Summary
ここでは、X線CTツールチェーンを使用してツリーコアを処理する方法を示します。一部の目的での化学的抽出を除き、それ以上の物理的な実験室での治療は必要ありません。このツールチェーンは、バイオマスの推定、MXD/年輪幅データの取得、および定量的な木材解剖学的データの取得に使用できます。
Abstract
X線コンピュータ断層撮影(CT)ツールチェーンは、年輪幅(TRW)、最大レイトウッド密度(MXD)、その他の密度パラメータ、および定量的木材解剖学(QWA)データを取得するために、労働集約的な表面処理や物理的なサンプル調製を必要とせずに提供されます。ここでは、60 μmから4 μmまでの解像度でのインクリメントコアとスキャン手順に焦点を当てています。木材を見るべき3つのスケールが定義されています:(i)年輪間スケール、(ii)年輪スケール、すなわち年輪分析と密度測定スケール、および(iii)解剖学的スケール、後者は従来の薄切片の品質に近づきます。これらのスケールごとにカスタム設計されたサンプルホルダーにより、複数のインクリメントコアのハイスループットスキャンが可能になります。TRWおよびデンシトメトリーのために、樹木のコアの3次元X線CT画像を効率的に処理するために、一連のソフトウェアルーチンが特別に開発されました。この作業では、プロトコルを適切に理解するために必要なCTの基本原則を簡単に説明しています。このプロトコルは、年輪年代学で一般的に使用されるいくつかの既知の種について提示されています。大まかな密度推定値、TRWおよびMXDデータ、および定量的解剖学データの組み合わせにより、気候の再構築や樹木の応答に関する現在の分析を広げ、深化させるだけでなく、樹木生態学/気候学および考古学の分野をさらに発展させることができます。
Introduction
木材密度は、木材2の解剖学的特性と化学的特性の両方を反映する、測定が容易な変数1です。地上バイオマスのバイオマス推定では、木材密度は重要な計量変数3,4,5であり、樹木の寸法と木材の炭素含有量を表す係数が乗算されます。木材密度は、木材6の機械的特性と密接に関連しており、樹木7の生命史を反映しています。
細胞壁密度は約1500kg/m³と測定され、かなり一定と考えられている8が、リング内の細胞壁密度の変動も同様に考慮されるべきである8,9。木質細胞(一般に針葉樹の気管、血管、実質、広葉樹の繊維)はさまざまな方法で配向/形状されており、これらの細胞の細胞壁の厚さと内腔のサイズは異なります10。したがって、木材密度は、樹木間、樹木内(軸方向および横方向)、および年輪内の短い間隔内で変化する11,12。多くの場合、年輪スケールでの木材密度の変動もまた、年輪境界13を区切る。木材密度、そして最終的には組織画分が生成され、この論文では、以下に説明するように、研究目標(図1)に応じて、大きく3つのカテゴリ(つまり、3つの異なる解像度スケール)に分類されます。
リング間スケール:木材片を測定することにより、そのサンプルに対して単一の値が得られます。これは、水浸しまたは幾何学的に14によって行うことができます。このようにして、一般的なバイオマスまたは木材の技術変数を取得できます。髄から樹皮へのバリエーションを含めるために、これらの木材片をさらにブロックに分割し、手動で測定して生活史戦略に関する情報を得ることができる15。医療用スキャナ17,18のような低解像度X線CTに切り替えると、中幅のリング上のTRWデータを多くのサンプル18,19,20で効率的に作成することができる。これは、温帯樹木と熱帯樹木の両方からの髄から樹皮までのバイオマスを評価するために使用できるスケールでもあり、通常は50μmから200μmの分解能の範囲です4,22。
リングスケール:木材は過去の環境条件の記録者です。最もよく知られているパラメータは年輪幅(TRW)ですが、全球温度の再構築では、最大レイトウッド密度(MXD)レコードが気温22のより優れたプロキシであることが証明されています。MXDは、測定が容易な変数23であり、年輪の最後の細胞上の細胞壁の厚さと細胞サイズの代理であり、季節的な気温24に正の関連がある樹木限界と北方の部位にある:暖かく、夏が長くなるほど、細胞壁の林化が進み、その結果、これらの最後の細胞の密度が増加する。液浸や形状などの従来の測定では、このリングレベルの密度を決定する精度は低くなります。以前の研究では、薄いカットサンプル25にX線フィルムを使用するためのツールチェーンを開発しました。これは、林業学とその後の古気候学の両方に革命を引き起こしました15,18、最大レイトウッド密度(MXD)、つまり、夏の気温の代理として、リングの終わりによくあるピーク密度値を定義しました。基本的な原理は、サンプルを軸方向と完全に平行になるように切断(約1.2mm〜7mm13)し、サンプルをX線源にさらした高感度フィルム上に置くことです。次に、これらのX線撮影フィルムは、強度を検出し、プロファイルと年間年輪パラメータを保存する光源を介して読み取られます。しかし、これらのツールには、大量のサンプル調製と手作業が必要です。最近、これはX線CTのために、より標準化された方法で、またはマウントされたコア26に基づいて開発されました。ここでの分解能は10μmから20μmの範囲であり、TRWは、特に小さなリングを扱う場合に、このスケールでも測定されます。
解剖学的スケール:このスケール(分解能<4μm)では、主要な解剖学的特徴が視覚化され、その幅と比率を測定できるようになるため、平均密度レベルの関連性が低くなります。通常、これはマイクロセクションの作成、高解像度の光学スキャン、またはμ-CTスキャンによって行われます。細胞壁の超微細構造を視覚化する必要がある場合、走査型電子顕微鏡が最も一般的に使用される方法です27。解剖学的スケールでは、個々の組織画分が見えるようになり、画像から生理学的パラメータを導き出すことができます。個々の解剖学的パラメータと木材の細胞壁密度に基づいて、解剖学的密度を導き出し、従来の木材密度の推定器と比較することができる24。
改良された切片化技術と画像ソフトウェア29,30により、樹木解剖学30は、針葉樹のMXDをより詳細に推定し、広葉樹からのいくつかの解剖学的変数を測定するために、木材のより正確な記録を持つために開発されました。このスケールでは、実際の解剖学的パラメータが測定され、環境パラメータ31に関連しています。μCTでは、このレベルも32,33で取得できます。
木材は本質的に吸湿性があり、異方性であるため、木材密度は慎重に定義する必要があり、測定条件は、オーブン乾燥、コンディショニング(通常は12%の含水率)または緑(森林で伐採されたもの)のいずれかで指定する必要があります34。大規模なサンプルや技術的な目的では、木材密度は、特定の条件下での重量をその体積で割ったものとして定義されます。しかし、木材密度の値は、それが測定されるスケールに強く依存しており、例えば、髄から樹皮まで木材密度が2倍になることがあり、リングスケール(針葉樹)では、アーリーウッドからレイトウッドへの移行により、木材密度も大幅に上昇し、リング境界にピークが生じます。
