Summary
In Kombination mit einer Kopfplatte und einem optischen Design, das sowohl mit Einzel- als auch mit Zwei-Photonen-Mikroskopen kompatibel ist, bietet die Mikroprismenlinse einen erheblichen Vorteil bei der Messung neuronaler Reaktionen in einer vertikalen Säule unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich gut kontrollierter Experimente in kopffesten Zuständen oder natürlicher Verhaltensaufgaben bei frei beweglichen Tieren.
Abstract
Mit dem Fortschritt der Multiphotonenmikroskopie und der molekularen Technologien entwickelt sich die Fluoreszenzbildgebung schnell zu einem leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der Struktur, Funktion und Plastizität lebender Hirngewebe. Im Vergleich zur herkömmlichen Elektrophysiologie kann die Fluoreszenzmikroskopie sowohl die neuronale Aktivität als auch die Morphologie der Zellen erfassen und so Langzeitaufnahmen der identifizierten Neuronenpopulationen mit Einzelzell- oder subzellulärer Auflösung ermöglichen. Hochauflösende Bildgebung erfordert jedoch typischerweise einen stabilen, kopffesten Aufbau, der die Bewegung des Tieres einschränkt, und die Herstellung einer flachen Oberfläche aus transparentem Glas ermöglicht die Visualisierung von Neuronen auf einer oder mehreren horizontalen Ebenen, ist jedoch bei der Untersuchung der vertikalen Prozesse, die über verschiedene Tiefen verlaufen, begrenzt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Kombination einer Kopfplattenfixierung und eines Mikroprismas, das eine mehrschichtige und multimodale Bildgebung ermöglicht. Dieses chirurgische Präparat ermöglicht nicht nur den Zugang zur gesamten Säule des visuellen Kortex der Maus, sondern ermöglicht auch die Zwei-Photonen-Bildgebung in einer kopffesten Position und die Ein-Photonen-Bildgebung in einem frei beweglichen Paradigma. Mit diesem Ansatz kann man identifizierte Zellpopulationen über verschiedene kortikale Schichten hinweg beproben, ihre Reaktionen unter kopffesten und frei beweglichen Zuständen registrieren und die langfristigen Veränderungen über Monate hinweg verfolgen. Somit bietet diese Methode einen umfassenden Assay der Mikroschaltkreise, der einen direkten Vergleich neuronaler Aktivitäten ermöglicht, die durch gut kontrollierte Reize und unter einem natürlichen Verhaltensparadigma hervorgerufen werden.
Introduction
Das Aufkommen der In-vivo-Zwei-Photonen-Fluoreszenzbildgebung 1,2, die die neuen Technologien in optischen Systemen und genetisch veränderte Fluoreszenzindikatoren kombiniert, hat sich zu einer leistungsstarken Technik in den Neurowissenschaften entwickelt, um die komplizierte Struktur, Funktion und Plastizität im lebenden Gehirn zu untersuchen 3,4. Insbesondere bietet diese Bildgebungsmodalität einen beispiellosen Vorteil gegenüber der herkömmlichen Elektrophysiologie, indem sie sowohl die Morphologie als auch die dynamischen Aktivitäten von Neuronen erfasst und dadurch die Langzeitverfolgung identifizierter Neuronen erleichtert 5,6,7,8.
Trotz ihrer bemerkenswerten Stärken erfordert die Anwendung der hochauflösenden Fluoreszenzbildgebung oft einen statischen, am Kopf fixierten Aufbau, der die Mobilität des Tieres einschränkt 9,10,11. Darüber hinaus beschränkt die Verwendung einer transparenten Glasoberfläche zur Visualisierung von Neuronen die Beobachtungen auf eine oder mehrere horizontale Ebenen, was die Erforschung der Dynamik vertikaler Prozesse, die sich über verschiedene kortikale Tiefen erstrecken, einschränkt12.
Um diese Einschränkungen zu beheben, skizziert die vorliegende Studie ein innovatives chirurgisches Verfahren, das Kopfplattenfixierung, Mikroprisma und Miniskop integriert, um eine Bildgebungsmodalität mit mehrschichtigen und multimodalen Fähigkeiten zu schaffen. Das Mikroprisma ermöglicht die Beobachtung der vertikalen Verarbeitung entlang der kortikalen Säule 13,14,15,16, was entscheidend ist, um zu verstehen, wie Informationen verarbeitet und transformiert werden, wenn sie sich durch verschiedene Schichten des Kortex bewegen, und wie die vertikale Verarbeitung während plastischer Veränderungen verändert wird. Darüber hinaus ermöglicht es die Abbildung derselben neuronalen Populationen in einem kopffixierten Paradigma und in einer frei beweglichen Umgebung, die die vielseitigen experimentellen Einstellungen umfasst 17,18,19: Zum Beispiel ist die Kopffixierung oft für gut kontrollierte Paradigmen wie die Bewertung der Sinneswahrnehmung und stabile Aufzeichnungen unter dem 2-Photonen-Paradigma erforderlich, während die freie Bewegung eine natürlichere, flexiblere Umgebung für Verhaltensstudien bietet. Daher ist die Fähigkeit, einen direkten Vergleich in beiden Modi durchzuführen, entscheidend, um unser Verständnis der Mikroschaltungen zu verbessern, die flexible, funktionale Reaktionen ermöglichen.
Im Wesentlichen bietet die Integration von Kopfplattenfixierung, Mikroprisma und Miniskop in die Fluoreszenzbildgebung eine vielversprechende Plattform, um die Feinheiten der Struktur und Funktionalität des Gehirns zu untersuchen. Forscher können identifizierte Zellpopulationen über verschiedene Tiefen hinweg über alle kortikalen Schichten hinweg beproben, ihre Reaktionen sowohl in gut kontrollierten als auch in natürlichen Paradigmen direkt vergleichen und ihre langfristigen Veränderungen über Monate hinweg überwachen20. Dieser Ansatz bietet wertvolle Einblicke in die Interaktion und Veränderung dieser neuronalen Populationen im Laufe der Zeit unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und bietet einen Einblick in die dynamische Natur neuronaler Schaltkreise.
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Protocol
Alle Experimente wurden gemäß dem UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 unter persönlichen und Projektlizenzen durchgeführt, die vom britischen Innenministerium nach entsprechender Ethikprüfung genehmigt und ausgestellt wurden. adulte transgene Linien CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 wurden gezüchtet und ihre Nachkommen im Experiment verwendet. Zur Sicherheit der Experimentatoren und zur Aufrechterhaltung steriler Bedingungen wurden alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen und mit vollständiger persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt.
1. Präoperative Vorbereitung
- Um Ödeme zu minimieren, verabreichen Sie Dexamethason (0,2 mg/kg) subkutan 12-24 Stunden vor der Operation.
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven und sterilisieren Sie den Operationsbereich vor der Operation mit stabilisierter hypochloriger Säure mit destilliertem Wasser und 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Geräte eingeschaltet sind.
