Summary

التوصيف السلوكي لنموذج فأر متلازمة أنجلمان

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

تقدم هذه المخطوطة مجموعة من الاختبارات السلوكية القابلة للتكرار للتحقق من صحة نموذج فأر متلازمة أنجلمان.

Abstract

تصف هذه المخطوطة مجموعة من الاختبارات السلوكية المتاحة لتوصيف الأنماط الظاهرية الشبيهة بمتلازمة أنجلمان (AS) في نموذج الفئران الراسخ ل AS. نحن نستخدم نموذج التعلم الروتارودي ، وتحليل مفصل للمشي ، واختبار بناء العش لاكتشاف وتوصيف الإعاقات الحركية الحيوانية. نقوم باختبار عاطفة الحيوان في الحقل المفتوح واختبارات المتاهة المرتفعة بالإضافة إلى ، بالإضافة إلى التأثير في اختبار تعليق الذيل. عندما يتم اختبار الفئران AS في اختبار المجال المفتوح ، يجب تفسير النتائج بعناية ، لأن الاختلالات الحركية تؤثر على سلوك الماوس في المتاهة وتغير درجات النشاط.

تم بالفعل التحقق من صحة استنساخ وفعالية الاختبارات السلوكية المقدمة في العديد من خطوط الماوس Uba3a المستقلة مع متغيرات خروج المغلوب المختلفة ، مما أدى إلى إنشاء هذه المجموعة من الاختبارات كأداة تحقق ممتازة في أبحاث AS. ستضمن النماذج ذات البنية ذات الصلة وصحة الوجه مزيدا من التحقيقات لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية للمرض ومنح تطوير العلاجات السببية.

Introduction

متلازمة أنجلمان (AS) هي مرض نمو عصبي نادر. الأصل الجيني الأكثر شيوعا ل AS هو حذف كبير لمنطقة 15q11-q13 من الكروموسوم المشتق من الأم ، والذي يوجد في ما يقرب من 74٪ من المرضى1. يؤدي حذف هذه المنطقة إلى فقدان UBE3A ، الجين المسبب الرئيسي ل AS الذي يشفر E3 ubiquitin ligase. يتم إسكات الأليل الأبوي لجين UBE3A في الخلايا العصبية في عملية تعرف باسم البصمة. ونتيجة لذلك، فإن البصمة الأبوية للجين تسمح فقط بالتعبير الأمومي في الجهاز العصبي المركزي (CNS)2. لذلك ، يؤدي حذف جين UBE3A من الكروموسوم المشتق من الأم إلى ظهور أعراض AS. في البشر ، يظهر AS في حوالي 6 أشهر من العمر ، مع تأخر النمو الذي يستمر في جميع مراحل النمو ويؤدي إلى أعراض موهنة شديدة لدى الأفراد المصابين 3,4. تشمل الأعراض الأساسية للاضطراب عجز المهارات الحركية الدقيقة والجسيمة ، بما في ذلك المشية الرنحية المتشنجة ، وضعف الكلام الخطير ، والإعاقة الذهنية. ما يقرب من 80 ٪ من مرضى AS يعانون أيضا من اضطرابات النوم والصرع. حتى الآن ، العلاج الوحيد المتاح هو الأدوية العرضية ، والتي تقلل من نوبات الصرع وتحسن نوعية النوم1. لذلك ، فإن تطوير نماذج حيوانية قوية ذات أنماط ظاهرية سلوكية قابلة للتكرار جنبا إلى جنب مع تحليل النمط الظاهري المكرر سيكون ضروريا لتوضيح الآليات الفيزيولوجية المرضية للاضطراب واكتشاف الأدوية والعلاجات الفعالة.