ここでは、前述の3つのスケールで特徴を測定するために、インクリメントコアのX線CTスキャンプロトコルを示します(図1)。X線CTの最近の開発は、柔軟なセットアップにより、これらのスケールのほとんどをカバーすることができます。研究の目標は、スキャンの最終的なプロトコルを決定します。
重要な制限要因(これは本質的に木材密度と一般的な木材のスケーリングされた性質に関連しています)は、スキャンに必要な解像度と時間です。例は、(i)コンゴ盆地からのTerminalia superbaのバイオマス推定のための年輪間樹木スケールの木材密度プロファイルを取得する方法、(ii)HECTORシステム35上のヘリカルスキャンに基づいてクランウィリアムスギ(Widdringtonia cedarbergensis)から密度レコードを取得する方法、および(iii)Nanowoodシステム上の固着オークの血管パラメータを測定する方法を示しています。どちらのスキャナーも、UGent Center for X-ray Tomography(UGCT、
図1:X線CTスキャンの一般的な方法論的決定木。 行は、研究目標から最終的なデータ形式に至るまで、実行する手順を示しています。白いボックスは、このツールチェーンに関連する手順です。グレーアウトされたボックスは、年輪分析用のdplr47 およびTreeclim48 、CT画像に基づいて木材の解剖学的パラメータを導出するためのROXAS44 およびImageJ42 またはその他の(商用)アプリケーションなど、他のソフトウェアまたはRパッケージで実行できるステップです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
木材のX-CT研究
スキャナーのセットアップ:標準的なX線CTスキャナーは、X線管、X線検出器、回転ステージ、および回転ステージを前後に移動させるための一連のモーターで構成されています(図2)。
図 2.HECTORスキャンシステム。 このシステム35は、ソース検出器距離(SDD)とソースオブジェクト距離(SOD)を示している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ほとんどのラボベースのシステムはコーンビーム形状を採用しており、生成されたX線はチューブの出口ウィンドウからコーンビーム形状で分布し、物体とチューブの間の距離(SOD = Source-Object-Distance)と検出器とチューブの間の距離(SDD = Source-Detector-Distance)を変更することで、倍率が制御されることを意味します(解像度に関する説明を参照)。X線の透過力により、X線は物体を通過し、減衰ビームの強度は、X線ビームのエネルギー、物体の化学組成(存在する元素の原子番号)、および材料の密度の関数です。一定のエネルギースペクトルと一定の材料組成の木材を考えると、X線ビームの減衰は材料の密度に大きく依存するため、デンシトメトリーでの使用が説明されます。減衰(または透過)は、ランベルトビールの法則で表すことができます。
I0 の場合、入射 X 線ビームは指数関数的に減衰し、距離 d にわたって材料を伝搬するときに透過 X 線ビーム Id に減衰します。線形減衰係数μ、オブジェクトのマテリアルとの一連の相互作用に依存します。したがって、投影は透過ビームの記録です。
実際には、オブジェクトは回転ステージに取り付けられ、適切なSODとSDDが選択され、特定のパワーも選択されます(オブジェクトのサイズ、密度、および組成に関連)そしてオブジェクトは360°回転し、その回転中に複数の投影が取得されます。これらの投影は、オブジェクトの内部構造を再構築するために使用されます。いくつかの再構成アルゴリズムが利用可能であり、その中で最もよく使用されるものは、ラドン変換とフーリエスライス定理に依存して、数十年前に開発された解析フレームワークに基づいています。詳細については、読者は専門文献36を参照されたい。
解像度、データ量、サンプルサイズの難問:X線CTスキャンでは、解像度が重要です。逆形状の系や、シンクロトロンビームラインのような平行ビーム形状の系では、他の考慮事項が役割を果たします。このプロトコルでは、コーンビーム形状を使用した標準的なラボベースのX線CTスキャンについてのみ説明します。ここでは、倍率、検出器のピクセルサイズ、スポットサイズの概念が重要です。倍率はSDD / SODの比率として定義されます。次に、検出器のピクセルサイズも明らかに解像度に影響を与えます:ピクセルサイズが小さいほど、解像度は高くなりますが、ほとんどの場合、視野(FoV)もピクセルサイズと検出器のサイズに直接関係しています(ピクセルサイズが小さいほど、同じピクセル数のFoVが小さくなります)。また、X線ビームのスポットサイズも重要で、スポットサイズが大きいほど解像度が低くなり、細部が見えにくくなります。
上記の制限に従って可能な解像度よりも高い解像度を得ることができることに対処することが重要です。したがって、解像度の代わりにボクセルサイズ(ボクセルはボリュームピクセルです)という用語を使用することをお勧めします。さらに、検出器のシャープネスなど、オブジェクトがスキャンされる真の解像度をさらに制限する他の要因が関係しています。確立されたターゲットを使用したシステムの真のキャリブレーションのみが、真実の答えを提供します。
ただし、ほとんどの場合、オブジェクトをスキャンできるボクセル サイズは、ほとんどの場合、オブジェクトのサイズによって制限されます。つまり、オブジェクトが大きいほど、ボクセル サイズは小さくなります。物体が特定のボクセルサイズで検出器のFoV内に収まらない場合、倍率を制限するなどして、ボクセルサイズを小さくすることができます。
スキャン時間とデータ量は、目的のボクセルサイズを決定する際に考慮することが重要です。一般に、ボクセルサイズが小さいほど、見たい詳細が高くなり、サンプルが小さくなるか、一度にスキャンできるサンプルが少なくなるほど、より多くの時間が必要になり、収集されるデータ量が大きくなります。次の理論的な例を想像してみてください:あるX線CTシステムで50μmで10cm x 10 cmの10 cm x 10 cmのサンプルを一度にスキャンし、同じ体積を10 μmでスキャンすると、FoV内に収まる体積は2 cm x 2 cm x 2 cmになります。 これが物理的に可能であると仮定します。これは、ボリューム全体をカバーするには125回のスキャンが必要であり(5³ = 5倍の解像度、イメージング技術の体積特性により3の累乗にスケーリング)、データ量も同様に増加することを意味します。もちろん、これは思考実験に過ぎず、解決策以上のものを考慮する必要があります。詳細については、読者はスキャンの可能性37の概要を参照されたい。
木製の物体をスキャンするための機器の柔軟性:過去10年間で、多くの企業がHECTOR35と同様のアセンブリを備えたX線CTシステムを提供してきました。いくつかのCTシステムの概要、特にそれらの時間分解能について評価されたものは、38で示されています。