- Betäuben Sie das Tier (24 Wochen alt, männlich mit einem Gewicht von 31 g) mit Isofluran mit einer Induktionsdosis von 5%, die auf 1%-2% reduziert wird, sobald sich die Maus auf dem stereotaktischen Rahmen befindet, wobei O2 zwischen 1-2 l/min gehalten wird. NSAIDs (Carprofen, 2,5 mg/kg) subkutan injizieren.
- Überprüfen Sie, ob kein Zehenklemmreflex vorhanden ist, um die Tiefe der Anästhesie zu beurteilen (erhöhen Sie die Isoflurankonzentration in Schritten von 0,5 %, wenn ein Reflex zu sehen ist).
- Rasieren Sie den Kopf des Tieres mit einem Trimmer von hinter den Ohren bis etwas über den Augen. Reinigen Sie diesen Bereich mit einem Alkoholtuch und einer Povidon-Jod-Lösung, wobei Sie darauf achten, den Kontakt mit den Augen des Tieres zu vermeiden.
- Montieren Sie das Tier auf das homöotherme Heizkissen und den stereotaktischen Rahmen, der mit Ohr- und Zahnstangen ausgestattet ist, und befestigen Sie den Kopf. Stellen Sie sicher, dass der Kopf stabil ist, da dies für den Erfolg des folgenden Verfahrens entscheidend ist (Abbildung 1).
- Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen während der Operation zu verhindern, und decken Sie sie mit Folie ab, um sie vor Licht zu schützen. Decken Sie das Tier mit einer sterilen OP-Abdeckung ab.
Abbildung 1: Vorbereitung vor der Operation. Die Maus wird auf den stereotaktischen Rahmen gelegt, der durch ein Nasenstück und Ohrbügel gesichert ist. Die Maus wird auf ein temperaturgeregeltes Heizkissen gelegt. Die Augen haben eine Augensalbe und sind mit Aluminiumfolie bedeckt. Der Kopf wird rasiert und der Schädel freigelegt. Eine sterile Abdeckung wird über das Tier gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Kraniotomie
- Schneiden Sie die Haut mit einer chirurgischen Schere entlang der Mittellinie des rasierten Kopfbereichs ein, um den Schädel freizulegen.
- Reinigen Sie den Schädel mit einem sterilen Wattestäbchen und verdünntem Wasserstoffperoxid (3 % w/v von 35 % H2O2 in 97 % dH2O) für 1-3 s, um jegliches Bindegewebe zu entfernen (Abbildung 2A). Trocknen Sie den Schädel mit einem Tropfen 70% Ethanol und einem neuen sterilen Wattestäbchen.
- Richten Sie den Schädel anterior/posterior (AP) und medial/lateral (ML) aus, um eine genaue Implantationsstelle zu gewährleisten. Messen Sie dazu die dorsoventrale (DV) Tiefe des Schädels sowohl bei Bregma als auch bei Lambda und stellen Sie sicher, dass die Differenz zwischen den beiden <0,03 mm beträgt. Messen Sie für die mediolaterale Ausrichtung äquidistante Punkte an beiden Parietalknochen von der Mittellinie und stellen Sie erneut sicher, dass die DV-Differenz <0,03 mm beträgt.
- Suchen und markieren Sie mit Bregma als Ursprung den gewünschten kortikalen Bereich. hier sind dies der monokulare primäre visuelle Kortex (V1), AP: -3,5 mm, ML: -2,5 mm.
- Verwenden Sie einen Trepanbohrer (1,8 mm Durchmesser) und einen Dentalbohrer (10.000 U/min Geschwindigkeit), um den Kortex freizulegen, und stellen Sie sicher, dass sich die Markierung für den gewünschten kortikalen Bereich (monokular V1) im unteren Drittel des Bohrerfensters befindet.
- Stellen Sie sicher, dass der Winkel des Bohrers senkrecht zur Krümmung des Schädels steht. Dies gewährleistet eine gleichmäßige Kraniotomie und verhindert eine Schädigung der Dura oder des Kortex.
- Bohren Sie, bis der Widerstand abnimmt, und stoppen Sie dann (Abbildung 2B). Entfernen Sie das abgelöste Knochenfragment vorsichtig mit einer 23G-Nadelspitze (Abbildung 2C).
- Reinigen Sie die freiliegende Hirnrinde mit chirurgischem Schaum, der mit kalter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) getränkt ist, um Schmutz zu entfernen und eventuell auftretende Blutungen zu stoppen.
- Halten Sie den exponierten Kortex während der gesamten Operation immer mit kaltem ACSF hydratisiert.
Abbildung 2: Kraniotomie. (A) Hautschnitt zwischen Bregma und Lambda ist dargestellt. Bindegewebe wurde von der freiliegenden Oberfläche entfernt. (B) Kraniotomie durch Trepanbohrer vor Entfernung des Knochenfragments. (C) Kraniotomie nach Entfernung des Knochenfragments mit intakter Dura und Kortex (Maßstabsbalken 0,5 mm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
3. Vorgeschnittener Schnitt
HINWEIS: Um bei der Durchführung des Precut-Schnitts berücksichtigt zu werden, müssen die Inzision und die Mikroprismenimplantation vor der Bildgebungsregion von Interesse (ROI) liegen. Dies soll ein vollständiges und genaues Sichtfeld ermöglichen. Im Rahmen dieses Protokolls wird die Inzision entlang der mediolateralen Achse durchgeführt, und das Mikroprisma ist nach hinten ausgerichtet (Abbildung 3B).
- Um das Einführen zu erleichtern und den Druck in der Hirnrinde während des Einsetzens des Mikroprismas zu verringern, machen Sie einen Schnitt.
- Befestigen Sie das chirurgische Messer an der stereotaktischen Armhalterung und richten Sie die Klinge oder den stereotaktischen Arm so aus, dass sie entlang der ML-Achse schneidet.
- Bewegen Sie das Messer auf die gewünschte AP-Koordinate (AP: -3,4 mm); Das Prisma muss sich vor dem ROI befinden, also machen Sie den Schnitt 100 μm vor der ROI-AP-Koordinate der Bildgebung (-3,5 mm).
- Bewegen Sie nun das Messer zum medialen Rand der Kraniotomie, wo es auf den Schädel trifft, senken Sie das Messer langsam ab, bis es den Knochen erreicht, und stoppen Sie dann. Da die Knochendicke 200 μm beträgt, beziehen Sie diesen Wert in die Gesamteinstichtiefe ein (siehe Schritt 5.1 Berechnung).
- Die optimale Bildgebung befindet sich in der Mitte des Prismas, d. h. 500 μm; Stellen Sie daher sicher, dass diese Tiefe mit der Tiefe der kortikalen Säule übereinstimmt (ROI DV: - 0,35 mm).