يتطلب تعقيد الاضطراب البشري الذي يؤثر على الجهاز العصبي المركزي كائنات نموذجية لامتلاك جينوم وعلم وظائف الأعضاء والسلوك المماثل. تحظى الفئران بشعبية ككائن نموذجي بسبب دورة التكاثر القصيرة وصغر حجمها والسهولة النسبية لتعديل الحمض النووي. في عام 1984 ، اقترح بول ويلنر ثلاثة معايير أساسية للتحقق من صحة نموذج المرض: البناء والوجه والصلاحية التنبؤية ، والتي تستخدم لتحديد قيمة النموذج5. ببساطة ، تعكس صلاحية البناء الآليات البيولوجية المسؤولة عن تطور الاضطراب ، وتلخص صلاحية الوجه أعراضه ، وتصف الصلاحية التنبؤية استجابة النموذج للأدوية العلاجية.

للالتزام بالمبادئ المذكورة أعلاه ، اخترنا المسببات الجينية الأكثر شيوعا ، وهي حذف كبير لموضع الأم 15q11.2-13q بما في ذلك جين UBE3A ، لإنشاء فئران نموذجية AS. استخدمنا تقنية CRISPR / Cas9 لحذف منطقة طولها 76,225 نقطة أساس تمتد عبر جين UBE3A بأكمله ، وتشمل كلا من العناصر المشفرة وغير المشفرة للجين ، في الفئران من خلفية C57BL / 6N6. ثم قمنا بتربية الحيوانات للحصول على UBE3A +/- الفئران غير المتجانسة. للتحقق من صحة الوجه للنموذج ، استخدمنا من تهجين UBE3A + / – إناث وذكور من النوع البري للحصول على ذرية UBE3A +/- (سلالة تسمى C57BL / 6NCrl-UBE3A / Ph وتم تعيينها لاحقا على أنها UBE3A mGenedel / +) والتحكم في القمامة. اختبرنا مهاراتهم الحركية الدقيقة والجسيمة ، والعاطفية ، والتأثير لتلخيص أعراض AS الأساسية. في مقال سابق ، قمنا أيضا بتقييم الوظائف المعرفية للحيوانات ، حيث يعاني مرضى AS أيضا من إعاقة ذهنية6. ومع ذلك ، لم نجد أي إعاقات إدراكية في الفئران UBE3AmGenedel / + ، ربما بسبب صغر سن الحيوانات في وقت الاختبار7. كشف الفحص اللاحق للحيوانات الأكبر سنا ، التي يبلغ عمرها حوالي 18 أسبوعا ، عن عجز في المرونة السلوكية أثناء التعلم العكسي في نموذج تفضيل المكان. ومع ذلك ، فإن تعقيد المعدات المستخدمة لهذا التحليل يتطلب وحدة منهجية منفصلة ولا يتم تضمينها هنا.

تنتمي الاختبارات السلوكية المعروضة هنا إلى أدوات التنميط الظاهري الشائعة في البحث الجيني ، وذلك بفضل قيمتها التنبؤية العالية وصلاحية البناء الكافية8،9،10. استخدمنا هذه الاختبارات للتحقق من صحة نموذج الفئران من AS من خلال تلخيص الأعراض الأساسية للمرض البشري بطريقة قابلة للتكرار ومستقلة عن العمر. تم تقييم عاطفية الحيوان في اختبارات المتاهة المرتفعة والاختبارات الميدانية المفتوحة. يعتمد كلا الاختبارين على صراع الاقتراب وتجنب ، حيث تستكشف الحيوانات بيئة جديدة بحثا عن الطعام أو المأوى أو فرص التزاوج مع تجنب المقصورات المسببة للقلق في نفس الوقت11. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام اختبار المجال المفتوح لاختبار النشاط الحركي للفأر8. يستخدم اختبار تعليق الذيل على نطاق واسع في أبحاث الاكتئاب للكشف عن أدوية جديدة مضادة للاكتئاب أو أنماط ظاهرية شبيهة بالاكتئاب في نماذج خروج المغلوبللفأر 12. يقيم هذا الاختبار اليأس الذي تتطور به الحيوانات بمرور الوقت في موقف لا مفر منه. تم تحديد التعلم الحركي وخصائص المشي التفصيلية على الروتارود وفي DigiGait ، على التوالي. يميز تحمل الحيوان على قضيب التسارع مهاراته في التوازن وتنسيق الحركة ، في حين أن التحليل التفصيلي لأنماط خطوات الفأر هو تقييم حساس للإعاقات العصبية العضلية المرتبطة بالعديد من اضطرابات الحركة العصبية13،14،15. يعد اختبار تمزيق نستله جزءا من المنهجية القياسية للكشف عن السلوك الاندفاعي في القوارض ، ولأنه يستخدم سلوك بناء القوارض الطبيعي ، فإنه يشير إلى رفاهية الحيوان16,17.

