Summary
在这里，我们展示了如何使用 X 射线计算机断层扫描工具链处理树芯。除了用于某些目的的化学提取外，不需要进一步的物理实验室处理。该工具链可用于生物量估计、获取 MXD/树木年轮宽度数据以及获取定量木材解剖数据。
Abstract
提出了一种 X 射线计算机断层扫描 （CT） 工具链，无需进行劳动密集型表面处理或任何物理样品制备，即可获得树木年轮宽度 （TRW）、最大晚材密度 （MXD）、其他密度参数和定量木材解剖学 （QWA） 数据。这里的重点是分辨率范围从 60 μm 到 4 μm 的增量岩心和扫描程序。定义了应观察木材的三个尺度：（i） 环间尺度，（ii） 环尺度，即树木年轮分析和密度测量尺度，以及 （iii） 解剖尺度，后者接近传统的薄片质量。为每种秤定制设计的样品架都可实现多个增量岩心的高通量扫描。专门开发了一系列软件程序，以有效地处理树芯的三维 X 射线 CT 图像，用于 TRW 和密度测定。这项工作简要解释了 CT 的基本原理，这些原理对于正确理解协议是必需的。该协议是针对树木年代学中常用的一些已知物种提出的。粗略密度估计、TRW 和 MXD 数据以及定量解剖学数据的结合，使我们能够扩大和深化当前对气候重建或树木响应的分析，并进一步发展树木生态学/气候学和考古学领域。
Introduction
木材密度是一个易于测量的变量1，它反映了木材2 的解剖学和化学性质。在对地上生物量进行生物量估算时，木材密度是一个重要的加权变量3,4,5，它与树木的尺寸相乘，并且是表示木材碳含量的因子。木材密度与木材的机械性能密切相关6 并反映了树木的生活史7.
细胞壁密度测量值约为 1500 kg/m³，被认为是相当恒定的8，但也应考虑环内细胞壁密度变化 8,9。木质细胞（通常是针叶树中的管胞、血管、薄壁组织和硬木中的纤维）以不同的方式定向/塑造，这些细胞的细胞壁厚度和管腔大小各不相同10。因此，树木之间、树内（轴向和横向）以及树木年轮内的短时间间隔内的木材密度各不相同11,12。在许多情况下，年轮尺度上的木材密度变化也划定了树木年轮边界13。根据研究目标（图1），木材密度和最终的组织分数被生成，在本文中，根据研究目标（图1），大致分为三类（即三种不同的分辨率尺度）。
环间刻度：通过测量木头片，获得该样品的单个值。这可以通过水浸或几何14 来完成。通过这种方式，可以获得一般的生物量或木材技术变量。为了包括髓到树皮的变化，这些木块可以进一步划分为块，这些块进行手动测量，以获得有关生活史策略的信息15.当切换到低分辨率 X 射线 CT 时，例如在医疗扫描仪17,18 中，可以在许多样本上以有效的方式获得中宽环上的 TRW 数据 18,19,20。这也是可用于评估温带和热带树木从髓到树皮的生物量的量表4,22，分辨率通常范围为50μm至200μm。
环形刻度：木材是过去环境条件的记录器。最广为人知的参数是树木年轮宽度 （TRW），但对于全球温度重建，最大晚材密度 （MXD） 记录被证明是温度22 的更好代表。MXD 是一个易于测量的变量23，是树木年轮最后一个细胞的细胞壁厚度和细胞大小的代理，并且位于树线和北方位置，与季节性气温呈正相关24：夏季越暖和，时间越长，细胞壁木质化就越多，从而增加了这些最后细胞的密度。传统的测量方法（如浸入和几何形状）在确定这种环级密度方面不太准确。之前的一项研究开发了一种工具链，用于在薄切样品上使用 X 射线胶片25。这在林业和后来的古气候学中引发了一场革命15,18，定义了最大晚材密度 （MXD），即通常位于环末端的峰值密度值，作为夏季温度的代理。基本原理是将样品（约 1.2 mm 至 7 mm13）锯切至完全平行于轴向，并将样品放在暴露于 X 射线源的敏感薄膜上。然后，这些射线照相胶片通过光源被读出，该光源检测强度并保存轮廓和年度树木年轮参数。然而，这些工具需要大量的样品制备和手动工作。最近，这已经以更标准化的方式或基于已安装的岩心26开发了用于X射线CT。这里的分辨率范围在 10 μm 到 20 μm 之间。TRW 也在这个尺度上测量，尤其是在处理较小的环时。
解剖尺度：在此尺度（分辨率< 4 μm）下，随着主要解剖特征的可视化并且可以测量其宽度和比例，平均密度水平变得不那么相关。通常，这是通过进行显微切片或高分辨率光学扫描或 μ-CT 扫描来完成的。当需要观察细胞壁的超微结构时，扫描电子显微镜是最常用的方法27。在解剖学尺度上，单个组织部分变得可见，因此可以从图像中得出生理参数。根据单个解剖参数和木材的细胞壁密度，可以得出解剖密度，以便与传统的木材密度估计器进行比较24。
由于改进了切片技术和图像软件 29,30，Dendro-Anatomy 30 已被开发出来，以更准确地记录木材，既能更接近估计针叶树中的 MXD，又能测量阔叶树的几个解剖变量。在这个尺度上，测量了实际的解剖参数并与环境参数相关31 。使用μCT，也可以获得该水平32,33。