- Wenn Sie die Dicke des Schädels in die Tiefenberechnung einbeziehen, verwenden Sie die folgende Gleichung, die bestimmt, wie tief der vorgeschnittene Schnitt von der Schädeloberfläche aus sein muss. Für dieses Protokoll wird die Einnistungstiefe wie folgt berechnet:
Knochendicke (200 μm) + ROI der Bildgebung (z. B. 350 μm) + verbleibende Mikroprismentiefe (500 μm) = 1.050 μm
- Wenn Sie die Dicke des Schädels in die Tiefenberechnung einbeziehen, verwenden Sie die folgende Gleichung, die bestimmt, wie tief der vorgeschnittene Schnitt von der Schädeloberfläche aus sein muss. Für dieses Protokoll wird die Einnistungstiefe wie folgt berechnet:
- Stellen Sie sicher, dass die Länge des Einschnitts mehr als 1 mm, aber nicht übermäßig ist. daher ist ein Abstand von 1,2 mm ideal, wobei die monokulare ML-Koordinate in der Mitte dieses Abstands liegt.
- Wenn Sie bereit sind, den Schnitt durchzuführen, entfernen Sie überschüssiges ACSF, damit die Sicht nicht beeinträchtigt wird (Abbildung 3A).
- Bewegen Sie das Messer vom medialen Rand der Kraniotomie zur beginnenden medialen Koordinate des Schnitts. Senken Sie das Messer langsam (10 μm/s) in den Kortex ab.
- Sobald die Dura durchstochen ist und das Messer in den Kortex eingedrungen ist, tragen Sie einen Tropfen kaltes ACSF auf den Kortex auf, um das Gewebe während des Einschnitts geschmiert und hydratisiert zu halten.
- Sobald die Endtiefe erreicht ist, beginnen Sie, das Messer entlang der ML-Achse zu bewegen (mit einer Geschwindigkeit von 10 μm/s).
- Beobachten Sie weiterhin das umgebende Gewebe, während der Schnitt gemacht wird. Wenn das Gewebe mit dem Messer mitschleift, bewegen Sie das Messer einige Male auf und ab, um sicherzustellen, dass das Gewebe geschnitten wird, und fahren Sie dann seitlich fort, wobei Sie daran denken, das Messer wieder auf seine endgültige Tiefe zu bringen.
- Wenn Sie fertig sind, heben Sie das Messer langsam an. Wenn während des Einschnitts Blut austritt, nutzen Sie diese Zeit, um die Inzisionsstelle mit ACSF-getränktem chirurgischem Schaum zu reinigen, um das Blut zu verdünnen und das Blut innerhalb des Einschnitts herauszudrücken. Denken Sie daran, einen frischen, gesättigten chirurgischen Schaum über dem freiliegenden Kortex zu hinterlassen, bis Sie bereit sind, das Mikroprisma einzusetzen.
Abbildung 3: Mikroprismenimplantation. (A) Vorgeschnittener Schnitt. (B) Schematische Darstellung der integrierten Mikroprismenlinse, die ihre Position im Kortex demonstriert (C) Integrierte Mikroprismenlinse in der richtigen Ausrichtung für den vorgeschnittenen Schnitt vor dem Einsetzen in den Kortex (Maßstabsbalken steht für 0,5 mm). (D) Beispiel für Zementablagerungen um die integrierte Linse herum, um ihre Befestigung am Schädel zu sichern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
4. Einsetzen von Mikroprismen und Implantation von Kopfplatten
- Die Mikroprismenlinse besteht aus einer Gradientenindexlinse, die am distalen Ende der Linse an einem Prisma befestigt ist, das in eine Grundplatte integriert ist. Befestigen Sie das Mikroprisma am Implantat-Kit.
- Stellen Sie sicher, dass die Abbildungsseite des Prismas der Grundplattenschraube gegenüberliegt. Um das Einsetzen und Platzieren des Mikroprismas zu erleichtern, befestigen Sie es am stereotaktischen Rahmen und richten Sie das Prisma so aus, dass es mit dem Einschnitt ausgerichtet ist (Abbildung 3C).
- Senken Sie das Mikroprisma langsam in die Inzisionsstelle ab (10 μm/s). Denken Sie daran, ACSF beim ersten Einsetzen des Prismas zu entfernen, aber sobald Sie sich in der Rinde befinden, spülen Sie es mit kaltem ACSF, um das Einsetzen zu schmieren.
- Der Kortex sollte stabil bleiben, während das Prisma in den Einschnitt abgesenkt wird; wenn nicht, fügen Sie zusätzliches ACSF hinzu und bewegen Sie den Kortex, indem Sie das Prisma auf und ab bewegen, um den Kortex vom Prisma zu lösen.
- Sobald die endgültige Tiefe erreicht ist, trocknen Sie die freiliegende kortikale Oberfläche mit sterilem Gewebe und achten Sie darauf, das Prisma nicht zu berühren.
- Decken Sie den freiliegenden kortikalen Bereich um das Prisma sowie die Linse mit einer Schutzschicht aus Silikonkleber ab, um überschüssigen Klebstoff auf dem umgebenden Schädel und dem Dummy-Zielfernrohr zu minimieren.
- Nach der Aushärtung (5-10 min) befestigen Sie die Kopfplatte am Schädel, um den Kopf während der kopffixierten Bildgebung zu stabilisieren.
- Stellen Sie sicher, dass die Kopfplatte hinten genug ist, um die Platzierung des Implantats nicht zu beeinträchtigen und einen angemessenen Zementauftrag zu ermöglichen, um das Implantat richtig zu sichern.
- Stellen Sie sicher, dass die Mittellinie der Kopfplatte leicht rechts von der implantierten Linse liegt, um sicherzustellen, dass beide Seiten der Kopfplatte bei der Durchführung von kopffesten Experimenten am Kopftisch befestigt werden können
- Tragen Sie Klebezement auf die Kopfplatte und den Schädel auf.
- Bereiten Sie adhäsiven Zahnzement vor, indem Sie 1 Messlöffel undurchsichtiges Zementpulver mit 4 Tropfen Mischmedium mischen und einen Tropfen des Katalysators auftragen.
- Tragen Sie Zement sowohl auf die Kopfplatte als auch auf den Schädel auf und halten Sie die Kopfplatte an Ort und Stelle, bis sie ausgehärtet ist, und stellen Sie sicher, dass sie parallel zu den Ohrstangen verläuft (durch Sichtprüfung sowohl von oben als auch hinter dem Kopf des Tieres untersuchen).
- Tragen Sie Klebezement auf, um den Rest des freiliegenden Schädels und Gewebes zu bedecken, und integrieren Sie das Mikroprisma (bis zur Basis der Basisplatte) und die Kopfplatte.
- Holen Sie sich keinen Zement auf die Grundplatte, das Dummy-Mikroskop oder eine seiner Komponenten. Tragen Sie den Klebezement so lange auf, bis das Mikroprisma und die Kopfplatte bedeckt und stabil sind (Abbildung 3D).