كان حجم المجموعات التجريبية نتيجة لحل وسط لتلبية متطلبات قاعدة 3R والاستخدام الفعال لأداء تربية المستعمرات. ومع ذلك ، للحصول على قوة إحصائية ، كان لدى المجموعات ما لا يقل عن 10 أفراد ، بسبب إنشاء كمية كافية من أزواج التكاثر. لسوء الحظ ، لم ينتج عن أداء التكاثر دائما عدد كاف من الحيوانات.

Protocol

خضعت جميع الحيوانات والتجارب المستخدمة في هذه الدراسة لمراجعة أخلاقية وأجريت وفقا للتوجيه الأوروبي 2010/63 / EU. تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة المركزية التشيكية لرعاية الحيوان. تم إيواء الفئران في أقفاص جيدة التهوية وتم الحفاظ عليها عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 22 ± 2 درجة مئوية مع دورة ض?…

Representative Results

مرتفع بالإضافة إلى متاهة واختبارات ميدانية مفتوحةتستخدم اختبارات EPM و OF الميل الطبيعي للقوارض لاستكشاف بيئات جديدة18,19. يخضع الاستكشاف لصراع تجنب النهج ، حيث تختار القوارض بين استكشاف بيئة جديدة وتجنب الخطر المحتمل. تستكشف الحيوانات أماكن غير م?…

Discussion

عادة ما يتم التحقق من صحة نماذج AS التي تم إنشاؤها في سلالات الفئران المختلفة من خلال اختبارات الحالة العاطفية للحيوان والوظائف الحركية والقدرات المعرفية لتسهيل المقارنة مع الأعراض البشرية31,32. العجز الحركي في نماذج AS هو النتيجة الأكثر اتساقا عبر المختبرات …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل الأكاديمية التشيكية للعلوم RVO 68378050 ، LM2018126 المركز التشيكي لعلم الظواهر المقدم من MEYS CR ، OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (ترقية المركز التشيكي لعلم الفينوجينوم: التطوير نحو أبحاث الترجمة من قبل MEYS و ESIF) ، OP RDE CZ.02.1.01 / 0.0 / 0.0 / 18_046 / 0015861 (ترقية البنية التحتية CCP II بواسطة MEYS و ESIF) ، و OP RDI CZ.1.05 / 2.1.00 / 19.0395 (جودة وقدرة أعلى للنماذج المعدلة وراثيا بواسطة MEYS و ERDF). وبالإضافة إلى ذلك، تلقت هذه الدراسة تمويلا من المنظمة غير الحكومية “رابطة العلاج الجيني” والتشيك (https://asgent.org/) والمركز التشيكي LM2023036 علم الظواهر المقدم من وزارة التعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية.

Materials

Cages, individually ventilated Techniplast
DigiGait Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow Altramion
Rotarod TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE
Reference: BIO-TST5 Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape Medical M, Ltd. P-AIRO1291 The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer – Video Tracking System Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany
Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

Riferimenti

  1. Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
  2. Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
  3. Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
  4. Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman’s syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
  5. Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
  6. Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
  7. Huang, H. -. S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
  8. Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
  9. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Carola, V., D’Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
  12. Yan, H. -. C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -. H., Gao, T. -. M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  13. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
  14. Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
  15. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
  16. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
  17. Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
  18. Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
  19. La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
  20. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
  21. Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
  22. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  23. Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
  24. Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D’Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
  25. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
  26. Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
  27. Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354 (2011).
  28. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  29. Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
  30. Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
  31. Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
  32. Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
  33. Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
  34. File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
  35. Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
  36. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
  37. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
  38. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
  39. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  40. Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
  41. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  42. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  43. Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
  44. Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
  45. Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).

Play Video

Citazione di questo articolo
Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J., Sedlacek, R. Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (200), e65182, doi:10.3791/65182 (2023).

View Video