由于木材本身具有吸湿性和各向异性，因此需要仔细定义木材密度，并需要指定测量条件，无论是烤箱干燥、调节（通常在 12% 的含水量下）还是绿色（在森林中砍伐）34。对于大样品和技术目的，木材密度定义为在给定条件下的重量除以其体积。然而，木材密度的值很大程度上取决于测量它的尺度，例如，从髓到树皮的木材密度可以翻倍，而在环尺度上（在针叶树中），早木到晚木的过渡也导致木材密度显着增加，在环边界处达到峰值。
在这里，提出了一种增量核心的 X 射线 CT 扫描协议，以便测量上述 3 个尺度的特征（图 1）。由于设置灵活，X 射线 CT 的最新发展可以覆盖这些量表中的大部分。研究目标将决定最终的扫描协议。
一个关键的限制因素（这与木材密度和一般木材的缩放性质有着内在的联系）是扫描所需的分辨率和时间。示例演示了如何：（i） 从刚果盆地获得用于估计 Terminalia superba 生物量的年轮间树间木材密度剖面，（ii） 根据 HECTOR 系统35 上的螺旋扫描从 Clanwilliam 雪松 （Widdringtonia cedarbergensis） 获取密度记录，以及 （iii） 在 Nanowood 系统上测量无柄橡树的容器参数。这两款扫描仪都是 UGent X 射线断层扫描中心（UGCT、
图 1：X 射线 CT 扫描的一般方法决策树。 这些行表示要采取的步骤，从研究目标开始，一直到最终的数据格式。白框是与此工具链相关的步骤。灰色框是可以使用其他软件或 R 包执行的步骤，例如用于树木年轮分析的 dplr47 和 Treeclim48 ，以及 ROXAS44 以及 ImageJ42 或其他（商业）应用程序，用于根据 CT 图像导出木材解剖参数。 请点击这里查看此图的较大版本.
木材的X-CT研究
扫描仪的设置：标准 X 射线 CT 扫描仪由一个 X 射线管、一个 X 射线探测器、一个旋转台和一组电机组成，用于来回移动旋转台，在大多数情况下还包括探测器（图 2）。
图2.HECTOR扫描系统。 系统35，显示源探测器距离（SDD）和源物体距离（SOD）。 请点击这里查看此图的较大版本.
大多数基于实验室的系统都具有锥形束几何形状，这意味着产生的 X 射线以锥形束形状从管子的出射窗分布，这意味着通过改变物体与管之间的距离（SOD = 源-物体-距离）以及探测器与管之间的距离（SDD = 源-探测器-距离），可以控制放大倍率（参见关于分辨率的讨论）。由于 X 射线的穿透力，它们会穿过物体，衰减束的强度是 X 射线束的能量、物体的化学成分（存在的元素的原子序数）和材料密度的函数。鉴于木材具有恒定的能谱和恒定的材料成分，X射线束的衰减在很大程度上取决于材料的密度，这解释了其在密度测定中的用途。衰减（或传输）可以用 Beer-Lambert 定律表示：
当 I0 时，入射的 X 射线束呈指数增长，当穿过材料传播一段距离 d 时，它会衰减为透射的 X 射线束 Id。线性衰减系数μ取决于与物体材料的一系列相互作用。因此，投影是传输光束的记录。
实际上，将物体安装在旋转台上，选择适当的 SOD 和 SDD，选择一定的功率（与物体大小、密度和成分有关），并且物体旋转 360°，在旋转过程中进行多次投影。然后，这些投影用于重建物体的内部结构。有几种可用的重建算法，其中使用最多的仍然是基于几十年前开发的分析框架，依赖于Radon变换和傅里叶切片定理。有关更多详细信息，请向读者参考专业文献36。
分辨率、数据量和样本量的难题：分辨率是 X 射线 CT 扫描的关键。在具有逆几何形状或平行光束几何形状（如同步辐射光束线）的系统中，其他考虑因素也起作用。该协议仅讨论具有锥形束几何形状的标准基于实验室的 X 射线 CT 扫描。在这里，放大倍率、探测器像素大小和光斑大小的概念是必不可少的。放大倍率定义为 SDD/SOD 的比率。其次，探测器的像素大小显然也会影响分辨率：像素尺寸越小，分辨率越高，但在大多数情况下，视场（FoV）也与像素大小和探测器的大小直接相关（像素尺寸越小，相同像素数量的FoV越小）。此外，X射线束的光斑尺寸也很重要：光斑尺寸越大，分辨率越低，这意味着可以看到的细节较少。
重要的是要解决一个问题，即可以获得的分辨率高于根据上述限制可能获得的分辨率，因此最好使用术语体素大小（体素是体积像素）而不是分辨率。此外，还有其他因素在起作用，例如探测器的锐度，这进一步限制了扫描物体的真实分辨率。只有使用既定目标对系统进行真正的校准，才能提供真实的答案。
但是，在大多数情况下，可以扫描对象的体素大小主要受对象大小的限制。这意味着对象越大，体素大小就越小。如果物体在一定的体素大小下不适合探测器的FoV，则可以减小体素大小，例如，通过限制放大倍率。
在确定所需的体素大小时，扫描时间和数据量是重要的考虑因素。一般来说，体素越小意味着想要看到的细节越高，样本越小或一次可以扫描的样本越少，需要更多的时间，收集的数据量也就越大。想象一下以下理论示例：可以使用某个 X 射线 CT 系统一次扫描 10 cm x 10 cm x 10 cm 的样品，距离为 50 μm，并希望扫描 10 μm 的相同体积，适合 FoV 的体积仅为 2 cm x 2 cm x 2 cm， 假设这在物理上是可行的。这意味着需要 125 次扫描（5³ = 5 倍高分辨率，由于成像技术的体积特性，缩放到 3 的次方）才能覆盖整个体积，并且数据量也会同样增加。当然，这只是一个思想实验，人们需要考虑的不仅仅是分辨率。有关更多信息，请读者参阅扫描可能性的概述37。