- Wenn der Zement ausgehärtet ist, nehmen Sie das Dummy-Mikroskop ab, indem Sie den stereotaktischen Arm langsam nach oben bewegen, während Sie das Mikroprisma mit einer Pinzette stabilisieren (sie sind durch Magnete verbunden, daher kann ein gewisser Widerstand während der Trennung zu spüren sein).
- Setzen Sie die Schutzabdeckung auf das Objektiv und ziehen Sie die Schraube fest, um sie zu sichern.
- Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen, lassen Sie es sich in einer warmen Aufwachbox erholen und verabreichen Sie erwärmte sterile 0,9%ige Kochsalzlösung subkutan (3% des Körpergewichts).
- Sobald das Tier wach ist und sich bewegt, setzen Sie es wieder in einen sauberen Käfig mit einem Stall. Überwachen Sie das Tier und verabreichen Sie zusätzliche postoperative Analgesie gemäß den Richtlinien der örtlichen Institution zur Analgesie.
- Warten Sie 4 Wochen nach der Operation, das Tier sollte für die Bildgebung bereit sein.
5. Ein-Photonen-Kalzium-Bildgebung von kortikalen Schichten in frei beweglichen Mäusen
HINWEIS: Es ist wichtig, jedes Mal Bilder aus der ursprünglichen Bildgebungssitzung zu verwenden, um eine genaue Erfassung der beabsichtigten Bildgebungsebene zu gewährleisten. Diese identifizierten Orientierungspunkte spielen zusammen mit den Neuronen eine entscheidende Rolle in dem in Schritt 9 des Protokolls ausführlich beschriebenen Ausrichtungsprozess. Bei der Erfassung von Ein-Photonen-Daten ist das Miniskop sowohl das Bildgebungssystem als auch die Laserquelle. Die Anregung verwendet LED mit einem Leistungsbereich von 0-2 mW/mm2 an der Objektivfrontfläche. Der Laser verwendet eine Anregungswellenlänge von 455 ± 8 nm (blaues Licht) für die GCaMP-Signalgebung. Mit dem Schieberegler für den Objektivfokus kann der Fokus (Z-Achse) eingestellt werden, der auf der Benutzeroberfläche als 0-1000 dargestellt wird, wobei 0 für einen Arbeitsabstand von 0 μm und 1000 für den maximalen Arbeitsabstand von 300 μm steht.
- Lassen Sie das Tier vor der Datenerfassung 1 Stunde vor der Aufnahmesitzung 1 Stunde lang an den Raum und die offene Arena gewöhnen.
- Desinfizieren und reinigen Sie vor der Bildgebung alles mit geeigneten Desinfektionsmitteln (z. B. stabilisierte hypochlorige Säure mit destilliertem Wasser und 70 % Ethanol).
- Richten Sie die DAQ-Box ein, indem Sie sie an einen Computer anschließen und die Datenerfassungssoftware starten. Stellen Sie eine direkte Verbindung über ein Ethernet-Kabel her, um verlorene Frames zu minimieren. Der drahtlose Verbindungsmodus kann jedoch je nach Stärke der drahtlosen Verbindung ausreichen.
- Befestigen Sie das Miniskop an der Grundplatte des Tieres unter einem sanften Genick.
- Entfernen Sie zunächst die Schutzabdeckung von der Grundplatte, indem Sie die Stellschraube lösen. Halten Sie die Abdeckung mit einer Pinzette an der Öffnung fest. Befestigen Sie dann das Miniskop an der Grundplatte, auf der die Abdeckung sitzt.
- Überprüfen Sie die Ausrichtung des Miniskops in Bezug auf die Grundplatte, bevor Sie es so installieren, dass die Seite mit der Markierung der Schraube zur Schraube zeigt.
- Sobald das Miniskop angebracht ist, ziehen Sie die Stellschraube fest, um es zu stabilisieren. Schieben Sie die Stellschraube nur so lange vor, bis ein gewisser Widerstand zu spüren ist. Ein zu festes Anziehen der Stellschraube würde das Miniskop möglicherweise beschädigen und sollte daher vermieden werden.
- Schließen Sie das Miniskop an die DAQ-Box an und bereiten Sie die Software für die Aufnahme vor.
- Schalten Sie in der Datenerfassungssoftware den Stream für das Miniskop ein und passen Sie die Aufnahmeparameter (Bildrate, Verstärkung, LED-Leistung, Efokus-Wert) an, um ein klares Sichtfeld zu erzielen (Abbildung 4A).
- Schalten Sie das Histogrammfenster ein und stellen Sie die Verstärkung und die LED-Leistung so ein, dass die aufgezeichnete Intensität zwischen 35 % und 70 % liegt.
- Wenn Sie eine Längsschnittstudie durchführen, beziehen Sie sich auf die Aufzeichnungen oder Schnappschüsse, die in einer früheren Sitzung aufgenommen wurden, und passen Sie den Efokus-Wert so an, dass dieselbe Bildebene deutlich zu sehen ist.
- Starten Sie das Experiment und die Datenerfassung.
- Entfernen Sie das Tier nach Abschluss des Experiments aus dem Verhaltensapparat.
- Lösen Sie unter einem sanften Scruff die Stellschraube und entfernen Sie das Miniskop von der Grundplatte des Tieres.
- Setzen Sie die Schutzabdeckung wieder auf die Grundplatte und stabilisieren Sie sie mit der Stellschraube.
- Bringen Sie das Tier in seinen Heimatkäfig zurück (fahren Sie mit Schritt 7 fort, wenn Sie Ein-Photonen-Daten verarbeiten möchten).
Abbildung 4: Datenerfassung und -verarbeitung mit Software. (A) Ein Bild, das den Echtzeit-Stream des Miniskops zeigt. Es wird empfohlen, den Fokuswert des Objektivs so anzupassen, dass im Streaming-Fenster eine klare Sicht zu sehen ist, zusammen mit der Verstärkung und der Abbildungslaserleistung. (B) Schematische Grafik, die den empfohlenen Ausrichtungsablauf für Sitzungen veranschaulicht, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgezeichnet wurden. Es wird empfohlen, von der ersten Sitzung an ein mittleres Bild zu generieren und dabei den Anweisungen der Datenverarbeitungssoftware zu folgen. Dieses Bild sollte als Referenzbild bei der Bewegungskorrektur für die folgenden Sitzungen verwendet werden. (C) Beispiele für vier Zellen aus demselben maximal projizierten ΔF/F-Bild. Über jede Zelle wird eine orangefarbene Linie gezogen, um ihren Zelldurchmesser in Pixeln zu messen, deren Durchschnitt als Eingabeargument für den Zellidentifikationsalgorithmus verwendet wird (oben links: 13, oben rechts: 11, unten links: 12, unten rechts: 13). (D) Ausgabe des Zellidentifikationsalgorithmus nach manueller Kuration (Bild beschnitten). Weiße Umrisse stellen die identifizierten Zellen dar (Maßstabsbalken steht für 100 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
6. Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung von kortikalen Schichten bei kopffixierten Mäusen
HINWEIS: Bei der Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie ist die Lichtquelle ein durchstimmbarer Ultrakurzpulslaser mit einer Anregungswellenlänge von 920 nm. Die am Objektiv gemessene Anregungsleistung lag typischerweise zwischen 100 und 150 mW und wurde in jeder Sitzung angepasst, um ähnliche Fluoreszenzwerte zu erreichen. Das Emissionslicht wurde durch einen Emissionsfilter (525/70 nm) gefiltert und mit einer unabhängigen Photomultiplier-Röhre (PMT) gemessen, die als grüner Kanal bezeichnet wird. Die Bilder wurden mit einem 20-fachen Luftimmersionsobjektiv (NA = 0,45, 6,9-8,2 mm Arbeitsabstand) aufgenommen.