全体として、X線CTシステムの柔軟性と使いやすさは大幅に向上しています。多くのシステムでは、さまざまなオブジェクトのスキャンが可能ですが、これはUGCTのシステムにも当てはまります。以下のプロトコルは、年輪分析に適したHECTORシステムで実証されています。ただし、このプロトコルは、解像度とデータ形式が許す限り、他の使用可能なシステムに対して有効です。
これらのシステムでは、さまざまなオブジェクトのスキャンが可能です。HECTORシステムでスキャンしたさまざまな木製オブジェクトのいくつかの写真を 図3に示します。この柔軟性こそが、 図1に示す3つのスケール(粗い解像度から非常に細かい解像度まで)で構成されています。
図 3.スキャン設定の例。 (A)丸太、(B)チェロ49、(C)バッチスキャン用のツリーコア付きサンプルホルダー(タイプ1)、(D)HECTORの回転ステージに取り付けられたヘリカルスキャン用のインクリメンタルコア付きサンプルホルダータイプ2。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1. コアサンプリング
- Presslerボーラーで木を試飲してください。手動でツリーをコアにする方法に関する参考文献を参照してください39。このツールチェーンは、5.15 mm コア用です。
- 接着されていない木の芯を6mmの紙ストローまたは接着剤を必要としない他の受容体に入れます。木の芯を木製の支柱に接着しないでください。コアがすでに取り付けられている場合は、接着剤の種類に応じて、メス/のこぎりまたは溶剤でコアを取り外してください。
- プラスチックチューブで包むのを避け、カビの成長や真菌の腐敗を避けるために、最初に乾燥させてみてください。
- 紙のストローに鉛筆で書きます、抽出によってマーカーの書き込みが色あせる可能性があるためです。
注:このツールチェーンは、4mmコアにも適しています。すでにマウントされているコアとサンディングされたコアを使用できますが、最初にこれらをアンマウントする必要があります。考古学的な木材や残材の場合、スキャンのためにコアサイズのサンプルを(サイズを鋸で挽いたり、サイズを小さくしたりして)作成する必要があります。
2. スキャン前のコアの準備
- エタノール/トルエンまたはエタノールまたはアセトン40ソックスレー抽出を少なくとも24時間実行します(図4A、B)。これは、樹脂を含まない木材の体積が正確な密度計算を行うために必要です(樹脂は信号を減衰させます、図4C13,41)。
- 1000mLのエタノールと427mLのトルエン(例:ASTM D 1107-96による)または純粋なエタノールまたはアセトンの溶液を作ります。多くの大学には、ソックスレー装置の樹木コア用の適応バージョンを作成できる実験用ガラスワークショップがあります(図4B)。
- 丸底フラスコに溶媒を充填し、実験室用ヒーターのクーラーを備えたソックスレー装置内のステンレス鋼支持体のストロー内にサンプルを入れます。1時間あたり少なくとも6回のサイフォンを許可します。
注意: 閉水回路は、冷却(またはその他の最新の冷却システム)に使用することが望ましいです。この場合、ウォーターポンプは、塩素錠剤(藻類の発生を避けるため)とともに100Lの洗面器に貯蔵された水を120L / hで循環させます(ただし、これはソックスレー装置のサイズと熱要素によって適用される熱によって異なります)。100Lの洗面器の水を冷却するために、エアクーラーが使用されます。溶剤を節約するために、ガラスビーズを使用してソックスレー装置の空隙量を埋めることができます。 - サイフォンの温度と回数を定期的に確認してください。ケミカルフードの下でコアを乾燥させ(これについてはラボのポリシーを確認してください)、溶剤の残留物を取り除くか、ケミカルフードの下に乾燥オーブンを置きます。
- 排気換気の下で乾燥オーブン(103.5°C)でコアを24時間乾燥させ、上記のように温水浴(90°C)または温水ソックスレー抽出を24時間行います。
- サンプルをスチールサンプルホルダーの紙ストローに保管します。ドライオーブンで103.5°Cの24時間再度乾燥させ、スキャンする前に相対湿度(RH)60%に調整します。
注:この場合、60%の値が選択されるのは、X線CTスキャンルームの周囲平均相対湿度条件とほぼ同じであるためです。オーブン乾燥サンプルも使用できます。最も重要な要素は、すべてのサンプルが同じ条件下でスキャンされることです。 - 水抽出が紙ストローを変性させる場合は、木の芯を新しい6mmの紙ストロー21に戻します。5.15mmと4mmの両方の芯を6mmの紙ストローに入れることができます。
- 紙のストロー全体が木で満たされていることを確認してください。両方のストローの端を包み、端を切ります。これにより、円筒形ホルダーにストローを簡単に挿入できます。
- CoreProcessorとRingIndicatorは樹皮側が下がっていると想定しているため、形成層(樹皮)側がコアに明確に示されていることを確認してください。ビットやピース、および亀裂のあるコアは作業が難しいため、これらを取り除きます。
- サンプルをスチールサンプルホルダーの紙ストローに保管します。ドライオーブンで103.5°Cの24時間再度乾燥させ、スキャンする前に相対湿度(RH)60%に調整します。
図 4.スキャン前にコアを抽出および乾燥するためのワークフロー。 (A)紙ストローのインクリメントコアを最初に温水浴に入れ、次にソックスレー装置を備えた高温のエタノール-トルエン混合物に24時間入れた後、乾燥させ、24時間熱湯浴に入れ、次に103.5°Cで再度乾燥させ、スキャンする前にコンディショニングします。(B)ゲント大学のソックスレーの改造セットアップの画像。複数の適合したソックスレー装置が直列に取り付けられています。アルミニウムホイルと絶縁チューブは、溶媒または溶媒混合物を抽出のために十分に暖かく保つために注意してください。(C)抽出前と抽出後の Pinus longaeva からのインクリメントコアの表面の例。樹脂やその他の抽出物は、X線の減衰により、真の密度信号を隠します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. コアスキャン
- 図1で説明する研究目的に応じて、以下で説明するように適切なサンプルホルダータイプ(図5)を選択します。
- リング間スケールの目的で、ホルダータイプ1(段ボールと穴あき花フォーム)を使用します。
- MXDデータには、ホルダータイプ2(長さ1〜15cm、直径3cmのコアを6個保持するプラスチックサンプルホルダー)を使用します。
- ホルダータイプ3を使用 - 単に紙のストローを一緒に結ぶことからなる年輪解剖学の目的で。
- 紙ストローに入った木の芯をサンプルホルダーにセットし、https://dendrochronomics.ugent.be/#software でダウンロードできるスプレッドシートテンプレートに記入します。各番号は、サンプルホルダー内の特定の位置に対応しています。