用于扫描木制物体的仪器的灵活性：在过去的十年中，许多公司都提供了与 HECTOR35 组件相似的 X 射线 CT 系统。38 概述了几种 CT 系统，特别是对其时间分辨率的评估。
总而言之，X 射线 CT 系统的灵活性和用户友好性有了很大的提高。许多系统允许扫描各种物体，UGCT的系统也是如此。以下协议针对HECTOR系统进行了演示，该系统适用于树木年轮分析。但是，如果分辨率和数据格式允许，则该协议对任何其他可用系统都有效。
这些系统允许扫描各种物体。 图3给出了使用HECTOR系统扫描的不同木制物体的几张图片。正是这种灵活性构成了我们在 图 1 中展示的三种尺度，范围从粗略的分辨率到非常精细的分辨率。
图3.扫描设置示例。 （A） 一根日志，（B） 一把大提琴49，（C） 样品架（1 型），带有用于批量扫描的树形岩心，以及 （D） 样品架 2 型，带有用于螺旋扫描的增量岩心，安装在 HECTOR 的旋转台上。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Protocol
1. 岩心取样
- 用 Pressler 蛀虫对树进行取样。查阅有关如何手动对树进行取芯的参考资料39.该工具链适用于 5.15 mm 核心。
- 将解开胶水的树芯放入 6 毫米纸吸管或任何其他不需要胶水的接收器中。不要将树芯粘在木支架上。如果芯子已经安装好，请根据胶水类型用手术刀/锯子或溶剂卸载它们。
- 避免将它们包裹在塑料管中，先尝试将它们晾干，以避免霉菌生长和真菌腐烂。
- 用铅笔在纸吸管上写字，因为提取可能会使记号笔文字褪色。
注意：此工具链也适用于 4 mm 核心。可以使用已安装和打磨的磁芯，但需要先卸载这些磁芯。对于考古木材或残余木材，需要制作芯大小的样品（通过锯切/减小尺寸）进行扫描。
2. 扫描前的岩心准备
- 进行乙醇/甲苯或乙醇或丙酮40索氏提取至少24小时（图4A，B）。这对于确保无树脂木材体积以获得准确的密度计算是必要的（树脂衰减信号，图4C13,41）。
- 将 1000 mL 乙醇与 427 mL 甲苯（例如，根据 ASTM D 1107 - 96）或纯乙醇或丙酮制成溶液。许多大学都有一个实验室玻璃车间，可以制作用于树芯的索氏仪器的改编版本（图4B）。
- 用溶剂填充圆底烧瓶，并将样品放入吸管中，该吸管位于Soxhlet装置的不锈钢支架中，该装置在实验室加热器上带有冷却器。每小时至少允许 6 次虹吸。
注意： 封闭的水回路最好用于冷却（或任何其他现代冷却系统）。在这种情况下，水泵以 120 升/小时的速度循环储存在装有氯片的 100 升盆中的水（以避免藻类生长）（但这将取决于索氏装置的大小以及热元件施加的热量）。空气冷却器用于冷却 100 L 盆中的水。为了节省溶剂，可以使用玻璃珠来填充索氏装置的空隙体积。 - 定期检查温度和虹吸管数量。在化学罩下干燥岩芯（请查看实验室政策）以去除溶剂残留物，或将干燥箱放在化学罩下。
- 在排气通风下，在干燥炉（103.5°C）中干燥岩心24小时，并如上所述进行热水浴（90°C）或热水索氏提取24小时。
- 将样品保存在钢制样品架的纸吸管中。在103.5°C的干燥烤箱中再次干燥24小时，然后在扫描前调节至60%相对湿度（RH）。
注意：在这种情况下选择 60% 的值，因为这些大约是 X 射线 CT 扫描室中的环境平均相对湿度条件。也可以使用烤箱干燥的样品。最重要的因素是所有样品都是在相同的条件下扫描的。 - 如果抽水使纸吸管变性，请将树芯放回新的 6 毫米纸吸管21 中。5.15 mm 和 4 mm 纤芯都可以放入 6 mm 纸吸管中。
- 确保整个纸吸管都装满了木头。将两个稻草末端包裹起来，然后切开末端。这使得吸管可以很容易地插入圆柱形支架中。
- 确保形成层（树皮）侧在核心上清楚地指示，因为 CoreProcessor 和 RingIndicator 假设树皮侧朝下。移除零碎物以及有裂纹的芯子，因为这些很难处理。
- 将样品保存在钢制样品架的纸吸管中。在103.5°C的干燥烤箱中再次干燥24小时，然后在扫描前调节至60%相对湿度（RH）。
图4.在扫描之前提取和干燥岩心的工作流程。 （A） 首先将纸吸管中的增量芯放入热水浴中，然后用索氏装置放入热乙醇-甲苯混合物中 24 小时，然后干燥，放入热水浴中 24 小时，然后在 103.5 °C 下再次干燥，然后在扫描前进行调节。（B） 根特大学改编的索氏装置的图像。多个适配的索氏装置串行连接。注意铝箔和绝缘管，以保持溶剂或溶剂混合物足够温暖以进行提取。（C） 长叶松（Pinus longaeva ）提取前后的增量核心表面示例。由于 X 射线的衰减，树脂和其他提取物会掩盖真实的密度信号。 请点击这里查看此图的较大版本.