- Gewöhnen Sie das Tier vor der Datenerfassung in den Tagen zuvor an das Gerät (damit sich das Tier mit dem Verhaltensaufbau vertraut macht). Lassen Sie das Tier 2-3 Tage lang 15-30 Minuten pro Tag damit verbringen, das Setup zu erkunden oder bis es ein naturalistisches Verhalten zeigt, bevor es mit der Datenerfassung beginnt.
- Schalten Sie das Zwei-Photonen-Bildgebungssystem ein, starten Sie die Erfassungssoftware und schalten Sie den Laser ein. Stellen Sie sicher, dass die Laser ausgeschaltet und die PMTs ausgeschaltet sind, bevor Sie fortfahren.
- Reinigen Sie das Zwei-Photonen-Bildgebungsgerät mit stabilisierter hypochloriger Säure mit destilliertem Wasser und 70% Ethanol.
- Stellen Sie sicher, dass Sie das Gerät an die Größe des Tieres anpassen. Befestigen Sie die Maus und ihre Kopfplatte vorsichtig am Kopftisch-Setup und schrauben Sie sie fest, um den Kopf der Maus zu stabilisieren.
- Entfernen Sie nach dem Anbringen die Objektivabdeckung (siehe Schritt 5.4.1) und richten Sie das Objektiv so aus, dass es sich über der Grundplatte befindet.
- Verwenden Sie die Epifluoreszenz- und XYZ-Tischsteuerungen, um das kortikale Gewebe in den Fokus zu rücken.
- Sobald die kortikalen Schichten sichtbar sind, schalten Sie das Mikroskop um, um eine Zwei-Photonen-Bildgebung zu ermöglichen (tauschen Sie den Spiegel gegen den dichroitischen Spiegel aus, schließen Sie den Fluoreszenzverschluss und schalten Sie den Epifluoreszenzlaser und den Monitor aus). Stellen Sie sicher, dass die Hauptlichter ausgeschaltet sind, um die PMTs beim Fotografieren zu schützen.
- Richten Sie Parameter ein, um die erfassten Bilddateien zu optimieren.
- Verwenden Sie den resonanten Erfassungsmodus für die Kalziumbildgebung, da er das schnelle Abfeuern von GCaMP-Signalen erfassen kann.
- Passen Sie die Laserleistung, die PMT-Verstärkung, den Zoom und die Lookup-Tabellen (LUTs) an, um ein optimales Bild zu erhalten, und beziehen Sie sich auf das Ein-Photonen-Bild, um sicherzustellen, dass die richtige Brennebene abgebildet wird.
- Beginnen Sie mit der Bildgebung kortikaler Schichten mit dem Zwei-Photonen-System mit synchronisierter Verhaltensüberwachung und Stimuluseingaben (falls zutreffend).
- Stellen Sie sicher, dass Sie diese Erfassungsparameter und XYZ-Abstände speichern, wenn Sie identische Bilder im Laufe der Zeit reproduzieren möchten.
- Um einen Z-Stapel der kortikalen Schichten zu erfassen, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
- Suchen Sie die Ebene, von der aus der Z-Stapel gestartet werden soll, passen Sie die Aufnahmeparameter an, um das Bild zu optimieren, und markieren Sie dies als Startpunkt in der Software.
- Bewegen Sie sich als Nächstes mit dem Z-Steuerelement den Stapel nach unten, passen Sie nur die Laserleistung an, um eine konstante Leuchtdichte des Stapels aufrechtzuerhalten, und markieren Sie das Ende des Stapels in der Software.
- Kritischer Schritt: Mit der Option Relativer exponentieller Gradient auf der Registerkarte Laserleistungsverlauf kann die Software die Zunahme der Laserleistung berechnen, während sie sich durch den Z-Stapel bewegt. Notieren Sie sich unbedingt die Endpunkt-Laserleistungswerte in der von der Software bereitgestellten Tabelle, damit sie den Gradienten berechnen kann.
- Sobald die Z-Stapel-Parameter eingestellt sind, passen Sie die Schrittweite (μm) an.
HINWEIS: Die Schrittgröße bestimmt die benötigte Zeit, die Anzahl der Schichten und die Detailqualität des Stapels. Kleinere Schrittgrößen führen zu einer längeren Erfassungszeit, einer Erhöhung der Anzahl der Schichten und besseren Details im Vergleich zu größeren Schritten. Z-Stapel werden verwendet, um die Registrierung von Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Bildern zu unterstützen, da sie alle anatomischen Orientierungspunkte oder Merkmale hervorheben.
- Um eine Zeitreihe (T-Serie) von Kalziumveränderungen in Neuronen zu erfassen, finden Sie mit den XYZ-Tischreglern eine optimale Fokusebene und passen Sie die Laserleistung, die PMT-Verstärkung, den Zoom und die LUTs an.
- Definieren Sie auf der Registerkarte T-Serie in der Erfassungssoftware die Parameter der Erfassungsfrequenz, die mit den mit dem Ein-Photonen-Bildgebungssystem erfassten Daten übereinstimmen.
HINWEIS: Durch den Abgleich der Frequenz werden die 1P- und 2P-Daten vergleichbar und sie eignen sich besser für den Zellidentifikationsalgorithmus, der in den Datenverarbeitungsschritten verwendet wird. Mehrere Trigger und andere Erfassungsmodi können in die Erfassung der T-Serie integriert werden.
- Definieren Sie auf der Registerkarte T-Serie in der Erfassungssoftware die Parameter der Erfassungsfrequenz, die mit den mit dem Ein-Photonen-Bildgebungssystem erfassten Daten übereinstimmen.
- Beginn der Übernahme der T-Serie.
7. Verarbeitung von Ein-Photonen-Calcium-Bildgebungsdaten
- Verwenden Sie für die Aufnahme von Ein-Photonen-Filmen die Datenverarbeitungssoftware, die mit dem Miniscope-System geliefert wird.
- Verarbeiten Sie den Film zunächst durch räumliches und zeitliches Downsampling vor. Im Allgemeinen würde ein räumliches Downsampling des Films um den Faktor zwei die Verarbeitungszeit erheblich verkürzen, ohne die Genauigkeit der Zellidentifikation ernsthaft zu beeinträchtigen.