- X線μCT施設でのスキャン:適切な設定とスキャンプロトコルについては、X線CTの専門家に相談してください。このプロトコルで使用されるスキャナーについては、37 を参照してください。
- スキャンした画像の再構成:再構成の適切な設定、またはCTスキャナー(X線CTスキャナーのソフトウェアパッケージ)に付属する設定については、X線CTの専門家に相談してください。このプロトコルの再構成パラメータについては、37を参照してください。
図 5.サンプルホルダーの種類と分解能。 (A)年輪間スケール、(B)年輪スケール、(C)解剖学的スケールに対応する3つの主要なホルダータイプの設計。結果として生じるサイズにより、サンプルの数は、必要な分解能の増加とともに減少します。(D)リング間スケール(ホルダー1)、(E)リング幅とMXD(ホルダータイプ2)、および(F)解剖学的パラメーター(ホルダータイプ3)に対応する3Dレンダリング。スケールバー= 5 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. TRWデータ、密度データ、解剖学的データを取得する
- ソフトウェアの使用を開始する。
- 密度値 (ホルダー タイプ 1 および 2) を取得するには、次の 3 つのソフトウェア パッケージをインストールします: (i) CoreProcessor、(ii) RingIndicator、および (iii) CoreComparison ツールボックス
- これらのツールボックスはMATLABで作成されたため、次のURLで入手可能な正しいMATLABコンパイラランタイム(MCR)をインストールします:http://nl.mathworks.com/products/compiler/mcr/。現在必要なバージョンはMATLAB2022Bです。MCRは、3つのソフトウェアパッケージと同様に無料です。
- 再構築されたボリュームのフォルダの隣に、MATファイル(変数などを格納するMATLABのファイル形式)用に新しい空のフォルダを作成します。たとえば、matfiles_useful_name_sample_holder、これは一時的なパラメータを格納するために必要です。
- スプレッドシートが再構築されたボリュームのフォルダにあることを確認し、後の手順でサンプルを埋めます。
- CoreProcessor を使用してコア ボリュームを前処理します。
注:高解像度の解剖学データの場合、次の処理手順は必要ありません(図 1) で、再構築されたボリュームが利用可能になったら、3D イメージの ImageJ ガイドラインを参照してください42.セグメンテーションはWekaプラグインを介して行うことができます43 例えば、個々のスライス上の容器を示すため12、または ROXAS などのソフトウェア プラグイン44.- コア抽出の準備: 以下で説明するように、インクリメント コアの自動抽出を準備します (リング間スケール 図 6A またはリング スケール 図 6B によって異なります)。
- 再構築されたファイル(16ビット断面TIFFスライス)とスプレッドシートファイル(XrayForm.xlsx)のあるフォルダを選択します。
- 4.1.3から空のフォルダを選択します。これは、CoreProcessor が 4.2.2 で使用される MAT ファイルを作成するフォルダーです。マスコア抽出用。
- 新しく作成した空のMATファイルフォルダを選択するか、作成されていない場合は他のフォルダを選択します。ボリュームがロードされ、シリンダーの縦方向の断面が表示されたら、いくつかの水平スライスをチェックして、すべてのコアとリファレンスがシリンダーに正しく取り付けられているかどうかを確認します。
- 下から上へクリックして、これを評価するためのスライスを選択します。これらの断面は次のステップで使用するため、全長をクリックします。暗い(空気)と白い参照(図6)を、スプレッドシートファイルに示されている回数だけ示します。各選択の後をダブルクリックします。
- サンプルホルダー1については、標準物質を介して生成された9つの断面を持つマルチスクリーンを検査し、密度計算が木材に対して行われたかどうか(紙ストローやその他の非木材材料に対しては行われなかったか)を確認します。これは、実際の木材密度値に正しく変換するために不可欠です。
- 新しいポップアップウィンドウで、コアの周囲に円/楕円を描画して、すべてのコアを個別に選択します。スプレッドシートファイルの情報に基づいてラベリングを実行し、名前が正しいかどうかを確認します。テンプレートが入力される順序を尊重します。すべての情報は MAT ファイルに保存され、次のステップですべてのコアを一度に抽出するために使用されます。
- [ Mass Core Extraction ]をクリックすると、メタデータとスプレッドシートファイルが同じフォルダにある場合、特定のシリンダ内のすべてのコア(4.2.1.2で示されている)のコア抽出が実行されます。
注:Mass core extractionを使用する場合、すべてのコアはユーザーのラベルに従って抽出されます(matファイルフォルダに保存されます)。この操作の結果、 Extracted という名前の新しいフォルダーが作成され、そこには個別のコアがすべて含まれます。最初のステップで複数のサンプルホルダーを準備し、すべてのMATファイルを同じフォルダに保存すると、このフォルダ内のすべてのMATファイルが処理されます。 - CoreProcessorツールボックスで、[ Manual Tg Correction]をクリックし、[ Extracted ]フォルダを選択して、各コアボリュームの横方向と半径方向の平面の適切な向きを確認します。これは、サンディング前に物理的なサンプルをサンプルホルダーにマウントして横方向平面を視野に入れたままにするのと同じです(図7B)。
- 一部の断面は、ユーザーが粒子の方向を見ることができるように表示されています。最後のプロット(右下)で、表示されているスライスを調べ、粒子の方向を示す線を引きます。ダブルクリックすると、コアが自動的に回転します。
- 次に、画面が表示され、ここでコアのボリュームをトリミングし(図7C)、長方形がコアの直径全体を囲むことを確認します。これは、四角形の中心点がコア軸にできるだけ近づく必要があるためです (RingIndicator モジュールで正しく位置合わせするため)。
注意: 高解像度でスキャンする場合は、この段階でコア内の材料のみを選択し、コンバーターを使用してサンプルホルダータイプ2に切り替えます。これは、たとえば環状多孔質種に確かに役立ちます。
- コアの位置がずれている、反転している、壊れている、または互換性のない画像形式の場合は、次のオプションの手順を実行します。
- コアチルト補正(サンプルホルダー1のみ):コアチルトを自動的に補正します(たとえば、コアがシリンダー内でわずかに傾斜している場合。 図7A)。これは、後の手順で重要です。前の手順で作成した 抽出されたフォルダーを選択します。
