Gedragskarakterisering van een Angelman Syndroom Muismodel

Summary

Dit manuscript presenteert een reeks zeer reproduceerbare gedragstests om een muismodel met het Angelman-syndroom te valideren.

Abstract

Dit manuscript beschrijft een reeks gedragstests die beschikbaar zijn om angelmansyndroom (AS) -achtige fenotypen te karakteriseren in een gevestigd muizenmodel van AS. We gebruiken het rotarod-leerparadigma, gedetailleerde loopanalyse en nestbouwtest om motorische beperkingen bij dieren te detecteren en te karakteriseren. We testen de emotionaliteit van dieren in het open veld en verhoogde plus doolhoftests, evenals het effect in de staartsuspensietest. Wanneer AS-muizen worden getest in de open veldtest, moeten de resultaten met zorg worden geïnterpreteerd, omdat motorische disfuncties het gedrag van muizen in het doolhof beïnvloeden en de activiteitsscores veranderen.

De reproduceerbaarheid en effectiviteit van de gepresenteerde gedragstests is al gevalideerd in verschillende onafhankelijke Uba3a-muislijnen met verschillende knock-outvarianten, waardoor deze reeks tests een uitstekend validatie-instrument is in AS-onderzoek. Modellen met de relevante constructie en gezichtsvaliditeit zullen verder onderzoek rechtvaardigen om de pathofysiologie van de ziekte op te helderen en de ontwikkeling van causale behandelingen toe te staan.

Introduction

Angelman syndroom (AS) is een zeldzame neurologische ontwikkelingsziekte. De meest voorkomende genetische oorsprong van AS is een grote deletie van het 15q11-q13-gebied van het maternale chromosoom, dat wordt aangetroffen bij bijna 74% van de patiënten¹. Deletie van dit gebied veroorzaakt het verlies van UBE3A, het belangrijkste oorzakelijke gen van AS dat codeert voor een E3-ubiquitineligase. Het vaderlijke allel van het UBE3A-gen in neuronen wordt tot zwijgen gebracht in een proces dat bekend staat als imprinting. Als gevolg hiervan staat vaderlijke inprenting van het gen alleen maternale expressie in het centrale zenuwstelsel (CZS)² toe. Daarom leidt UBE3A-gendeletie van het maternale chromosoom tot de ontwikkeling van AS-symptomen. Bij mensen manifesteert AS zich rond de leeftijd van 6 maanden, met ontwikkelingsachterstand die aanhoudt in alle ontwikkelingsstadia en resulteert in ernstige slopende symptomen bij getroffen personen ^3,4. De kernsymptomen van de aandoening zijn het tekort aan fijne en grove motoriek, waaronder schokkerige ataxische gang, ernstige spraakstoornissen en intellectuele achterstand. Ongeveer 80% van de AS-patiënten lijdt ook aan slaapstoornissen en epilepsie. Tot op heden zijn de enige beschikbare behandelingen symptomatische geneesmiddelen, die epileptische aanvallen verminderen en de slaapkwaliteit verbeteren¹. Daarom zal de ontwikkeling van robuuste diermodellen met reproduceerbare gedragsfenotypen naast verfijnde fenotyperingsanalyse essentieel zijn om de pathofysiologische mechanismen van de aandoening op te helderen en effectieve medicijnen en behandelingen te ontdekken.

De complexiteit van de menselijke aandoening die het CZS beïnvloedt, vereist dat modelorganismen een vergelijkbaar genoom, fysiologie en gedrag bezitten. Muizen zijn populair als modelorganisme vanwege hun korte voortplantingscyclus, kleine omvang en relatief gemak van DNA-modificatie. In 1984 stelde Paul Willner drie basisvalidatiecriteria voor ziektemodellen voor: de construct, het gezicht en de voorspellende validiteit, die worden gebruikt om de waarde van het model^{te bepalen 5}. Simpel gezegd, constructvaliditeit weerspiegelt de biologische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van de stoornis, gezichtsvaliditeit vat de symptomen samen en voorspellende validiteit beschrijft de modelrespons op therapeutische geneesmiddelen.

Om aan de bovenstaande principes te voldoen, hebben we de meest voorkomende genetische etiologie gekozen, een grote deletie van de maternale 15q11.2-13q-locus inclusief het UBE3A-gen, om AS-modelmuizen te creëren. We gebruikten de CRISPR/Cas9-techniek om een 76.225 bp lang gebied te verwijderen dat het hele UBE3A-gen beslaat, dat zowel de coderende als niet-coderende elementen van het gen omvat, bij muizen met een C57BL/6N-achtergrond⁶. Vervolgens hebben we de dieren gefokt om UBE3A^+/− heterozygote muizen te verkrijgen. Voor gezichtsvalidatie van het model gebruikten we dieren van kruisingen van UBE3A+/⁻ vrouwtjes en wild-type mannetjes om UBE3A+/- nakomelingen te krijgen (stam genaamd C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph en later toegewezen als UBE3A ^mGenedel/+) en controle nestgenoten. We testten hun fijne en grove motoriek, emotionaliteit en affect om de kern AS-symptomen samen te vatten. In een vorig artikel evalueerden we ook de cognitieve functies van de dieren, omdat AS-patiënten ook lijden aan een verstandelijke beperking⁶. We vonden echter geen cognitieve stoornissen bij UBE3A^mGenedel/+ muizen, misschien als gevolg van de jonge leeftijd van de dieren op het moment van testen⁷. Later onderzoek van de oudere dieren, ongeveer 18 weken oud, onthulde een tekort aan gedragsflexibiliteit tijdens omkeringsleren in het plaatsvoorkeurparadigma. De complexiteit van de gebruikte apparatuur voor deze analyse vereist echter een afzonderlijke methodologische module en deze is hier niet opgenomen.

