Un metodo per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti dal cervello di ratti vivi è presentato qui in dettaglio sperimentale. Permette di raccogliere più cellule dagli stessi animali senza comprometterne il benessere.
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Articolo metodologico
Il metodo di "mungitura del cervello" per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti da ratti vivi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali neurali tessuto-specifiche (NSC) rimangono attive nel cervello postnatale dei mammiferi. Risiedono in nicchie specializzate, dove generano nuovi neuroni e glia. Una di queste nicchie è la zona subependimale (SEZ; chiamata anche zona ventricolare-subventricolare), che si trova lungo le pareti laterali dei ventricoli laterali, adiacente allo strato cellulare ependimale. Le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) sono abbondantemente distribuite in tutto il sistema nervoso centrale, costituendo un pool di cellule progenitrici proliferative che possono generare oligodendrociti.
Sia le NSC che le OPC mostrano un potenziale di auto-rinnovamento e cicli di quiescenza/attivazione. A causa della loro posizione, l'isolamento e l'indagine sperimentale di queste cellule viene eseguita post mortem. Qui descriviamo in dettaglio la "mungitura cerebrale", un metodo per l'isolamento di NSC e OPC, tra le altre cellule, da animali vivi. Si tratta di un protocollo in due fasi progettato per l'uso nei roditori e testato nei ratti. In primo luogo, le cellule vengono "rilasciate" dal tessuto tramite iniezione intracerebroventricolare stereotassica (i.c.v.) di un "cocktail di rilascio". I componenti principali sono la neuraminidasi, che prende di mira le cellule ependimali e induce la denudazione della parete ventricolare, un anticorpo bloccante l'integrina-β1 e il fattore di crescita dei fibroblasti-2. In una seconda fase di "raccolta" vengono eseguite biopsie liquide di liquido cerebrospinale dalla cisterna magna, in ratti anestetizzati senza necessità di incisione.
I risultati qui presentati mostrano che le cellule isolate mantengono il loro profilo endogeno e che le NSC della ZES conservano la loro quiescenza. La denudazione dello strato ependimale è limitata al livello anatomico dell'iniezione e il protocollo (rilascio e raccolta) è ben tollerato dagli animali. Questo nuovo approccio apre la strada all'esecuzione di studi longitudinali sulla neurogenesi endogena e sulla gliogenesi negli animali da esperimento.
Introduzione
Le cellule staminali tessuto-specifiche sono cellule parzialmente impegnate che possono dare origine a tutte le popolazioni cellulari che costituiscono i rispettivi tessuti. Oltre ad essere multipotenti, sono cellule che si autorinnovano e sono fondamentali per mantenere l'omeostasi e la capacità rigenerativa dei tessuti1. Alcune cellule staminali tessuto-specifiche rimangono in uno stato attivo e fortemente proliferativo, come le cellule staminali intestinali o ematopoietiche. Altri, come le cellule staminali cerebrali, rimangono in gran parte quiescenti o dormienti2. Nel cervello adulto, le cellule staminali neurali (N....
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Protocollo
L'allevamento, il mantenimento e le procedure sperimentali degli animali sono stati condotti in conformità con l'UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, autorizzato dal Ministero dell'Interno, e con il Decreto Presidenziale 56/2013 della Repubblica Ellenica, esaminati dagli Organi di Revisione Etica e per il Benessere degli Animali delle Università di Cambridge e Patrasso, nonché approvati e controllati dal Comitato locale per la cura e l'uso degli animali della Prefettura (Numero di protocollo: 5675/39/18-01-2021). Sono stati utilizzati ratti maschi e femmine di Sprague-Dawley, Wistar e Long-Evans, con età variabile tra i 2 e i 4 mesi e con peso corporeo compre....
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Risultati
Rilascio e raccolta di NSC
Le NSC della ZES sono separate dal liquido cerebrospinale solo dal monostrato di cellule ependimali, sebbene rimangano in contatto diretto con il contenuto ventricolare attraverso processi monociliati intercalanti 8,9. La neuraminidasi agisce in modo specifico sulle cellule ependimali attraverso la scissione dei residui di acido sialico e può indurre la denudazione della parete ventricolare. Questo .......