注:サンプルホルダータイプ2またはタイプ3(図5)がある場合、またはすべてのサンプルとサンプルホルダーが完全に直立している場合、これは通常は必要ありません。 - ボリュームを反転する:サンプルが樹皮側を下にして置かれなかった場合(髄と樹皮の方向が左から右にない場合)、コアを反転させて方向を変更します。この関数はフォルダを要求し、新しいフォルダを作成します。
- 芯のり:個々の芯の大部分を仮想的につなぎ合わせます。アイデアは、完璧にステッチするのではなく、必要に応じて、単一のコアが同じマルチページのTIFFボリュームにあることを確認することです。壊れたコアの表示(ステップ4.3.4.9を参照)を使用して、コアピース間のスペースを克服します。
- コンバーター: ボリュームが別のソフトウェア パッケージで操作され、ツールボックスの外部 (ImageJ など) に保存されている場合は、この手順を実行してヘッダー情報を正しく取得します。この手順は、別の CT スキャナーからの 16 ビット マルチページ TIFF ボリュームや RingIndicator ツールボックスの使用にも使用します。
注:ここからのすべてのステップは、構造の方向修正、そして最後にデンシトメトリーとツリーリング分析のためのものです。
- コアチルト補正(サンプルホルダー1のみ):コアチルトを自動的に補正します(たとえば、コアがシリンダー内でわずかに傾斜している場合。 図7A)。これは、後の手順で重要です。前の手順で作成した 抽出されたフォルダーを選択します。
- コア抽出の準備: 以下で説明するように、インクリメント コアの自動抽出を準備します (リング間スケール 図 6A またはリング スケール 図 6B によって異なります)。
- RingIndicatorの角度と表示リングを修正します。
注:RingIndicatorモジュールでは、次の手順を時系列で実行する必要があります:(i)横方向および半径方向の平面の視覚化、(ii)構造補正、(iii)密度プロファイルの作成、および(iv)リングを手動または半自動で表示します。- 以下で説明するように、横方向平面と半径方向平面の視覚化を実行します。
- GUIに慣れるには、ツールボックスを開き、複数ページの TIFFファイル (抽出後およびtg修正後に作成されたファイル、したがってフォルダ名 Tg修正済み)を選択します。
- [ スライス画像の半分の厚さ ] を選択すると、中央の X スライスの平均画像が表示されます。X は 1 から 10 の範囲で、1 は平均化なし (つまり、中央のスライスのみを表示する)、10 は中央の 10 個のスライスの平均画像です。
注:平均化は、リングの境界をより強調し、ノイズを抑制するのに有益ですが、一方で、特にファイバーの角度が大きい場合は、リングの境界があまりはっきり見えないようにすることもできます。必要に応じてこの値を調整してください。これは単に表示するためのものであり、基礎となるボリュームに影響を与えたり、最終的な計算/結果に影響を与えたりしないことに言及することが重要です。 - グラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) を検査します。GUIには、コアの横方向平面を示す上部の図と、コアの半径方向の平面を示す下部の図、およびメニューが含まれています(図8)。
- 新しいコア ボリュームをロードするには、 ボリューム ロード > ボリューム ロード 機能を検索して、ディレクトリ内の新しい複数ページの TIFF ファイル を選択します。これで、ユーザーは構造の方向を示して、その後に実際の年輪を示す準備が整いました。
- 自動年輪表示を容易にするための構造修正。
- 画像を手動でクリックして、構造修正用の緑色のバーを挿入します。髄(または利用可能な最も古いリング)から始まり、最新のリングで終わります。コアに沿って、横方向平面と半径方向平面の両方で構造上の偏差を修正します。
- リングとファイバーの角度を適切に示してください、なぜなら、後続のすべての指示はそれぞれの指示の間に補間された角度を取るからです。
- 一方の平面に緑色のバーを挿入すると、もう一方の平面に1本が自動的に生成されます。バーを挿入した後、バーの端にあるノード(白い四角)を動かして角度を変更します。中央のノードを使用して、バーの位置を変更します。ノードのサイズを調整して、使いやすくします。
- 各ステップの後、 必ず Data > Export と Rings > Export Rings を押して、リングとファイバーの指示が適切な .txt ファイルに書き込まれていることを確認してください。すべての修正を通じて、常にこれら 2 つのアクションを実行するようにしてください。
- 密度プロファイルの計算。
- 密度プロファイルを計算するには 、密度プロファイルを計算するには、密度 測定プロット>密度測定プロットを使用します。密度プロファイルを作成するには、[ オーバーレイ印刷]>[密度プロファイルのプロット]を選択して、コア平面上のオーバーレイとして機能させることができます。
- MXDの計算では、パーセンテージ(推奨は20%、たとえば20%は最高密度値の20%のみが含まれることを意味します)を示して、樹脂ダクト、アーリーウッドなどから低い値を除外します。平均密度の値には 100% を使用します。最小密度にも100%を使用します。
- 以下で説明するように、リングごとにマウスの左クリックを1回使用して、リング境界の手動および/または自動表示を実行します。
注:手順4.3.2.1と同じ緑色のバーを挿入します。今回は、ユーザーはリングごとにこれを行う必要があります(図 9).- [オーバーレイ プロット] > [密度プロファイルのプロット] を使用して、イメージ上の密度プロファイルを可視化します。リング境界は、このプロファイルと併せて示すのも最適です。
注: ツールボックスから必要な数のインスタンスを開き、CoreComparison ツールボックスと組み合わせて開きます (詳細を参照)。 - 自動表示(針葉樹などに推奨)の場合は、自動>最大/最小/変曲検出を使用します。この機能は、前の手順で作成したデンシトメトリープロファイルに基づいて、樹木の年輪境界を自動的に示します。自動表示(北方の針葉樹や、密度プロファイルによって明確なリング境界を持つ種に最適)の場合は、自動>最大/最小/変曲検出を使用します。この機能は、前の手順で作成したデンシトメトリープロファイルに基づいて、樹木の年輪境界を自動的に示します。
- 種(拡散多孔質/環多孔質または針葉樹)に応じて、最大/最小、または曲線の変曲(密度ピークの直後)を年輪境界基準として使用します。最初のパラメータはピーク関数のしきい値で、2番目のパラメータはより滑らかな関数です。
- 自動リング指示を実行した後、自動シフト (ウィンドウ サイズ 1 ピクセル、ユーザー定義の反復) を実行し、このシフトによってリング指示が互いにプロットされていないことを確認し、デンシトメトリー プロットを再実行します。
- 伐採日を、生きている木にインクリメントコアが採取された年、またはその他の適切な日付に変更します。デフォルトは 1900 に設定されています。