- Stellen Sie den temporalen Downsampling-Faktor so ein, dass die Bildrate des Films auf etwa 10 Hz gesenkt wird, was für den in den folgenden Schritten verwendeten Zellidentifikationsalgorithmus besser geeignet ist.
- Wenn Sie mehrere Filme am selben Bildtag aufnehmen, kombinieren Sie die Filme vor dem Vorverarbeitungsschritt zu einer Zeitreihe, um sie zusammen zu verarbeiten.
- Optional: Wenden Sie einen räumlichen Bandpassfilter auf den Film an, um die unteren und höheren Ortsfrequenzen zu entfernen, was zu einem glatteren Film mit höherem Kontrast führt.
- Registrieren Sie den Film mit der Bewegungskorrekturfunktion der Software. Dadurch wird der Film registriert und Bewegungsartefakte korrigiert, die durch die Bewegung des Miniskops relativ zur Bildoberfläche verursacht werden.
- Kritischer Schritt: Wenn Sie eine Längsschnittstudie durchführen, registrieren Sie die Filme im selben Sichtfeld, z. B. das mittlere Bild des Films, der am ersten Bildgebungstag aufgenommen wurde (Abbildung 4B).
- Berechnen Sie die ΔF/F des Films mit der entsprechenden Registerkarte und projizieren Sie den Film, um ein maximales Projektionsbild des ΔF/F-Films zu erzeugen. Dieses Bild zeigt Regionen, die Veränderungen des Fluoreszenzniveaus aufweisen, möglicherweise einzelne Neuronen, und könnte zur Messung des durchschnittlichen Durchmessers der Neuronen verwendet werden (Abbildung 4C).
- Alternativ können Sie den Zelldurchmesser auf dem bewegungskorrigierten Film messen, wo die Neuronen eine klare Fluoreszenz zeigen.
- Identifizieren Sie Zellen mithilfe der Algorithmen in der Software.
- Obwohl in diesem Schritt zwei Optionen (PCA-ICA und CNMF-E) zur Verfügung stehen, verwenden Sie CNMF-E für diese Studie. Geben Sie den durchschnittlichen Zellendurchmesser in Pixeln ein, und führen Sie den Algorithmus aus, um einen Zellsatz mit relevanten Regionen (ROIs) zu generieren, die zellenähnliche Aktivitäten demonstrieren.
- Wählen Sie manuell ROIs aus, bei denen es sich um Zellen handelt (mit einer zellähnlichen Morphologie und Aktivität22,23 und liegen innerhalb des FOV), und validieren Sie den kuratierten Zellsatz (Abbildung 4D).
- Exportieren Sie die Kalziumspuren jedes ROI zur weiteren Analyse.
8. Verarbeitung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebungsdaten
- Verwenden Sie für Zwei-Photonen-Aufnahmefilme ein Python-Paket, das für die Verarbeitung von Zwei-Photonen-Kalziumanalysedaten entwickelt wurde.
- Kombinieren Sie zunächst die in einer T-Serie aufgenommenen Bilder wie unten beschrieben zu einem .tiff Stapel.
- Passen Sie in der Benutzeroberfläche Ausführungsoptionen die Parameter, einschließlich des Tau-Werts und der Bildrate, so an, dass sie mit dem verwendeten GCaMP und der Bildrate der Aufnahme übereinstimmen.
- Optional: Legen Sie den Parameter do_registration auf 1 fest, um den Film zu registrieren. Dies entspricht dem oben beschriebenen Bewegungskorrekturschritt.
- Optional: Legen Sie den Parameter anatomical_only auf 1 fest, um ROIs zusätzlich zur Fluoreszenzdynamik anhand der anatomischen Merkmale zu erkennen. Dies erfordert die Eingabe des Zelldurchmessers, also messen Sie mit der Bildverarbeitungssoftware. Dies wird im Allgemeinen empfohlen, da es ROIs mit natürlicheren Formen generiert (Abbildung 5A-C).
- Sobald alle Parameter eingestellt sind, führen Sie den Algorithmus aus, damit er alle Berechnungen zusammen durchführt. Überprüfen Sie den Fortschritt in der grafischen Benutzeroberfläche (GUI).
- Sobald dies erledigt ist, kehren Sie zur Zellauswahlschnittstelle zurück, um die Zellidentifikationsergebnisse manuell zu kuratieren.
- Speichern Sie ein Bild des kuratierten Zellsatzes über der maximalen Projektion des Films. Dieses wird später als Referenzbild für die Registrierung von Ein-Photonen-Aufnahmedaten verwendet.
- Der Algorithmus speichert die Ergebnisse dann automatisch ein. npy-Format, auf das später mit Python zugegriffen werden kann. Alternativ können Sie die Ergebnisse in anderen formatierten Dateien speichern, um sie in einer anderen Software weiter zu analysieren.
Abbildung 5: Zellidentifikation mit Zwei-Photonen-Verarbeitungssoftware. (A) Repräsentatives Bild der Zellidentifikation, aufgenommen von der Zwei-Photonen-Verarbeitungssoftware. Wenn Anatomical_only Parameter auf 0 gesetzt wird, aber alle anderen Parameter gleich bleiben, sind mehrere Nicht-Zellen im Bereich zwischen den gestrichelten Linien vorhanden, die die manuelle Kuratierung der tatsächlichen Zellen beeinträchtigen. (B) Beispiele für Messungen des Zelldurchmessers von (A) mit einer Bildverarbeitungssoftware (oben links; 7,5 Pixel, oben rechts; 9, unten links; 6,5, unten rechts; 7,5). (C) Repräsentatives Bild der Zellidentifikation. Wenn Anatomical_only Parameter auf 1 gesetzt und der durchschnittliche Zellendurchmesser aus (B) in den Zellendurchmesseralgorithmus eingegeben wird, sind im Bereich zwischen den gestrichelten Linien keine Zellen vorhanden (Maßstabsbalken stehen für 200 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
9. Registrierung identifizierter Zellsätze über Bildgebungsmodalitäten hinweg
- Führen Sie die Registrierung von Zellen durch, die aus Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Aufzeichnungen identifiziert wurden, mit dem multimodalen Bildregistrierungs- und Analysealgorithmus (MIRA), der über die Python-Schnittstelle der Ein-Photonen-Bildgebungssoftware verfügbar ist.
- Dieser Algorithmus richtet die Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Daten über eine nicht-starre Registrierung aus. Sehen Sie sich die Reihe von Demonstrations-Online-Notizbüchern an, die auf der Website zu finden sind und für diese Studie verwendet wurden.
HINWEIS: Die Notizbücher wurden so geschrieben, dass die gesamte Verarbeitung in der 1P-Software abgeschlossen wird und daher nicht mit der 2P-Verarbeitungssoftware kompatibel ist. Führen Sie daher nur einige der Schritte in den Notizbüchern für diese Studie durch.
- Dieser Algorithmus richtet die Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Daten über eine nicht-starre Registrierung aus. Sehen Sie sich die Reihe von Demonstrations-Online-Notizbüchern an, die auf der Website zu finden sind und für diese Studie verwendet wurden.
