Summary

אפיון התנהגותי של מודל עכבר תסמונת אנג'למן

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

כתב יד זה מציג סדרה של מבחנים התנהגותיים הניתנים לשחזור כדי לאמת מודל עכבר של תסמונת אנג’למן.

Abstract

כתב יד זה מתאר סוללה של מבחנים התנהגותיים הזמינים כדי לאפיין פנוטיפים דמויי תסמונת אנג’למן (AS) במודל מוריני מבוסס של AS. אנו משתמשים בפרדיגמת הלמידה של רוטרוד, ניתוח הליכה מפורט ומבחן בניית קן כדי לזהות ולאפיין ליקויים מוטוריים של בעלי חיים. אנו בודקים רגשנות של בעלי חיים בשדה הפתוח ובמבחני מבוך מוגבהים פלוס, כמו גם את ההשפעה במבחן מתלה הזנב. כאשר עכברי AS נבדקים במבחן השדה הפתוח, יש לפרש את התוצאות בזהירות, שכן תפקוד מוטורי לקוי משפיע על התנהגות העכבר במבוך ומשנה את ציוני הפעילות.

יכולת השחזור והיעילות של המבחנים ההתנהגותיים המוצגים כבר אומתו במספר קווי עכבר עצמאיים של Uba3a עם גרסאות נוקאאוט שונות, וביססו קבוצה זו של בדיקות ככלי אימות מצוין במחקר AS. מודלים עם המבנה הרלוונטי ותוקף הפנים יצדיקו חקירות נוספות כדי להבהיר את הפתופיזיולוגיה של המחלה ולהעניק פיתוח של טיפולים סיבתיים.

Introduction

תסמונת אנג’למן (AS) היא מחלה נוירו-התפתחותית נדירה. המקור הגנטי הנפוץ ביותר של AS הוא מחיקה גדולה של אזור 15q11-q13 של הכרומוזום שמקורו באם, שנמצא בכמעט 74% מהחולים1. מחיקה של אזור זה גורמת לאובדן של UBE3A, הגן הסיבתי העיקרי של AS המקודד E3 ubiquitin ligase. האלל האבהי של הגן UBE3A בתאי עצב מושתק בתהליך המכונה הטבעה. כתוצאה מכך, הטבעה אבהית של הגן מאפשרת ביטוי אימהי בלבד במערכת העצבים המרכזית (CNS)2. לכן, מחיקת גן UBE3A מכרומוזום שמקורו באם מובילה להתפתחות תסמיני AS. בבני אדם, AS מתבטא בסביבות גיל 6 חודשים, עם פיגור התפתחותי שנמשך לאורך כל שלבי ההתפתחות וגורם לתסמינים מתישים חמורים אצל אנשים מושפעים 3,4. תסמיני הליבה של ההפרעה כוללים את הגירעון של מיומנויות מוטוריות עדינות וגסות, כולל הליכה אטקסית קופצנית, ליקוי דיבור חמור ונכות אינטלקטואלית. כ-80% מחולי AS סובלים גם מהפרעות שינה ואפילפסיה. נכון להיום, הטיפול הזמין היחיד הוא תרופות סימפטומטיות, המפחיתות התקפים אפילפטיים ומשפרות את איכות השינה1. לכן, פיתוח מודלים חזקים של בעלי חיים עם פנוטיפים התנהגותיים הניתנים לשחזור לצד ניתוח פנוטיפ מעודן יהיה חיוני כדי להבהיר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של ההפרעה ולגלות תרופות וטיפולים יעילים.

המורכבות של ההפרעה האנושית המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית דורשת מאורגניזמי המודל להיות בעלי גנום, פיזיולוגיה והתנהגות דומים. עכברים פופולריים כאורגניזם מודל בשל מחזור הרבייה הקצר שלהם, גודלם הקטן והקלות היחסית של שינוי DNA. בשנת 1984 הציע פול וילנר שלושה קריטריונים בסיסיים לאימות מודל המחלה: מבנה, פנים ותוקף ניבוי, המשמשים לקביעת ערךהמודל 5. בפשטות, תוקף המבנה משקף את המנגנונים הביולוגיים האחראים להתפתחות ההפרעה, תוקף הפנים משחזר את הסימפטומים שלה, ותוקף הניבוי מתאר את תגובת המודל לתרופות טיפוליות.