- [オーバーレイプロット]で、[プロットリング]を選択すると、年が表示されます。また、リングをプロットする平面や密度プロファイルも選択します。
- 2 つのコアが完全に示されたら (たとえば、同じツリーから)、CoreComparison ツールボックスを開いてコア リング幅曲線のペアワイズ比較を行います。コアごとに 1 つの RingIndicator インスタンスを開き、必要に応じて指示を編集します。それらを再度エクスポートし、この反復的でインタラクティブなアプローチを選択して、高品質のデータを取得します。次の手順 (手順 4.4.1.) では、すべてのコアに対してこれを行い、TRW データと対応する密度値の両方をエクスポートします。
- 「リング」>「チェックリング」オプションでダブルリングの位置を確認します。これにより、画像の外側に表示やリングが重なっているかどうかがチェックされます。たとえば、同じ位置でダブルクリックが2回発生した場合などです。
- 断片がついている壊れたコアは、髄から始めて、異常(壊れたコアによる空気、樹脂ポケットによる輝点、汚れ、腐敗した部分)をリングのように区別して、後でそれらを削除します。最後に形成された年輪の年輪境界で終了し、データをエクスポートします。サンプリング中にコアが壊れないようにしてください(手順1.1.および39を参照)。
注:リングの欠落と破損の両方を示すことができます( 図10を参照)。2つのケースが定義されており、1つはコアがリングの中央で破壊される場合、もう1つはコアがリング境界で破壊される場合です。最初のもの(図10A)については、ギャップを示し、そのギャップの番号に続いて番号1をメモし、括弧を閉じます。次に、プログラムはリングの2つの部分を合計して、正しいTRW値を取得します。2 番目のケースでは、ギャップ番号の後に番号 2 が付き、プログラムはこのセクションを省略します (図 10B)。 - リングを指定し、密度プロファイルを生成することにより、複数の.txtファイルが作成され、複数ページのTIFFファイルと同じフォルダに保存され、最も重要なファイルを 表1に示します。これらの.txtファイルを TIFF イメージと同じフォルダに保持して、CoreComparison モジュール (ステップ 5.4) でさらに処理します。
注: 未加工の密度プロファイルに基づいて別の方法で密度値を計算する場合 (たとえば、latewood width と earlywood width45 、または CoreComparison ツールボックスと CoreProcessor ツールボックスでサポートされていないその他のメトリック) には、zpos_corr テキスト ファイルと density_corr テキスト ファイルを使用し、これらをそのような計算に使用します。
- [オーバーレイ プロット] > [密度プロファイルのプロット] を使用して、イメージ上の密度プロファイルを可視化します。リング境界は、このプロファイルと併せて示すのも最適です。
- 以下で説明するように、横方向平面と半径方向平面の視覚化を実行します。
- TRWシリーズを比較し、CoreComparisonを介してデータをエクスポートするには、以下の手順に従ってください。
注 : このツールボックスを使用すると、CoreComparison モジュールと PatternMatching モジュールの 2 つのウィンドウが同時に開きます。CoreComparisonは、TRWデータのクロスデートとエクスポートを扱いますが、PatternMatchingモジュールは、密度プロファイルと密度値(MXD、最小密度(MND)、平均密度、および4四分位値)のエクスポートに使用できます。CoreComparisonの主な目標は、TRW値と密度値を生成し、リングが欠落していたり、誤った表示がある場合にRindIndicatorに結合して、クロスデート品質の大まかな推定を行うことです。- クロスデートまたはリング幅パターンを他のシリーズと一致させるには、次の手順を実行します。
- RingIndicatorセクションが完成したら、比較するテキストファイルを選択すると、画面が開き、リング幅と、Gleichlaüfigkeit(GLK)46 や個々のシリーズ間のSpearman相関などのクロスデートまたは統計パラメータが表示されます(図11)。
- リング表示に変更を加えるには(例えば、クロスデート中)、 RingIndicatorを再度開き、データをインポートし、変更したデータとリングをエクスポートし、CoreComparisonモジュール(左上を参照)の [更新 ]ボタンを使用して変更を確認します。
- 複数の RingIndicator インスタンスを開いて、異なる年輪シリーズに変更を加え、複数のスクリーン モニターを使用して変更を加えます。
- [GLK と CORR] メニュー (図 11) で、数値のしきい値の設定、スプレッドシートへの GLK 値のエクスポート、ランク付けなど、GLK に関連する一連のアクションを実行します。
- 以下で説明するように、CoreComparison から TRW 値を取得します。
- CoreComparison のプロットおよびエクスポート機能を使用して、曲線間のオフセットを変更します (値が大きいほどオフセットが小さくなります)。プロット内のTRWデータを可視化するには 、Plotting and Exporting > Ring widthを選択します。
- TRWデータをエクスポートするには 、[プロットとエクスポート]>[RWデータのエクスポート]をクリックします。リング幅をスプレッドシート形式またはツーソン形式でエクスポートします。
- 以下で説明するように、PatternMatching モジュールから密度プロファイルを取得します。
- スプレッドシートで密度プロファイルを取得するには、 PatternMatching モジュールに移動し、プロファイルを読み込んだ後、 メニューで[その他 ]メニューから [プロット]>[修正された密度プロファイルのエクスポート]を選択します。
- プロファイルをバッチ処理したり、さまざまな方法を使用してデータを評価したりするには、 表 1 の.txtファイルを直接使用します (ステップ 4.3.4.11 を参照)。
- 以下で説明するように、PatternMatching モジュールから MXD、MND、およびその他の密度値を取得します。
- 年輪ごとの平均密度、MXD、MND、および四分位データを取得するには、 その他のプロット>クラスターデータのエクスポートを使用します。スプレッドシートが生成され、TIFFファイルと同じフォルダにあります。
- スプレッドシートのタブについて、 表 2 で詳しく説明します。これらのツリーリング変数をRstudioまたは他のソフトウェアにエクスポートして、さらに分析します。
- クロスデートまたはリング幅パターンを他のシリーズと一致させるには、次の手順を実行します。