3. 岩心扫描
- 根据图1中所述的研究目的，选择适当的样品架类型（图5），如下所述。
- 对于环间刻度目的，请使用支架类型 1 - 纸板和穿孔花卉泡沫。
- 对于 MXD 数据，使用 2 型支架 - 一种塑料样品架，可容纳 6 个长度为 1-15 厘米、直径为 3 厘米的岩芯。
- 使用支架类型 3 - 用于树解剖学目的，包括简单地将纸吸管绑在一起。
- 将纸吸管中的树芯装入样品架中，并填写可在 https://dendrochronomics.ugent.be/#software 上下载的电子表格模板。每个数字对应于样品架中的给定位置。
- 在 X 射线 μCT 设施中扫描：请咨询 X 射线 CT 专家，了解正确的设置和扫描协议。有关此协议中使用的扫描仪，请参阅37。
- 扫描图像的重建：请咨询 X 射线 CT 专家，了解重建的正确设置，或 CT 扫描仪（X 射线 CT 扫描仪的软件包）附带的设置。有关此协议的重建参数，请参见37。
图5.样品架类型和分辨率。 三种主要支架类型的设计，分别对应于（A）年轮间尺度、（B）树轮尺度和（C）解剖学尺度。由于由此产生的尺寸，样本数量随着分辨率要求的增加而减少。（D）环间刻度（支架1）、（E）环宽度和MXD（支架类型2）和（F）解剖参数（支架类型3）的相应3D渲染。比例尺 = 5 mm. 请点击这里查看此图的较大版本.
4. 获取TRW数据、密度数据和解剖数据
- 软件入门。
- 要获取密度值（支架类型 1 和 2），请从以下三个软件包安装：（i） CoreProcessor、（ii） RingIndicator 和 （iii） CoreComparison 工具箱
- 由于这些工具箱是在MATLAB中制作的，因此请安装正确的MATLAB编译器运行时（MCR），该工具可在以下位置获得：http://nl.mathworks.com/products/compiler/mcr/。当前需要的版本是 MATLAB2022B。MCR 是免费的，就像 3 个软件包一样。
- 在重建卷的文件夹旁边，为 MAT 文件（MATLAB 中的一种存储变量等的文件格式）创建一个新的空文件夹，例如，matfiles_useful_name_sample_holder，这是存储临时参数所必需的。
- 确保电子表格位于重建卷的文件夹中，以便在后续步骤中填充样本。
- 使用 CoreProcessor 预处理核心卷。
注意：对于高分辨率解剖数据，不需要执行以下处理步骤（图1），一旦重建的体积可用，请参阅 ImageJ 的 3D 图像指南42.可以通过 Weka 插件进行分割43 例如，用于指示单个切片上的容器12，或在 ROXAS 等软件插件中44.- 准备岩心提取：如下所述，准备增量核的自动提取（取决于环间刻度 图6A 或环形刻度 图6B）。
- 选择包含重建文件（16 位横截面 TIFF 切片）和电子表格文件 （XrayForm.xlsx） 的文件夹。
- 从 4.1.3 中选择空文件夹。这是 CoreProcessor 将创建将在 4.2.2 中使用的 MAT 文件的文件夹。用于大规模岩心提取。
- 选择新创建的空 MAT 文件夹，如果未创建，请选择任何其他文件夹。加载体积，并出现圆柱体的纵向横截面，检查几个水平切片，以确保所有核心和参考是否都正确安装到圆柱体中。
- 从下到上单击以选择切片进行评估。这些横截面将用于下一步，因此请在整个长度上单击。指示深色（空气）和白色引用（图 6），与电子表格文件中指示的次数相同。每次选择后双击。
- 对于样品架 1，检查通过参考材料生成的具有 9 个横截面的多屏，以检查密度计算是否在木材上进行（而不是在纸吸管或其他非木材上）。这对于正确转换为实际木材密度值至关重要。
- 在新的弹出窗口中，通过在每个核心周围绘制一个圆圈/椭圆来单独选择每个核心。根据电子表格文件中的信息进行标签标记，检查名称是否正确。请遵循模板的填充顺序。所有信息都存储在 MAT 文件中，该文件将在下一步中用于一次提取所有内核。
- 如果元数据和电子表格文件位于同一文件夹中，请单击 “质量岩心提取”（Mass Core Extraction ），对给定圆柱体中的所有岩心执行岩心提取（在 4.2.1.2 中指示）。
注意：使用批量磁芯提取时，将根据用户的标签（存储在垫子文件夹中）提取所有磁芯。此操作的结果，将创建一个名为 Extracted 的新文件夹，其中包含所有单独的内核。当第一步准备了多个样品架，并且所有MAT文件都存储在同一个文件夹中时，该文件夹中的所有MAT文件都将被处理。 - 在CoreProcessor工具箱中，单击 Manual Tg Correction，然后选择 Extracted 文件夹，以确保每个核心体积的横向和径向平面方向正确，类似于在打磨之前将物理样品安装在样品架中，保持横向平面在视野中（图7B）。
- 显示一些横截面，以便用户可以看到晶粒方向。在最后一个图（右下角）中，检查显示的切片并绘制一条线来指示颗粒方向。双击可自动旋转核心。
- 然后出现一个屏幕，这里裁剪了核心的体积（图7C），确保矩形包含了整个核心直径。这是必要的，因为矩形的中心点应尽可能靠近核心轴（以便在 RingIndicator 模块中正确对齐）。
注意：如果以高分辨率扫描，请在此阶段仅选择核心内的材料，并使用转换器切换到样品架类型 2。例如，这对于环状多孔物种肯定是有帮助的。