כדי לדבוק בעקרונות לעיל, בחרנו באטיולוגיה הגנטית הנפוצה ביותר, מחיקה גדולה של מוקד 15q11.2-13q האימהי כולל הגן UBE3A, כדי ליצור עכברי מודל AS. השתמשנו בטכניקת CRISPR/Cas9 כדי למחוק אזור באורך 76,225 bp המשתרע על פני כל הגן UBE3A, ומקיף הן את רכיבי הקידוד והן את האלמנטים שאינם מקודדים של הגן, בעכברים מרקע C57BL/6N6. לאחר מכן גידלנו את החיות כדי להשיג עכברים הטרוזיגוטיים מסוג UBE3A+/−. לצורך אימות פנים של המודל, השתמשנו בבעלי חיים מצלבים של נקבות UBE3A+/− וזכרים מסוג בר כדי להשיג צאצאי UBE3A+/- (זן בשם C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph ומאוחר יותר הוקצה כ-UBE3A mGenedel/+) ולשלוט בהמלטות. בדקנו את המוטוריקה העדינה והגסה שלהם, את הרגשנות ואת ההשפעה שלהם כדי לשחזר את תסמיני הליבה AS. במאמר קודם הערכנו גם את התפקודים הקוגניטיביים של בעלי החיים, שכן חולי AS סובלים גם מלקות אינטלקטואלית6. עם זאת, לא מצאנו ליקויים קוגניטיביים בעכברי UBE3AmGenedel/+, אולי בגלל גילם הצעיר של בעלי החיים בזמן הבדיקה7. בחינה מאוחרת יותר של בעלי החיים המבוגרים יותר, בסביבות גיל 18 שבועות, גילתה ליקוי בגמישות התנהגותית במהלך למידה היפוכה בפרדיגמת העדפת המקום. עם זאת, המורכבות של הציוד המועסק לניתוח זה דורשת מודול מתודולוגי נפרד והוא אינו נכלל כאן.

המבחנים ההתנהגותיים המוצגים כאן שייכים לכלי הפנוטיפ הנפוצים במחקר גנטי, הודות לערך הניבוי הגבוה שלהם ותוקף המבנה המספיק 8,9,10. השתמשנו בבדיקות אלה כדי לאמת מודל עכברי של AS על ידי סיכום תסמיני הליבה של המחלה האנושית באופן שניתן לשחזר ואינו תלוי בגיל. הרגשנות של החיה הוערכה במבוך פלוס מוגבה ובמבחני שדה פתוחים. שני הניסויים הללו מבוססים על קונפליקט גישה-הימנעות, שבו בעלי חיים חוקרים סביבה חדשה בחיפוש אחר מזון, מחסה או הזדמנויות הזדווגות, ובו בזמן נמנעים ממדורים חרדתיים11. בנוסף, מבחן השדה הפתוח משמש לבדיקת פעילות לוקומוטוריתשל עכבר 8. מבחן מתלה הזנב נמצא בשימוש נרחב במחקר דיכאון כדי לסנן תרופות נוגדות דיכאון חדשות או פנוטיפים דמויי דיכאון במודלים נוקאאוט עכבר12. מבחן זה מעריך את הייאוש שבעלי חיים מפתחים לאורך זמן במצב שאין מנוס ממנו. למידה מוטורית ומאפייני הליכה מפורטים נקבעו על הרוטרוד וב- DigiGait, בהתאמה. סיבולת בעלי חיים על המוט המאיץ מאפיינת את כישורי שיווי המשקל ותיאום התנועה שלו, בעוד ניתוח מפורט של דפוסי הצעדים של העכבר הוא הערכה רגישה של ליקויים עצביים-שריריים הקשורים להפרעות תנועה נוירוגנרטיביות רבות13,14,15. בדיקת גריסת הקן היא חלק מהמתודולוגיה הסטנדרטית לאיתור התנהגות אימפולסיבית במכרסמים, ומכיוון שהיא משתמשת בהתנהגות טבעית של בניית מכרסמים, היא מעידה על רווחת בעל החיים16,17.