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Discussione
Le cellule staminali e progenitrici sono relativamente scarse nel tessuto cerebrale dei mammiferi. Inoltre, le NSC sono localizzate in aree inaccessibili per biopsie facili e sicure (pareti ventricolari, ippocampo). Pertanto, l'unico modo per lavorare sperimentalmente con tali cellule, finora, è stato il loro isolamento post mortem. Un metodo che consente la raccolta singola o ripetuta di NSC e OPC da ratti vivi, chiamato mungitura, è descritto qui passo dopo passo. Il metodo si basa su due caratteristiche chiave: i) le .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di Action Medical Research (UK) (GN2291) a R.J.M.F. e I.K. Il lavoro di ricerca è stato anche in parte sostenuto (costi animali e sostegno a D.D) dalla Fondazione ellenica per la ricerca e l'innovazione (H.F.R.I.) nell'ambito del "Primo bando per progetti di ricerca H.F.R.I. a sostegno dei membri della facoltà e dei ricercatori e l'approvvigionamento di sovvenzioni per attrezzature di ricerca ad alto costo" (numero di progetto: 3395).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| release | |||
| β Anticorpo bloccante 1-integrina | BD Biosciences | #555002 | purificato NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Qualsiasi corpo con attività bloccante dovrebbe essere appropriato. |
| Neuraminidasi da Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Le neuraminidasi provenienti da altre fonti (ad esempio, da Vibrio cholerae) non sono state testate. |
| FGF-basico umano ricombinante (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | mantenuto come 1 μ g/μ L stock, diluito in acqua sterile a -20 ° C |
| Procedure chirurgiche | |||
| 10 µ Siringa a L | Hamilton | #80330 | Modello 701 RN, ago rimovibile piccolo, calibro 26s, 2 pollici, tipo di punta 2 |
| Siringhe da insulina BD Micro-fine da 1 mL BD | biosciences | 04085-00 | 29 G x 12,7 mm |
| TAGLIO BETADINE. SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenofina 0,3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| monitoraggio omeoretermico | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1.000 mg/g vapore per inalazione, liquido | Vetpharma Salute degli animali | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: | Ketamina 100 mg/mL |
| Sutura in nylon, Ethilon | Ethicon | D9635 | Trasparente, misura 5-0 |
| Trimmer chirurgici senza fili ricaricabili | Stoelting | Articolo: 51472 | |
| Lame per bisturi, sterili | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr.; 8-pollici Tamponi | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotassico ad alta velocità | trapano Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting' s Kit di strumenti stereotassici | Stoelting | Articolo: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xilazina, 25 mL< |
| strong>Manipolazione di tessuti e cellule e immunocolorazioni | |||
| 96 pozzetti piastre appropriate per microscopia | Greiner | #655866 | Supplemento |
| B27 per micropiastre a stella ScreenThermoFisher Scientific | A1486701 | ||
| Albumina sierica bovina (BSA) | Merck | P06-1391100 | Frazione V, shock termico |
| Citrato | Merck | 71497 | Citrato di sodio monobasico |
| Criostato | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Colorazione nucleare, Diluizione: 1/1.000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | Alto glucosio, piruvato |
| d'asino anti-capra | Biotium | 20016 o 20106 o 20048 | Diluizione: 1/1.000 |
| asino anti-topo | Biotium | 20014 o 20105 o 20046 | Diluizione: 1/1.000 |
| asino anti-coniglio | Biotium | 20015 o 20098 o 20047 | Diluizione: 1/1.000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (o bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| capra anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Diluizione: 1/500 |
| capra anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Diluizione: 1/200 |
| topo anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Diluizione: 1/200 |
| topo anti-S100β | Sigma | S2532 | Diluizione: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Terreno di montaggio |
| Integratore di N2 | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1,0 mg/mL |
| di coniglio anti-Doublecortina (DCX) | Abcam | ab18723 | Diluizione: 1/500 |
| coniglio anti-PDGFR&alfa; | Abcam | ab51875 | Diluizione: 1/200 |
| coniglio anti-β- catenina | Abcam | ab16051 | Diluizione: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopia e analisi delle immagini | |||
| Microscopio confocale | Leica | SP6 e SP8 | |
| Analisi delle immagini | NIH, USA | ImageJ | |
| Analisi delle immagini | Leica | LasX |
Riferimenti
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal....
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Ristampe e permessi