- 如果磁芯未对齐、翻转或损坏或图像格式不兼容，请执行以下可选步骤。
- 岩心倾斜校正（仅适用于样品架 1）：自动校正岩心倾斜（例如，当岩心在圆柱体中略微倾斜时; 图7A）。这对于后续步骤很重要。选择在上一步中创建的 Extracted 文件夹。
注意：如果您有 2 型或 3 型样品架（图 5）或所有样品架和样品架完全直立放置，则通常不需要这样做。 - 翻转体积：如果样品没有在树皮面朝下放置（髓-树皮方向不是从左到右），则通过翻转岩心来改变方向。该函数请求一个文件夹，并将创建一个新文件夹。
- 胶合芯线：将单个芯的大部分虚拟缝合在一起。这个想法不是要完美地拼接，而是要确保，如果需要，单核位于同一多页 TIFF 卷中。使用断芯指示（参见步骤 4.3.4.9）来克服芯件之间的空隙。
- 转换器：如果卷已在另一个软件包中作并保存在工具箱（例如 ImageJ）之外，请执行此步骤以获得正确的标题信息。对于来自另一个 CT 扫描仪的 16 位多页 TIFF 卷，以及使用 RingIndicator 工具箱，请使用此步骤。
注意：从这里开始的所有步骤都用于结构方向校正，最后是密度测定和树木年轮分析。
- 岩心倾斜校正（仅适用于样品架 1）：自动校正岩心倾斜（例如，当岩心在圆柱体中略微倾斜时; 图7A）。这对于后续步骤很重要。选择在上一步中创建的 Extracted 文件夹。
- 准备岩心提取：如下所述，准备增量核的自动提取（取决于环间刻度 图6A 或环形刻度 图6B）。
- 在 RingIndicator 中校正角度并指示环。
注意：在 RingIndicator 模块中，需要按时间顺序执行以下步骤：（i） 横向和径向平面的可视化，（ii） 结构校正，（iii） 创建密度分布，以及 （iv） 手动或半自动指示环。- 如下所述执行横向和径向平面的可视化。
- 要熟悉 GUI，请打开工具箱并选择一个多页 TIFF 文件 （在提取后和 tg 更正后创建的文件，因此从文件夹名称 Tg 更正后创建的文件）。
- 选择“ 切片图像的半厚度 ”以显示中心X切片的平均图像，X的范围为1-10，其中1表示不平均（即仅显示中心切片），10表示10个中心切片的平均图像。
注意：平均法有助于更好地突出环形边界并抑制噪声，另一方面，它也可以使环形边界看起来不那么清晰，尤其是当光纤角度很大时。请根据需要调整此值。值得一提的是，这仅用于显示，它不会影响基础交易量，也不会影响最终的计算/结果。 - 检查图形用户界面 （GUI）。GUI 包含一个顶部图形（带有磁芯的横向平面）和一个底部图形（带有磁芯的径向平面）和一个菜单（图 8）。
- 要加载新的核心卷，请搜索 Volume > Load Volume 函数以在目录中选择新的多页 TIFF 文件 。现在，用户已准备好指示结构方向，以便随后指示实际的树木年轮。
- 结构校正，便于自动显示树木年轮指示。
- 手动单击图像以插入绿色条以进行结构校正。从髓（或可用的最古老的环）开始，到最近的环结束。沿核心校正横向和径向平面上的结构偏差。
- 确保正确指示环和光纤角度，因为所有后续指示都将在各自指示之间采用插值角度。
- 在一个平面上插入一个绿色条，它将在另一个平面上自动生成一个。插入条形图后，移动条形图末端的节点（白色方块）以改变角度。使用中间节点更改柱线位置。调整节点的大小以方便使用。
- 每一步之后，请确保按“ 数据”>“导出”和“振铃”>“导出振铃”，以确保将振铃和光纤指示写入正确的.txt文件。在所有更正过程中，请确保始终执行这两个操作。
- 计算密度分布。
- 使用 密度测定>密度测定图 来计算密度分布。通过选择“ 叠加绘图”>“绘制密度分布”来创建和绘制密度分布图，该分布图可用作核心平面上的叠加层。
- 对于 MXD 计算，请指示一个百分比（建议为 20%，例如，20% 表示仅包含最高密度值的 20%），以排除树脂管道、早木等的较低值。对于平均密度值，请使用 100%。对于最小密度，也使用 100%。
- 如下所述，使用每个环的一次鼠标左键单击来执行手动和/或自动指示环边界。
注意：插入与步骤 4.3.2.1 中相同的绿色条，这次用户现在应按铃声 （图9).- 使用 “叠加绘图”>“绘制密度分布”，可以在图像上可视化密度分布。最好也与此剖面图一起指示环边界。
注意：根据需要，结合 CoreComparison 工具箱，从工具箱中打开任意数量的实例（详见）。 - 对于自动指示（例如，建议用于针叶树），请使用自动>最大值/最小值/拐点检测。此功能将根据上一步中创建的密度测量曲线自动指示树木年轮边界。对于自动指示（最适合北方针叶树或由密度分布定义的清晰环边界的物种），请使用自动>最大值/最小值/拐点检测。此功能将根据上一步中创建的密度测量曲线自动指示树木年轮边界。
- 根据树种（弥散多孔/环多孔或针叶树），使用最大值/最小值或曲线拐点（紧接在密度峰值之后）作为树木年轮边界标准。第一个参数是峰值函数的阈值，第二个参数是更平滑的函数。
- 执行自动环形指示后，执行自动移动（窗口大小为 1 像素和用户定义的迭代），同时确保没有由于此移动而相互绘制环形指示，并重新运行密度测量图。
- 将采伐日期更改为在活树上采伐增量岩芯的年份或任何其他合适的日期。默认值设置为 1900。