De hier gepresenteerde gedragstests behoren tot de gebruikelijke fenotyperingsinstrumenten in genetisch onderzoek, dankzij hun hoge voorspellende waarde en voldoende constructvaliditeit ^8,9,10. We gebruikten deze tests om een muismodel van AS te valideren door kernsymptomen van de menselijke ziekte op een reproduceerbare, leeftijdsonafhankelijke manier samen te vatten. De emotionaliteit van het dier werd geëvalueerd in de verhoogde plus doolhof en open veld tests. Beide tests zijn gebaseerd op het benaderingsvermijdingsconflict, waarbij dieren een nieuwe omgeving verkennen op zoek naar voedsel, onderdak of paringsmogelijkheden en tegelijkertijd anxiogene compartimenten vermijden¹¹. Daarnaast wordt de open veld test gebruikt om de locomotorische activiteit van een muis te testen⁸. De staartsuspensietest wordt veel gebruikt in depressieonderzoek om te screenen op nieuwe antidepressiva of depressieve fenotypen in knock-outmodellen van muizen¹². Deze test evalueert de wanhoop die dieren in de loop van de tijd ontwikkelen in een onontkoombare situatie. Motorisch leren en gedetailleerde loopkarakteristieken werden respectievelijk bepaald op de rotarod en in DigiGait. Het uithoudingsvermogen van dieren op de versnellende staaf kenmerkt zijn evenwichts- en bewegingscoördinatievaardigheden, terwijl gedetailleerde analyse van de stappatronen van een muis een gevoelige evaluatie is van neuromusculaire stoornissen die verband houden met vele neurogeneratieve bewegingsstoornissen^13,14,15. De nestjesversnipperringstest maakt deel uit van de standaardmethodologie voor het detecteren van impulsief gedrag bij knaagdieren, en omdat het gebruik maakt van natuurlijk knaagdierbouwgedrag, geeft het het welzijn van het dier aan^16,17.

De grootte van de experimentele groepen was het resultaat van een compromis om te voldoen aan de eisen van de 3R-regel en efficiënt gebruik van kolonie-fokprestaties. Om statistische kracht te verkrijgen, hadden de groepen echter niet minder dan 10 individuen, vanwege de oprichting van een voldoende aantal broedparen. Helaas resulteerden fokprestaties niet altijd in voldoende dieren.

Protocol

Alle dieren en experimenten die in dit onderzoek zijn gebruikt, hebben een ethische beoordeling ondergaan en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63/EU. De studie werd goedgekeurd door de Tsjechische Centrale Commissie voor Dierenwelzijn. Muizen werden gehuisvest in individueel geventileerde kooien en op een constante temperatuur van 22 ± 2 °C gehouden met een licht/donkercyclus van 12 uur. De muizen werden voorzien van muizenchow en water ad libitum. De muizen werden gehuisvest in…

Representative Results

Verhoogd plus doolhof en open veld testenDe EPM- en OF-tests gebruiken de natuurlijke neiging van knaagdieren om nieuwe omgevingen te verkennen18,19. De verkenning wordt beheerst door een benadering-vermijdingsconflict, waarbij knaagdieren kiezen tussen het verkennen van een nieuwe omgeving en het vermijden van mogelijk gevaar. Dieren verkennen onbekende plaatsen op zoek naar beschutting, sociaal contact of foerageren. Nieuwe plaatsen kunnen …

Discussion

AS-modellen gemaakt in verschillende muizenstammen worden vaak gevalideerd met tests van de emotionele toestand van dieren, motorische functies en cognitieve vaardigheden om vergelijking met menselijke symptomen te vergemakkelijken^31,32. Een motorisch tekort in AS-modellen is de meest consistente bevinding in laboratoria, gevolgd door een onveranderde emotionaliteitstoestand van mutanten en problemen met het bouwen van nesten^31,32,33<…

Materials

Cages, individually ventilated	Techniplast
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.
FDA Nestlet squares	Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK	Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.	Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow	Altramion
Rotarod	TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test	Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE	Reference: BIO-TST5	Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape	Medical M, Ltd.	P-AIRO1291	The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer – Video Tracking System	Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany	Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.