считается завершенной, когда внешний вид образца переходит от мутного к прозрачному (рис. 1). Это изменение указывает на то, что образова…

Discussion

Рецептура биологически активного агента, содержащего нанодиски, обеспечивает удобный метод растворения нерастворимых гидрофобных соединений. Поскольку нанодиски биологически активного агента продукта полностью растворимы в водных средах, они обеспечивают полезный способ доставки…

Materials

Amphotericin B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin	Fisher Scientific	BP17925	Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid	GenScript	N/A	Transformation
Baffled Flask	New Brunswick Scientific	N/A	Expansion & Expression
BL21 competent E coli	New England Biolabs	C2527I	Transformation
Centrifuge bottles	Nalgene	3140-0250	Expression
Chloroform	Fisher Scientific	G607-4	ND Formulation
DMSO	Sigma Aldrich	472301	Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine	Avanti Lipids	850345P	ND Formulation
Erlenmeyer flask	Bellco Biotechnology	N/A	Expansion & Expression
Falcon Tubes	Sarstedt Ag & Co	D51588	Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes	VWR	47729-570	ND Formulation
GraphPad (Software)	Dotmatics	N/A	Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath	VWR	N/A	ND Formulaton
Heating and Nitrogen module	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Fisher Scientific	BP1755	Expression
J-25 Centrifuge	Beckman Coulter	J325-IM-2	Expression
JA-14 Rotor	Beckman Coulter	339247	Expression
Lyophilizer	Labconco	7755030	ND Formulation
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	ND Formulation
Nitrogen gas	Praxair	UN1066	ND Formulation
NZCYM media	RPI Research Products	N7200-1000.0	Expansion & Expression
Pet-22B vector	GenScript	N/A	Transformation
Petri dish	Fisher Scientific	FB0875718	Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes	Fisher Brand	14385 928A	Spectral Analysis
Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys	Thermo Scientific	66430	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	68100	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	88243	Purification
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271	Purification
Sodium Phosphate dibasic	Fisher Scientific	S374-500	Purification
Sodium Phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-500	Purification
Spectra/POR Weighted Closures	Spectrum Medical Industries	132736	Purification
Spectrophotometer	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	spectral analysis
Tabletop Centrifuge	Beckman Coulter	366816	ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)	Shimadzu	N/A	Spectral Analysis
Vacuum filter	Millipore	9004-70-0	Expression & Purification
Vacuum pump	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Expression & Purification
Vortex	Fisher Scientific	12-812	ND Formulation
Yeast	N/A	BY4741	Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose	BD	242820	Yeast Viability Assay