- 在 “叠加绘图”中，选择 “绘图环 ”，将显示年份。此外，选择要在其上绘制环和/或密度分布的平面。
- 一旦有两个核心完全指示（例如来自同一棵树），通过打开 CoreComparison 工具箱对核心环宽度曲线进行成对比较。为每个核心打开一个 RingIndicator 实例，并在必要时编辑指示。再次导出它们，并采用这种迭代和交互式方法，以获得高质量的数据。在下一步（步骤 4.4.1）中，对所有内核执行此操作，以导出 TRW 数据和相应的密度值。
- 在 “环”>“检查环 ”选项中检查双环位置;这将检查是否有任何指示位于图像之外的位置以及重叠的环，例如，如果在同一位置上两次双击。
- 对于有零碎的破碎型芯，从髓开始，将异常（破碎的型芯产生的空气、树脂口袋、污染和腐烂的部件）划定为异常，就好像它们是环一样，然后删除它们。以最后形成的年轮的树轮边界结束，并导出数据。在采样过程中尽量避免断芯（参见步骤 1.1 和39）。
注意： 可以指示丢失和破损的环，请参阅 图 10。定义了两种情况，一种是核心在环的中间断裂，另一种是核心在环边界上断裂。对于第一个（图10A），指出差距，记下该差距的数量，然后是数字1，然后关闭括号。然后，程序将对环的两个部分求和，以获得正确的 TRW 值。在第二种情况下，间隙数字后跟数字 2，程序将省略此部分（图 10B）。 - 通过指示环和生成密度分布，可以创建多个.txt文件并将其存储在与多页 TIFF 文件相同的文件夹中， 表 1 中列出了最重要的文件。将这些.txt文件与 TIFF 图像放在同一文件夹中，以便在 CoreComparison 模块中进一步处理它们（步骤 5.4）。
注意：要根据原始密度分布以不同的方式计算密度值（例如，晚材宽度与早材材宽度45 或 CoreComparison 和 CoreProcessor 工具箱不支持的其他指标），请使用 zpos_corr 和 density_corr文本文件，并使用它们进行此类计算。
- 使用 “叠加绘图”>“绘制密度分布”，可以在图像上可视化密度分布。最好也与此剖面图一起指示环边界。
- 如下所述执行横向和径向平面的可视化。
- 要比较TRW系列并通过CoreComparison导出数据，请按照以下步骤操作。
注意：使用此工具箱时，将同时打开两个窗口，即 CoreComparison 和 PatternMatching 模块。CoreComparison 处理 TRW 数据的交叉测年和导出，而 PatternMatching 模块可用于导出密度分布和密度值（MXD、最小密度 （MND）、平均密度和 4 个四分位数值）。CoreComparison 的主要目标是生成 TRW 值和密度值，并粗略估计交叉测年质量，并在缺少环或错误指示的情况下与 RindIndicator 耦合。- 执行以下步骤以交叉约会或将环宽图案与其他系列匹配。
- 完成 RingIndicator 部分后，选择要比较的文本文件，将打开一个屏幕，其中包含环的宽度，以及交叉测年或统计参数，例如 Gleichlaüfigkeit （GLK）46 和/或各个序列之间的 Spearman 相关性（图 11）。
- 要更改环指示（例如在交叉测年期间），请重新打开 RingIndicator，导入数据，导出修改后的数据和环，并使用 CoreComparison 模块中的 刷新 按钮（见左上角）查看更改。
- 打开多个 RingIndicator 实例以更改不同的树轮系列，并使用多个屏幕监视器执行此操作。
- 在 GLK 和 CORR 菜单（图 11）中，执行一系列与 GLK 相关的操作，例如对数字设置阈值、将 GLK 值导出到电子表格并对其进行排序。
- 从 CoreComparison 中获取 TRW 值，如下所述。
- 使用 CoreComparison 中的绘图和导出功能来更改曲线之间的偏移量（值越大，偏移量越小）。通过选择 “绘图”（Plotting） 并导出“环>宽”（Ring width），在绘图中可视化 TRW 数据。
- 通过单击 “绘图和导出”>导出 RW 数据来导出 TRW 数据。以电子表格格式或图森格式导出环宽。
- 从 PatternMatching 模块获取密度分布，如下所述。
- 要在电子表格中获取密度分布，请转到 PatternMatching 模块，在加载分布后，在菜单中的 其他 选择 绘图 > 导出校正的密度分布。
- 要批处理配置文件或使用不同的方法评估数据，请直接使用 表 1 中的.txt文件（请参阅步骤 4.3.4.11）。
- 从 PatternMatching 模块获取 MXD、MND 和其他密度值，如下所述。
- 要获取每个树木年轮的平均密度、MXD、MND 和四分位数数据，请使用 其他绘图>导出聚类数据。将生成一个电子表格，并且可以在与 TIFF 文件相同的文件夹中找到。
- 表 2 中详细介绍了电子表格中的选项卡。将这些树木年轮变量导出到 Rstudio 或其他软件以进行进一步分析。
- 执行以下步骤以交叉约会或将环宽图案与其他系列匹配。
图6.从灰度值中获取木材密度值。 通过使用参考材料进行校准，将图像的灰度值转换为实际的木材密度估计值。（A） 样品架 1，分辨率为 60 μm，显示空气参比、白色参比和核心。（B） 20 μm、空气、参比样品架和核心样品架也如图所示。 请点击这里查看此图的较大版本.