גודלן של קבוצות הניסוי היה תוצאה של פשרה כדי לעמוד בדרישות חוק 3R ושימוש יעיל בביצועי הרבייה של המושבות. עם זאת, כדי להשיג כוח סטטיסטי, היו לקבוצות לא פחות מ -10 פרטים, בשל הקמת כמות מספקת של זוגות רבייה. למרבה הצער, ביצועי הרבייה לא תמיד הביאו למספר מספיק של בעלי חיים.

Protocol

כל בעלי החיים והניסויים ששימשו במחקר זה עברו בדיקה אתית ונערכו בהתאם לדירקטיבה האירופית 2010/63/EU. המחקר אושר על ידי הוועדה המרכזית הצ’כית לרווחת בעלי חיים. עכברים שוכנו בכלובים מאווררים בנפרד והוחזקו בטמפרטורה קבועה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס עם מחזור אור / חושך של 12 שעות. העכברים קיבלו צ’או עכבר ומ…

Representative Results

מבוך מוגבה פלוס ומבחני שדה פתוחבדיקות EPM ו- OF משתמשות בנטייה הטבעית של מכרסמים לחקור סביבות חדשות18,19. החקירה נשלטת על ידי קונפליקט גישה-הימנעות, שבו מכרסמים בוחרים בין חקר סביבה חדשה לבין הימנעות מסכנה אפשרית. בעלי חיים חוקרים מקומות לא ידועים בח?…

Discussion

מודלים שנוצרו בזני מורין שונים מאומתים בדרך כלל עם בדיקות של מצב רגשי של בעלי חיים, תפקודים מוטוריים ויכולות קוגניטיביות כדי להקל על השוואה לסימפטומים אנושיים31,32. ליקוי מוטורי במודלים של AS הוא הממצא העקבי ביותר במעבדות, ואחריו מצב רגשי ללא שינוי של מוטנטים …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה הצ’כית למדעים RVO 68378050, LM2018126 המרכז הצ’כי לפנוגנומיקה שסופק על ידי MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (שדרוג המרכז הצ’כי לפנוגנומיה: פיתוח לקראת מחקר תרגום על ידי MEYS ו- ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II by MEYS ו- ESIF), ו- OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (איכות וקיבולת גבוהות יותר למודלים טרנסגניים על ידי MEYS ו- ERDF). בנוסף, מחקר זה קיבל מימון מהארגון הלא ממשלתי “האגודה לריפוי גנטי (ASGENT)”, צ’כיה (https://asgent.org/) והמרכז הצ’כי LM2023036 לפנוגנומיקה המסופקים על ידי משרד החינוך, הנוער והספורט של הרפובליקה הצ’כית.

Materials

Cages, individually ventilated Techniplast
DigiGait Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow Altramion
Rotarod TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE
Reference: BIO-TST5 Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape Medical M, Ltd. P-AIRO1291 The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer – Video Tracking System Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany
Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

Riferimenti

  1. Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
  2. Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
  3. Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
  4. Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman’s syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
  5. Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
  6. Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
  7. Huang, H. -. S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
  8. Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
  9. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Carola, V., D’Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
  12. Yan, H. -. C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -. H., Gao, T. -. M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  13. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
  14. Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
  15. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
  16. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
  17. Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
  18. Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
  19. La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
  20. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
  21. Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
  22. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  23. Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
  24. Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D’Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
  25. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
  26. Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
  27. Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354 (2011).
  28. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  29. Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
  30. Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
  31. Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
  32. Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
  33. Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
  34. File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
  35. Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
  36. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
  37. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
  38. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
  39. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  40. Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
  41. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  42. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  43. Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
  44. Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
  45. Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).

Play Video

Citazione di questo articolo
Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J., Sedlacek, R. Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (200), e65182, doi:10.3791/65182 (2023).

View Video