살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법
Summary
살아있는 쥐의 뇌에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하는 방법이 여기에 실험적으로 자세히 제시되어 있습니다. 그것은 그들의 웰빙을 손상시키지 않고 동일한 동물로부터 이러한 세포를 여러 번 수집할 수 있습니다.
Abstract
조직 특이적 신경 줄기 세포(NSC)는 포유류의 출생 후 뇌에서 활성 상태를 유지합니다. 그들은 새로운 뉴런과 신경교세포를 생성하는 특수한 틈새에 상주합니다. 그러한 틈새 중 하나는 뇌실막하 영역(SEZ, 심실-심실하 영역이라고도 함)으로, 뇌실막 세포층에 인접한 외측 심실의 측벽을 가로질러 위치합니다. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 중추신경계 전체에 풍부하게 분포되어 있으며, 희소돌기아교세포를 생성할 수 있는 증식성 전구세포 풀을 구성합니다.
NSC와 OPC 모두 자체 갱신 잠재력과 정지/활성화 주기를 나타냅니다. 위치로 인해 이러한 세포의 분리 및 실험 조사는 사후에 수행됩니다. 여기에서는 살아있는 동물에서 다른 세포 중에서도 NSC 및 OPC를 분리하는 방법인 “뇌 착유”에 대해 자세히 설명합니다. 이것은 설치류에 사용하도록 설계되고 쥐에서 테스트된 2단계 프로토콜입니다. 첫째, 세포는 “방출 칵테일”의 입체적 뇌내 뇌실(i.c.v.) 주입을 통해 조직에서 “방출”됩니다. 주성분은 뇌실막세포를 표적으로 하여 심실벽 침상을 유도하는 뉴라미니다아제, 인테그린-β1 차단 항체, 섬유아세포 성장인자-2입니다. 두 번째 “수집” 단계에서, 뇌척수액의 액체 생검은 절개 없이 마취된 쥐에서 수조 마그나(cisterna magna)에서 수행됩니다.
여기에 제시된 결과는 분리된 세포가 내인성 프로파일을 유지하고 SEZ의 NSC가 정지를 유지한다는 것을 보여줍니다. 뇌실막층의 퇴색은 주입의 해부학적 수준으로 제한되며 프로토콜(방출 및 수집)은 동물에 의해 잘 견뎌집니다. 이 새로운 접근법은 실험 동물의 내인성 신경 발생 및 신경 형성에 대한 종단 연구를 수행하기 위한 길을 열어줍니다.
Introduction
조직 특이적 줄기세포는 각 조직을 구성하는 모든 세포 집단을 생성할 수 있는 부분적으로 커밋된 세포입니다. 다능성 외에도 자가 재생 세포이며 조직의 항상성과 재생 능력을 유지하는 데 중요합니다1. 일부 조직 특이적 줄기세포는 장 또는 조혈모세포와 같이 활성화되고 강하게 증식하는 상태로 남아 있습니다. 뇌 줄기세포와 같은 다른 세포들은 대부분 정지 상태이거나 휴면 상태로 남아 있다2. 성인의 뇌에서 신경 줄기 세포(NSC)는 종종 틈새라고 불리는 특수 영역에서 발견될 수 있습니다. 이렇게 잘 기술된 두 개의 영역은 외측 심실의 뇌막하 영역(SEZ)과 해마의 치상이랑에 존재합니다. SEZ 틈새는 가장 많은 수의 세포를 생성하며, 주로 후각 전구로 이동하여 지역 인터뉴런 개체군에 기여하는 신경아세포를 생성합니다. 대조적으로, 생성된 희소돌기아세포는 인접한 뇌량(corpus callosum, CC)3으로 이동합니다. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 중추신경계 전체에 널리 분포하는 유사분열 활성 세포로, i) 희소돌기아교세포에 전념하고, ii) 탈수초화 부위로 이동할 수 있으며, iii) 수초성 희소돌기아교세포로 분화할 수 있습니다. OPC는 또한 자체 재생 잠재력과 정지4를 나타낸다.
지금까지 NSC와 OPC의 분리 및 연구는 절개된 뇌와 척수 조직의 사후 해리가 필요했습니다. 이러한 실험적 한계를 피하기 위해 우리는 처음으로 살아있는 동물에서 뇌 NSC와 OPC를 분리할 수 있는 방법을 확립했습니다. 우리는 이 방법을 “착유”라고 부르는데, 이는 세포의 풀이 고갈되지 않기 때문에 세포를 여러 번 수집할 수 있기 때문입니다. 이 프로토콜은 뇌 크기가 크기 때문에 쥐를 대상으로 개발되었으며 주로 SEZ 또는 CC를 대상으로 하며 두 가지 주요 단계를 포함합니다. 먼저, NSC 또는 OPC는 심실 벽 침상을 유도하는 독소인 뉴라미니다아제, 인테그린-β1 차단 항체 및 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함하는 “방출 칵테일”의 i.c.v. 주입을 통해 조직에서 “제거”됩니다. 칵테일은 측심실 내에서 양측으로 입체적으로 주입됩니다. 의도된 용도가 NSC의 격리인 경우 외측 심실의 로스트랄 영역이 표적이 됩니다. OPC를 보다 순수하게 분리하는 것이 목표인 경우 칵테일은 해마 핌브리아(hippocampal fimbria) 영역에 꼬리 방향으로 주입됩니다. 두 번째 “수집” 단계에서는 절개 없이 마취된 쥐의 수조 마그나에서 뇌척수액(CSF)의 액체 생검을 수행합니다. 액체 생검은 NSC 배양 배지와 혼합되며 도금될 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
줄기세포와 전구세포는 포유류의 뇌 조직에서 상대적으로 드물다. 또한 NSC는 쉽고 안전한 생검을 위해 접근할 수 없는 영역(심실 벽, 해마)에 위치합니다. 그러므로, 지금까지 그러한 세포들을 실험적으로 다루는 유일한 방법은 사후 분리였다. 살아있는 쥐로부터 NSC와 OPC를 단일 또는 반복적으로 채취할 수 있는 방법(착유라고 함)이 여기에 단계별로 설명되어 있습니다. 이 방법은 두 가지 주요 특…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 R.J.M.F.와 I.K.에 대한 Action Medical Research(UK) 보조금(GN2291)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 그리스 연구 혁신 재단(H.F.R.I.)이 “교수진과 연구원을 지원하기 위한 H.F.R.I. 연구 프로젝트에 대한 첫 번째 요청과 고비용 연구 장비 보조금 조달”(프로젝트 번호: 3395)에 따라 부분적으로 지원되었습니다(동물 비용 및 D.D.에 대한 지원).
Materials
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
Riferimenti
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