图7.3D 核心体积的预处理步骤。 在可视化和指示树木年轮之前，对 3D 岩心体积进行预处理步骤。（A）倾斜（轴向）校正，（B）切向校正，用灰色条表示纤维方向，（C）裁剪芯体积，得到只有木质体素的体积。 请点击这里查看此图的较大版本.
图8.核心的屏幕截图。 在 RingIndicator 工具箱中打开的磁芯（切向宽度约为 3 mm，分辨率 μm）的屏幕截图。顶部窗格是横向视图，底部窗格是径向视图。绿色条表示结构指示（在本例中为环形边界），红线表示密度分布。黄色数字表示日历年，蓝色数字表示通用环号（从第一个指示开始计算）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 9.RingIndicator 模块中的环指示和密度分布可视化。 绿线是指示，红线是木材密度分布。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 10.如何处理芯部的裂纹。 （A）当环中间出现裂纹时，将通用环数（从髓开始）标记为间隙，并通过将两个环部分的宽度相加来计算TRW。参数为 3（环的数量）和 1（情况 1：环中间的裂纹）31。（B） 当环形边界处出现裂纹时，该裂隙将从TRW计算中省略。参数为 3（环数）和 2（情况 2：环边界处的裂纹）31。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 11.“核心比较”模块的屏幕截图。 Core Comparison模块的屏幕截图，其中环宽系列垂直分布，以便于视觉比较。顶部窗格显示 Fagus sylvatica 的 4 个核心的环宽，左下窗格显示 Gleichlaüfigkeit （GLK），右下窗格显示 Spearman 相关系数。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 文件名 | 解释 | ||
| SAMPLENAME_density.txt | 图像整个长度的未校正密度值，因此未校正环形和纤维角 | ||
| SAMPLENAME _density_corr.txt | 参见前面的 txt，但随后使用更正的密度值 | ||
| SAMPLENAME _ring-and-fibre.txt | 环形和光纤指示位置和角度 | ||
| SAMPLENAME _zpos.txt | 树轮边界在岩心上的位置，无需年轮和纤维校正 | ||
| SAMPLENAME _zpos.corr.txt | 同上为 ZPOS，但随后针对环和纤维角度进行了校正 | ||
| SAMPLENAME _ringwidth.txt | 计算环宽，考虑环和纤维角度 | ||
表 1.由 RingIndicator 生成的文本文件。 在 RingIndicator 中指示环并导出密度分布后生成的文本文件列表。它们应与.tiff文件保留在同一文件夹中，以便在 CoreComparison 模块中打开。
| 树木年轮变量 | 解释 | ||
| 平均密度 | 每个树木年轮的平均密度 | ||
| 最大密度半基 | MXD，但仅基于树的后半部分年轮，以避免上一年的高密度值不包括在内 | ||
| 最小密度 | 每个树木年轮的最小密度 | ||
| Q1-Q4 | 年内年轮剖面的每个四分位数的平均值和最大值 | ||
表 2.电子表格详细信息。 导出到名为“导出聚集数据”的电子表格中的树环变量。
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Representative Results
如果目标是许多样品的生物量估计或树木生长增量，即环间尺度（图1），则使用样品架1（图5）扫描样品以获得密度分布（参见步骤5.4.3）和树木生长的估计，例如，对于具有大TRW的快速生长的树木，这允许更粗糙的分辨率。 图 12 显示了来自刚果盆地的 T. superba 的髓到树皮和轴向密度趋势的示例。这些图表基于在茎的不同高度位置拍摄的树增量核心的 110 μm 扫描。
对于通过使用样品架 2（图 5B）扫描岩心来定位的环形尺度（图 1），可以进行树轮分析和 MXD 计算。这方面的一个例子是图 13，其中绘制了来自南非 Cedarberg 山脉的 W. cedarbergensis 岩心的最小密度（在本例中与雨季降水有关）和最大密度年表26。这是基于以 10 μm 分辨率扫描已安装的岩心。
对于解剖学尺度（图1），使用支架3扫描岩心，即将纸吸管包裹在一起的多个岩心，分辨率可达4μm。结果如图 14 所示，其中显示了橡树 （Q. robur） 的 X 射线 CT 图像切片，将早木和晚木容器分割开来。
图 12.径向和轴向木材密度趋势。（A） 刚果盆地（DRC）46棵桫椤树的干材密度（kg/m3）径向变化，最小值（最小值）、平均值和最大值（最大值），原始剖面（红色）叠加在一起。（B） 单棵桫椤的径向变化和轴向变化，其中在每 1 m 的高度间隔处采集并扫描一个增量岩心（共 23 个岩心）。从髓到树皮的密度呈增加趋势（根据颜色条突出显示），上部茎的木材密度较高。扫描分辨率 = 110 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 13.年表发展。 最小密度和最大晚木密度年表，来自 Widdringtonia cedarbergensis。数据摘自26.扫描分辨率为 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 14.橡木样品的高分辨率扫描。 在 4 μm 处扫描的 Quercus robur 上橡树容器的分割示例。使用Octopus分析软件进行分割，使用双边滤波、阈值、一系列二元收缩和扩展操作、欧几里得距离变换，最后对船只进行标记。颜色代表容器大小，范围从小（深蓝色）到大（深橙色）。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