- Führen Sie die in den Demonstrationsnotizbüchern beschriebenen Schritte aus, die das Generieren eines Strukturbilds für jede Bildgebungsmodalität umfassen. Standardmäßig wird dabei eine maximale Projektion des Zwei-Photonen-Z-Stapels und ein Mittelwert der Ein-Photonen-Aufnahme erzeugt. Alternativ können Sie ein mittleres Bild der Zwei-Photonen-Aufnahme verwenden.
- Wenn Sie dazu aufgefordert werden, filtern Sie die Bilder mit räumlichem Bandpass, um die Orientierungspunkte besser zu visualisieren und sie so auszurichten, dass sie übereinstimmen.
- Wählen Sie übereinstimmende Orientierungspunkte auf den beiden Bildern aus (Abbildung 6A).
- Verwenden Sie diese, um die Verzerrung zu berechnen, die zum Ausrichten der beiden Bilder erforderlich ist. Im Allgemeinen sollten 3 bis 5 Orientierungspunkte ausreichen.
- Der Algorithmus berechnet den Warp basierend auf einer Kombination aus Orientierungspunkten und Bildähnlichkeit. Optimieren Sie die relative Gewichtung der beiden Faktoren, bis zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden.
- Verzerren Sie die in einer Ein-Photonen-Sitzung erfasste Zellkarte, um eine neue Zellkarte zu erstellen, die an den Zwei-Photonen-Daten ausgerichtet ist.
- Importieren Sie dann diese verzerrte Zellkarte in die 1P-Verarbeitungssoftware, um ein Bild mit dem maximalen Projektionsbild aus dem Zwei-Photonen-Film im Hintergrund zu erzeugen.
- Exportieren Sie dieses Bild für Registrierungszwecke.
- Richten Sie in der Programmiersoftware die beiden bisher erzeugten Bilder aus (Zwei-Photonen-Zellkarte auf dem Zwei-Photonen-Maximalprojektionsbild) und Warp-Ein-Photonen-Zellkarte auf dem Zwei-Photonen-Maximalprojektionsbild (Abbildung 6B, C).
- Verwenden Sie dazu für diese Studie eine Registrierungsschätzungsanwendung, die es dem Benutzer ermöglicht, die Ergebnisse verschiedener Registrierungstechniken zu vergleichen. Da die beiden Bilder den gleichen Hintergrund haben, war die Phasenkorrelationstechnik mit starrer Registrierung ausreichend.
- Sobald die Registrierung abgeschlossen ist, scannen Sie das jetzt registrierte Bild auf überlappende ROIs. Dies sind ROIs, die in beiden Aufzeichnungssitzungen aktiv sind und für weitere Analysen verwendet werden könnten.
Abbildung 6: Modalitätsübergreifende Zellregistrierung mit dem MIRA-Workflow. (A) Repräsentatives Bild aus dem Zellausrichtungs-Workflow. Das mittlere Bild aus den Ein-Photonen-Daten ist links und das aus den Zwei-Photonen-Daten rechts dargestellt. Passende Orientierungspunkte aus beiden Bildern werden in der Software durch ein zufälliges Farbschema (rote Kreise) ausgewählt und beschriftet. (B) Beispielorientierte Bilder, die die beiden identifizierten Zellgruppen zeigen, ein Photon (violett) und zwei Photonen (grün), werden über das mittlere Bild der Zwei-Photonen-Daten gelegt. (C) Bild des mit dem weißen Kasten markierten Bereichs in (B), ausgerichtete Zellen werden hier als überlappende grüne und violette Umrisse dargestellt. In allen Panels stellt der Maßstabsbalken 200 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Es wurde die Methode zur Durchführung einer chronischen mehrschichtigen In-vivo-Kalziumbildgebung derselben neuronalen Population über einen Zeitraum von mehreren Wochen unter Verwendung von Ein- und Zwei-Photonen-Bildgebungsmodalitäten unter frei beweglichen und kopffixierten Bedingungen gezeigt. Hier wurde die Fähigkeit demonstriert, übereinstimmende neuronale Populationen unter Ein-Photonen-Bildgebung zu identifizieren, während das Tier im Dunkeln eine offene Arena erkundete (Abbildung 7A). Kalziumspuren wurden aus den identifizierten Neuronen extrahiert und zum Vergleich mit z-bewertet (Abbildung 7B). Neuronen zeigten vergleichbare Fluoreszenz- und Feuerraten in Sitzungen im Abstand von 3 Wochen.
Abbildung 7: Die Kalziumdynamik des primären visuellen Kortex kann über Sitzungen von 3 Wochen hinweg stabil registriert werden. (A) Räumliche Filter identifizierter Neuronen, die den maximalen Projektionsbildern aus drei separaten Aufnahmen desselben Sichtfelds unter frei beweglicher Ein-Photonen-Kalziumbildgebung über eine Dauer von 3 Wochen überlagert werden. ROIs sind in der Reihenfolge gekennzeichnet, in der sie in (B) dargestellt werden. Dunkle Bereiche in der zweiten (mittleren) und dritten (rechts) Sitzung sind das Ergebnis der Bildregistrierung, wobei die erste (linke) Sitzung als Referenz verwendet wird (die Maßstabsleiste steht für 0,5 mm). (B) Z-bewertete Kalziumaktivitäten der registrierten ROIs in der ersten (links), zweiten (Mitte) und dritten (rechts) Sitzung in (A). Der horizontale Maßstabsbalken beträgt 10 s und der vertikale Maßstabsbalken 10 sd. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Als nächstes wurde die Registrierung einer neuronalen Population über verschiedene Bildgebungsmodalitäten hinweg demonstriert. Ein-Photonen- und Zwei-Photonen-Bildgebungssitzungen wurden am selben Tag durchgeführt. ROIs wurden aus Ein-Photonen-Daten identifiziert und manuell kuratiert, um eine Zellkarte zu erstellen (Abbildung 8A). In ähnlicher Weise wurden Zwei-Photonen-Daten verarbeitet, um eine Zellkarte zu erstellen, bei der Zellen automatisch identifiziert und manuell zur Demonstration ausgewählt werden. Dann wurde das mittlere Projektionsbild aus der Ein-Photonen-Sitzung mit der MIRA-Plattform auf das maximale Projektionsbild des Zwei-Photonen-Z-Stapels ausgerichtet (Abbildung 8B). Diese verzerrte Zellkarte wurde dann exportiert, über das Zwei-Photonen-Maximum-Projektionsbild gelegt und mit der Zwei-Photonen-Zellkarte abgeglichen (Abbildung 8C). Dies ermöglichte eine Zellidentifizierung, die Aktivitäten derselben Zellen unter beiden Bildgebungsmodalitäten zeigte (Abbildung 8D), die für die quantitative Analyse der neuronalen Reaktionen verwendet werden kann.
