"Brain Milking" -metoden for isolering av nevrale stamceller og oligodendrocyttprogenitorceller fra levende rotter
Summary
En metode for isolering av nevrale stamceller og oligodendrocytt-stamceller fra hjernen til levende rotter presenteres her i eksperimentell detalj. Det tillater flere samlinger av disse cellene fra de samme dyrene uten at det går ut over deres velvære.
Abstract
Vevsspesifikke nevrale stamceller (NSC) forblir aktive i pattedyrs postnatale hjerne. De bor i spesialiserte nisjer, hvor de genererer nye nevroner og glia. En slik nisje er den subependymale sonen (SEZ; også kalt ventrikulær-subventrikulær sone), som ligger over sideveggene i sideventriklene, ved siden av det ependymale cellelaget. Oligodendrocytt stamceller (OPCs) er rikelig fordelt over hele sentralnervesystemet, og utgjør et basseng av proliferative stamceller som kan generere oligodendrocytter.
Både NSC-er og OPC-er viser potensial for selvfornyelse og hvile-/aktiveringssykluser. På grunn av deres plassering utføres isolasjonen og eksperimentell undersøkelse av disse cellene postmortem. Her beskriver vi i detalj “hjernemelking”, en metode for isolering av blant annet NSC og OPC fra levende dyr. Dette er en to-trinns protokoll designet for bruk hos gnagere og testet på rotter. Først blir celler “frigjort” fra vevet via stereotaksisk intracerebroventrikulær (i.c.v.) injeksjon av en “frigjøringscocktail”. Hovedkomponentene er neuraminidase, som retter seg mot ependymale celler og induserer ventrikkelveggdenudasjon, et integrin-β1-blokkerende antistoff og fibroblastvekstfaktor-2. Ved et andre “samling” -trinn utføres flytende biopsier av cerebrospinalvæske fra cisterna magna, i bedøvede rotter uten behov for snitt.
Resultatene som presenteres her viser at isolerte celler beholder sin endogene profil og at NSCs av SEZ bevarer sin ro. Denudasjonen av det ependymale laget er begrenset til det anatomiske injeksjonsnivået, og protokollen (frigjøring og oppsamling) tolereres godt av dyrene. Denne nye tilnærmingen baner vei for å utføre longitudinelle studier av endogen neurogenese og gliogenese hos forsøksdyr.
Introduction
Vevsspesifikke stamceller er delvis engasjerte celler som kan gi opphav til alle cellepopulasjoner som utgjør de respektive vevene. Bortsett fra å være multipotente, er de selvfornyende celler og avgjørende for å opprettholde homeostase og regenerativ kapasitet av vev1. Noen vevsspesifikke stamceller forblir i en aktiv, sterkt proliferativ tilstand, for eksempel intestinale eller hematopoietiske stamceller. Andre, som hjernestamceller, forblir stort sett hvilende eller sovende2. I den voksne hjernen kan nevrale stamceller (NSC) finnes i spesialiserte områder, ofte kalt nisjer. To slike godt beskrevne områder finnes i subependymal sone (SEZ) i laterale ventrikler og i dentate gyrus i hippocampus. SEZ-nisjen genererer det høyeste antall celler, primært neuroblaster som migrerer mot olfaktoriske pærer og bidrar til den lokale interneuronpopulasjonen; I motsetning til dette migrerer genererte oligodendroblaster til det tilstøtende corpus callosum (CC)3. Oligodendrocytt-stamceller (OPCer) er mitotisk aktive celler, utbredt i hele sentralnervesystemet, som: i) er forpliktet til oligodendrogliallinjen, ii) kan migrere til demyeliniseringssteder, og iii) kan differensiere til myeliniserende oligodendrocytter. OPC-er viser også selvfornyelsespotensial og ro4.
Inntil nå har isolasjonen og studien av NSCs og OPCs krevd postmortem dissosiasjon av dissekert hjerne og ryggmargsvev. For å omgå denne eksperimentelle begrensningen etablerte vi en metode som for første gang tillater isolering av hjerne-NSC og OPC-er fra levende dyr. Vi kaller denne metoden “melking”, fordi den muliggjør flere samlinger av celler ettersom bassengene deres ikke er utarmet. Protokollen ble utviklet hos rotter, på grunn av deres store hjernestørrelse, hovedsakelig rettet mot SEZ, eller CC, og inkluderer to hovedtrinn. Først blir NSC eller OPCs “fjernet” fra vevet via i.c.v. injeksjon av en “frigjøringscocktail” som inneholder neuraminidase, et toksin som induserer ventrikkelveggdenudasjon, et integrin-β1-blokkerende antistoff og fibroblastvekstfaktor 2 (FGF2). Cocktailen injiseres stereotaktisk bilateralt i laterale ventrikler. Hvis den tiltenkte bruken er isolering av NSC, er rostrale områder av laterale ventrikler målrettet. Hvis målet er å isolere OPC-er renere, injiseres cocktailen kaudalt i hippocampus-fimbriaområdet. Ved et andre “samling” -trinn utføres flytende biopsier av cerebrospinalvæske (CSF) fra cisterna magna av bedøvede rotter, uten behov for et snitt. Den flytende biopsien blandes med NSC-dyrkningsmedium og kan oppbevares ved 4 °C til plettering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stam- og stamceller er relativt sparsomme i pattedyrs hjernevev. I tillegg er NSC lokalisert i områder utilgjengelige for enkle og sikre biopsier (ventrikulære vegger, hippocampus). Derfor har den eneste måten å jobbe eksperimentelt med slike celler, så langt, vært deres post mortem-isolasjon. En metode som tillater enkel eller gjentatt innsamling av NSC og OPC fra levende rotter, kalt melking, beskrives her trinn for trinn. Metoden er basert på to hovedtrekk: i) NSC eller OPCs er separert av det ependymale cellem…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et Action Medical Research (UK) stipend (GN2291) til RJMF og I.K. Forskningsarbeidet ble også delvis støttet (dyrekostnader og støtte til D.D) av Hellenic Foundation for Research and Innovation (H.F.R.I.) under “First Call for H.F.R.I. Forskningsprosjekter for å støtte fakultetets medlemmer og forskere og anskaffelse av kostbart forskningsutstyrsstipend” (prosjektnummer: 3395).
Materials
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
Riferimenti
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition Available from: https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013)
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