図 6.灰色の値から木材の密度値を取得します。 画像のグレー値を実際の木材密度の推定値に変換し、参照材料によるキャリブレーションを行います。(A)サンプルホルダー1、60μmの分解能で、空気基準、白色基準、およびコアを示しています。(B)サンプルホルダー、20μm、エア、リファレンス、コアも示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.3Dコアボリュームの前処理手順。 3Dコアボリュームの前処理ステップで、年輪を視覚化して示す前。(A)傾き(軸方向)補正、(B)接線方向補正、灰色のバーは繊維方向を示し、(C)コアボリュームのトリミングにより、木質ボクセルのみのボリュームが得られます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 8.コアのスクリーンショット。 RingIndicatorツールボックスで開いたコア(接線幅約3 mm、解像度μm)のスクリーンショット。上側ペインは横方向ビュー、下側ペインは放射状ビューです。緑のバーは構造の表示(この場合はリング境界上)を示し、赤い線は密度プロファイルです。黄色の数字は暦年を示し、青い数字は一般的なリング番号(最初の表示から数えて)を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 9.RingIndicatorモジュールでのリング表示と密度プロファイルの視覚化。 緑の線は表示、赤い線は木材密度プロファイルです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 10.コアの亀裂に対処する方法。 (A)リングの中央に亀裂が発生した場合、一般的なリング番号(髄から始まる)にギャップとしてラベルが付けられ、TRWは2つのリング部分の幅を合計して計算されます。パラメータは、3(リングの番号)と1(ケース1:リングの中央の亀裂)31である。(B)リング境界に亀裂が発生した場合、そのギャップはTRW計算から省略されます。パラメータは3(リングの数)と2(ケース2:リング境界の亀裂)31です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 11.Core Comparison モジュールのスクリーンショット。 Core Comparison モジュールのスクリーンショットでは、リング幅の系列が垂直方向に分散されており、視覚的に比較しやすくなっています。上のペインは Fagus sylvaticaの4つのコアのリング幅を示し、左下のペインはGleichlaüfigkeit(GLK)を示し、右下のペインはSpearman相関係数を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ファイル名 | 説明 | ||
| SAMPLENAME_density.txt | 画像の全長の密度値が補正されていないため、リングとファイバーの角度は補正されていません | ||
| サンプル名_density_corr.txt | cf. 前のtxtが、その後は密度値が修正されています | ||
| サンプル名_ring-and-fibre.txt | リングとファイバーの表示位置と角度 | ||
| サンプル名_zpos.txt | 年輪の境界をコアに位置、年輪と繊維の補正なし | ||
| サンプル名_zpos.corr.txt | iTemはZPOSと同じですが、リングとファイバーの角度が補正されています | ||
| サンプル名_ringwidth.txt | リングとファイバーの角度を考慮した計算されたリング幅 | ||
テーブル 1.RingIndicatorによって生成されたテキストファイル。 リングを指定し、RingIndicatorで密度プロファイルをエクスポートした後に生成されるテキストファイルのリスト。これらは、CoreComparison モジュールで開くために、.tiff ファイルと同じフォルダーに残しておく必要があります。
| 年輪変数 | 説明 | ||
| 平均密度 | 年輪あたりの平均密度 | ||
| 最大密度:ハーフベース | MXDは、前年の高密度値が含まれていないことを避けるために、年輪の後半のみに基づいています | ||
| 最小密度 | 年輪あたりの最小密度 | ||
| 質問1-質問4 | 年内リングプロファイルの各四分位数の平均値と最大値 | ||
テーブル2.スプレッドシートの詳細。 「クラスター化されたデータのエクスポート」という名前のスプレッドシートにエクスポートされるツリーリング変数。
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Representative Results
目標がバイオマスの推定または多数のサンプルの樹木の成長増加、つまりリング間スケール(図1)である場合、サンプルホルダー1(図5)を使用してサンプルをスキャンし、密度プロファイル(ステップ5.4.3を参照)と樹木の成長の推定(たとえば、TRWが大きい成長の早い樹木の場合)を取得するため、解像度が粗くなります。 図12 は、コンゴ盆地の種である T.superbaの髄から樹皮までおよび軸方向の密度の傾向の例を示しています。これらの図は、幹のさまざまな高さ位置で取得した木の増分コアから110μmのスキャンに基づいています。
サンプルホルダー2(図5B)でコアを走査することで対象とするリングスケール(図1)は、年輪分析やMXD計算が可能です。この例は図13で、南アフリカのシダーバーグ山脈から産出されたW. cedarbergensisのコアについて、最小密度(この場合は雨季の降水量にリンク)と最大密度の年代学がプロットされています26。これは、マウントされたコアを10μmの分解能でスキャンすることに基づいています。
解剖学的スケール(図1)では、ホルダー3付きのスキャンコア、つまり、紙にストローを巻き付けた複数のコアにより、最大4μmの分解能が可能になります。その結果を 図14に示すもので、オーク(Q. robur)のX線CT画像スライスが示されており、アーリーウッドとレイトウッドの両方の容器がセグメント化されています。
図 12.放射状および軸方向の木材密度の傾向。(A)コンゴ盆地(DRC)の46本のTerminalia superbaの木からのオーブンドライ木材密度(kg / m3)の半径方向の変動、最小値(最小)、平均値、および最大値(最大)と、生のプロファイル(赤)を重ね合わせたもの。(B)1つのTerminalia superbaツリーからの放射状の変化と軸方向の変動、1 mの高さ間隔ごとに増分コアが取得され、スキャンされました(合計23個のコア)。髄から樹皮にかけて密度が増加する傾向があり(カラーバーに従って強調表示)、上部の茎の木材密度が高くなります。スキャン解像度 = 110 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 13.年表の開発。Widdringtonia cedarbergensisからの最小密度と最大レイトウッド密度の年表。データは26から抽出されました。スキャン解像度は10μmです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 14.オーク材のサンプルの高解像度スキャン。 4 μmでスキャンした Quercus robur 上のオーク容器のセグメンテーションの例。セグメンテーションは、Octopus分析ソフトウェアを使用して、バイラテラルフィルタリング、しきい値処理、一連のバイナリシュリンクおよびエクスパント操作、ユークリッド距離変換、および最後に容器のラベリングを使用して実行されました。色は、小さい(濃い青)から大きい(濃いオレンジ)までの範囲で、容器のサイズを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコル内の重要なステップ