协议中的关键步骤
该协议中的关键步骤包括正确处理增量钻孔器以获得高质量的增量核心（步骤1.1.和参见39），以避免零碎。接下来，必须保持芯部未安装（但见26），以便插入样品架（图 5，见21），以及用于正确提取树脂50 和可能的未来分析。在扫描之前（步骤 2.2.2.），在扫描室中对样品进行调节对于避免由于湿度波动而导致的尺寸变形至关重要。然后，一旦可以在 RingIndicator 模块中指示环，就必须很好地指示环的边界和角度，因为密度峰值可能会变平，类似于经典密度测量系统13 上的不准确指示。该指示对于获得正确的环宽测量值也很重要21.下一个关键步骤是通过 CoreComparison 模块进行正确的交叉约会（步骤 4.4.1）。如果某些磁芯的指示错误，则可能会丢失环境信号51。
技术的修改和故障排除
请注意，在CoreProcessor模块中将数据转换为适当的分辨率后，工具箱RingIndicator和CoreComparison也可用于平板图像52 。因此，需要将DICOM格式（用于医疗目的的通用格式，也用于木材样品53）转换为.tiff。拥有医疗CT扫描仪的科室只能将该软件用于分辨率约为200μm的1型环间刻度分析类型。
该技术的局限性
该方法的缺点是只有少数工具可用于扫描树木年轮尺度和解剖尺度（需要更高的分辨率）。对于较大的数据量和数据处理量来说，可能具有挑战性54.对于非常高分辨率的木材解剖图像（例如，进一步阐明凹坑结构等），请参阅使用显微切片进行经典透射光显微镜27、扫描电子显微镜或共聚焦显微镜55的经典程序。
与现有方法相比的重要性
使用此处介绍的增量岩心的 X 射线 CT 工具链已经过测试，由于校准步骤（图 6）56 ，显示出可靠的密度值，并生成与现有密度测量程序相当的 MXD 值13。
该技术的未来应用
该技术的任何未来应用都可能包括深度学习的应用，其中包括用于自动环形指示和木材组织量化57，特别是3D图像。
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Disclosures
作者没有要披露的利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢三位匿名审稿人的反馈和建议。本研究由JVdB BOF专项研究基金（BOF Starting Grant BOF.STG.2018.0007.01），将UGCT作为专业中心（BOF.EXP.2017.0007）和作为核心设施（BOF.COR.2022.008），作者还感谢法兰德斯研究基金会（G019521N和G009720N）和UGent工业研究基金（IOF）通过赠款IOF对基础设施的财政支持。APP.2021.0005（项目FaCT F2021/IOF-Equip/021）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 mm paper straws | http://artstraws.com/education/product/artstraws-thick-asst-cols/ | Coring | |
| Aluminium core holders | |||
| ASTM standard ASTM D 1107 – 96 | |||
| Cardboard postal tubes | https://www.rajapack.co.uk/envelopes-mailing-bags/postal-tubes/1-5-2mm-brown-cardboard-postal-tubes_PDT05623.html | ||
| Column drill | |||
| Computer hardware for reconstruction and analysis | X-ray CT scanning | ||
| Cooling | |||
| Drying oven | |||
| Ethanol | |||
| Flask for under soxhlet (2000 ml) | |||
| Floral foam | https://www.oasisfloral.eu/ | Sample holder type 1 | |
| Glass beads to fill void volume of Soxhlet to save solvent | |||
| Glue | |||
| Hot water bath | https://www.memmert.com/products/water-baths/water-bath/#!filters=%7B%7D | Soxhlet extraction | |
| Increment borer | https://haglofsweden.com/project/increment-borers/ | ||
| Plastic cylinder | Moonen et al. 2022 | Sample holder type 2 | |
| Plastic cylinders | |||
| Reservoir | |||
| Tailored soxhlet apparatus | |||
| Toluene | |||
| Water pump | |||
| X-ray CT scanner |
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