Abbildung 8: Kalziumdynamik aus dem primären visuellen Kortex, registriert zwischen verschiedenen Bildgebungsmodalitäten. (A) Räumliche Filter identifizierter Neuronen, die dem maximalen Projektionsbild einer Ein-Photonen-Sitzung überlagert sind. Markierte Neuronen sind diejenigen, die erfolgreich für die in (C) dargestellten Zwei-Photonen-Aufzeichnungsdaten registriert wurden. (B) Die gleichen Konturen, die in (A) gezeigt werden, wurden verzerrt, um mit den in (C) gezeigten Zwei-Photonen-Sitzungsdaten übereinzustimmen. (C) Räumliche Filter der in (A) gezeigten ROIs nach dem Alignment (weiß) und ROIs, die mit der 2P-Verarbeitungssoftware aus einer Zwei-Photonen-Head-Fixed-Aufnahmesitzung am selben Tag (grün) identifiziert wurden, überlagert mit dem maximalen Projektionsbild aus der Zwei-Photonen-Sitzung. Überlappende ROIs gelten als registriert und werden für die weitere Analyse ausgewählt (Maßstabsbalken stehen für 0,5 mm). (D) Z-bewertete Kalziumaktivitäten der registrierten ROIs in Ein-Photonen- (links) und Zwei-Photonen-Aufzeichnungssitzungen (rechts) (horizontaler Skalierungsbalken beträgt 10 s und vertikaler Skalierungsbalken ist 10 sd). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier haben wir die Fähigkeit gezeigt, Neuronen unter kopffixierten und frei beweglichen Bedingungen in denselben neuronalen Populationen zu beobachten und direkt zu vergleichen. Während wir die Anwendung im visuellen Kortex demonstriert haben, kann dieses Protokoll an eine Vielzahl anderer Hirnareale angepasst werden, sowohl an kortikale Areale als auch an tiefe Kerne 24,25,26,27,28 sowie an andere Datenerfassungs- und Verhaltensaufbauten 29,30.
Es ist wichtig, die kritischen Schritte innerhalb dieses Protokolls zu beachten, da sie eine optimale Datenerfassung ermöglichen. Erstens ist es bei der Durchführung von Z-Stapeln entscheidend, eine durchgehend konsistente Leuchtdichte aufrechtzuerhalten. Wie bereits beschrieben, wird Licht gestreut, je mehr Gewebe es durchdringen muss; Durch die Erhöhung des Gewinns hat der Laser also mehr Leistung, um weiter in das Gewebe eindringen zu können und unsere ROIs zu stimulieren. Es wird jedoch nicht empfohlen, den Z-Stapel bei der Verstärkung zu starten, die erforderlich ist, um ROIs im tiefen Gewebe anzuregen, da dies zu einer Überbelichtung von fluoreszierenden Strukturen und Phototoxizität führt und das Gewebe an der Oberfläche des Kortex ausbleichen kann. Daher kann die Software durch Auswahl der Option Relativer exponentieller Gradient einen stetigen Leistungsgradienten berechnen, der erforderlich ist, um bei jedem Schritt des Z-Stapels optimal zu sein. Zweitens besteht der nächste wichtige Schritt zur Unterstützung der konsistenten Registrierung von Zellsätzen im Laufe der Zeit darin, sicherzustellen, dass das mittlere Bild des Films, das bei der ersten Ein-Photonen-Bildgebungssitzung aufgenommen wurde, gespeichert wird. Auf diese Weise kann der Benutzer alle nachfolgenden Bildgebungssitzungen mit dem Originalbild vergleichen, um die Kontinuität der Zellsätze und der Datenerfassung zu gewährleisten.
Es ist erwähnenswert, dass leichte miniaturisierte Zwei-Photonen-Mikroskope unabhängig voneinander entwickelt wurden31,32, die eine hochauflösende Bildgebung bei frei verhaltenden Tieren ermöglichen. Während es einen aufregenden Fortschritt für hochauflösende In-vivo-Bildgebung darstellt, machen das eingeschränkte Sichtfeld (FOV) und das hochspezialisierte Design es für allgemeine Endbenutzer zu einer Herausforderung. Die von uns beschriebene Methode integriert mehrere etablierte Plattformen, die von kommerziellen Anbietern leicht erhältlich sind, was sie zu einer zugänglichen Wahl macht. Theoretisch kann es auch durch ein kundenspezifisches, selbstorganisiertes Mikroprisma ersetzt werden, das mit einem Open-Source-Miniskop und einem generischen Zwei-Photonen-Mikroskopkompatibel ist 33,34.
Nichtsdestotrotz steht dieses Protokoll vor Herausforderungen wie der genauen Mikroprismenimplantation, da Fehler zu nicht lebensfähigen FOVs und folglich zu kompromittierten Daten führen können. Die Aufrechterhaltung konsistenter Sichtfelder über verschiedene Modalitäten hinweg ist aufgrund der unterschiedlichen Objektive, die für die Bildaufnahme verwendet werden, ebenfalls eine Herausforderung. Da die XY-Achsen des Mikroprismas jedoch fest bleiben, verläuft die Variation des Sichtfelds entlang der Z-Achse. Daher werden spezifische Orientierungspunkte, die in beiden Bildgebungsmodi vorhanden sind (wie Blutgefäße, Artefakte im kortikalen Gewebe und identische Neuronen), verwendet, um die FOVs zu synchronisieren. Darüber hinaus ist es wichtig, die Registrierung anzuwenden, um dieselben Neuronen unter verschiedenen Modalitäten auszurichten und zu identifizieren. Eine weitere Herausforderung besteht darin, das Photobleaching des GCaMP-Gewebes während der Aufnahme in beiden Modalitäten zu minimieren. Daher ist es wichtig, den Zeitaufwand für die Aufnahme zu reduzieren, das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren (durch Erhöhung der Verstärkung anstelle der LED/Laserleistung) und 24-48 Stunden zwischen den Bildgebungssitzungen zu warten.
Trotz dieser inhärenten Komplexität bietet unser Protokoll, wenn es mit chirurgischer Präzision und geeigneten Bildverarbeitungstechniken ausgeführt wird, eine robuste Plattform für den Vergleich neuronaler Aktivitäten. Es ermöglicht den Vergleich zwischen kopffesten Zuständen bei streng kontrollierten Aufgaben und frei beweglichen Zuständen, die natürlichere Verhaltensweisen nachahmen, und erweitert so die Anwendungsmöglichkeiten im Bereich der Neurowissenschaften.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Wir danken Frau Charu Reddy und Professor Matteo Carandini (Cortex Lab) für ihre Ratschläge zum chirurgischen Protokoll und zum Austausch transgener Mausstämme. Wir danken Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) für seine Anleitung und Unterstützung bei der Entwicklung der Operation. Wir danken Frau Andreea Aldea (Sun Lab) für ihre Unterstützung bei der chirurgischen Einrichtung und Datenverarbeitung. Diese Arbeit wurde von der Moorfields Eye Charity unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | - | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | - | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | - | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | - | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | - | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | - | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | - | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | - | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
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