プロトコル内の重要なステップには、高品質のインクリメントコア(ステップ1.1.および39を参照)を取得するためのインクリメントボーラーの適切な取り扱いが含まれ、ビットとピースを回避します。次に、サンプルホルダーへの挿入(図5、21参照)のため、および適切な樹脂抽出50および可能な将来の分析のために、コアを未装着のままにしておくことが不可欠である(ただし、26を参照)。スキャンの直前(ステップ2.2.2.)は、水分の変動による寸法の変形を避けるために、スキャナールームでのサンプルのコンディショニングが不可欠です。次に、リングをRingIndicatorモジュールで示すことができると、密度のピークが平坦になる可能性があるため、リングの境界と角度が十分に示されることが不可欠であり、これは、従来のデンシトメトリーシステム13の不正確な表示と同様にです。表示は、正しいリング幅の測定値21を持つことも重要です。次の重要なステップは、CoreComparisonモジュールによる適切なクロスデートです（ステップ4.4.1.)。一部のコアが誤った表示をしている場合、環境信号損失51が発生する可能性があります。
技術の変更とトラブルシューティング
ツールボックスRingIndicatorとCoreComparisonは、CoreProcessorモジュールでデータを適切な解像度に変換した後、フラットベッド画像にも使用できます52 。したがって、DICOM形式(医療目的で一般的な形式であり、木材サンプル53にも使用される)を.tiffに変換する必要がある。医療用CTスキャナーを保有する診療科では、分解能200μm程度のタイプ1リング間スケール解析タイプのみ使用できます。
手法の制限事項
この方法の欠点は、年輪スケールと解剖学的スケール(より高い解像度が必要)のスキャンに利用できる設備がごくわずかであることです。データ量とデータ処理は、大量の場合、困難になる可能性があります54。木材の解剖学的構造の非常に高解像度の画像(例えば、ピット構造をさらに解明するためなど)については、古典的な透過光顕微鏡27、走査型電子顕微鏡、または共焦点顕微鏡55のためのマイクロ切片を使用する古典的な手順を参照されたい。
既存の方法に対する意義
ここで紹介するインクリメントコアのX線CTツールチェーンを使用すると、キャリブレーションステップにより信頼性の高い密度値を示すことがテストされており(図6)56 、既存のデンシトメトリー手順13に匹敵するMXD値が生成されます。
この技術の将来の応用
この技術の将来の応用には、特に3D画像のための自動リング適応症および木材組織定量化57のための深層学習の適用が含まれるかもしれない。
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Disclosures
著者には、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
フィードバックと提案をいただいた 3 人の匿名のレビュアーに感謝します。本研究は、JVdBのBOF特別研究費(BOF Starting Grant BOF.STG.2018.0007.01)、UGCTを専門知識センター(BOF.EXP.2017.0007)およびコア施設(BOF.COR.2022.008)、著者はまた、フランダース研究財団(G019521NおよびG009720N)、およびUGent産業研究基金(IOF)が助成金IOFを通じてインフラストラクチャへの財政支援を行ったことを認めています。APP.2021.0005 (プロジェクト FaCT F2021/IOF-Equip/021)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 mm paper straws | http://artstraws.com/education/product/artstraws-thick-asst-cols/ | Coring | |
| Aluminium core holders | |||
| ASTM standard ASTM D 1107 – 96 | |||
| Cardboard postal tubes | https://www.rajapack.co.uk/envelopes-mailing-bags/postal-tubes/1-5-2mm-brown-cardboard-postal-tubes_PDT05623.html | ||
| Column drill | |||
| Computer hardware for reconstruction and analysis | X-ray CT scanning | ||
| Cooling | |||
| Drying oven | |||
| Ethanol | |||
| Flask for under soxhlet (2000 ml) | |||
| Floral foam | https://www.oasisfloral.eu/ | Sample holder type 1 | |
| Glass beads to fill void volume of Soxhlet to save solvent | |||
| Glue | |||
| Hot water bath | https://www.memmert.com/products/water-baths/water-bath/#!filters=%7B%7D | Soxhlet extraction | |
| Increment borer | https://haglofsweden.com/project/increment-borers/ | ||
| Plastic cylinder | Moonen et al. 2022 | Sample holder type 2 | |
| Plastic cylinders | |||
| Reservoir | |||
| Tailored soxhlet apparatus | |||
| Toluene | |||
| Water pump | |||
| X-ray CT scanner |
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