Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generering af centromer-associeret protein-E CENP-E-/- knockout-cellelinjer ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65476
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Denne artikel rapporterer konstruktionen af centromer-associeret protein-E (CENP-E) knockout-celler ved hjælp af CRISPR / Cas9-systemet og tre fænotypebaserede screeningsstrategier. Vi har brugt CENP-E knockout-cellelinjen til at etablere en ny tilgang til validering af CENP-E-hæmmernes specificitet og toksicitet, hvilket er nyttigt til lægemiddeludvikling og biologisk forskning.

Abstract

CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats)/Cas9-systemet har vist sig at være et kraftfuldt værktøj til præcis og effektiv genredigering i en række forskellige organismer. Centromerassocieret protein-E (CENP-E) er en plus-end-rettet kinesin, der kræves til kinetochore-mikrotubulusindfangning, kromosomjustering og spindelsamlingskontrolpunkt. Selvom cellulære funktioner af CENP-E-proteinerne er blevet godt undersøgt, har det været vanskeligt at studere de direkte funktioner af CENP-E-proteiner ved hjælp af traditionelle protokoller, fordi CENP-E-ablation normalt fører til spindelsamlingskontrolpunktaktivering, cellecyklusstop og celledød. I dette studie har vi fuldstændig slået CENP-E-genet ud i humane HeLa-celler og med succes genereret CENP-E-/- HeLa-cellerne ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet.

Tre optimerede fænotypebaserede screeningsstrategier blev etableret, herunder cellekoloniscreening, kromosomjusteringsfænotyper og de fluorescerende intensiteter af CENP-E-proteiner, som effektivt forbedrer screeningseffektiviteten og den eksperimentelle succesrate for CENP-E-knockout-cellerne . Det er vigtigt, at CENP-E-sletning resulterer i kromosomforskydning, den unormale placering af BUB1 mitotiske checkpoint serin / threonin kinase B (BubR1) proteiner og mitotiske defekter. Desuden har vi brugt CENP-E knockout HeLa-cellemodellen til at udvikle en identifikationsmetode for CENP-E-specifikke hæmmere.

I denne undersøgelse er der etableret en nyttig tilgang til validering af CENP-E-hæmmeres specificitet og toksicitet. Desuden præsenterer dette papir protokollerne for CENP-E-genredigering ved hjælp af CRISPR / Cas9-systemet, som kunne være et kraftfuldt værktøj til at undersøge mekanismerne for CENP-E i celledeling. Desuden vil CENP-E-knockout-cellelinjen bidrage til opdagelsen og valideringen af CENP-E-hæmmere, som har vigtige konsekvenser for udvikling af antitumorlægemidler, undersøgelser af celledelingsmekanismer i cellebiologi og kliniske anvendelser.

Introduction

Konstrueret genomredigering medierer målrettede modifikationer af gener i en række celler og organismer. I eukaryoter kan stedspecifik mutagenese indføres ved anvendelse af sekvensspecifikke nukleaser, der stimulerer homolog rekombination af mål-DNA1. I de senere år er flere genomredigeringsteknologier, herunder zinkfingernukleaser (ZFN'er)2,3, transkriptionsaktivatorlignende effektornukleaser (TALEN'er)4,5 og homing meganucleaser 6,7, blevet konstrueret til at spalte genomer på bestemte steder, men disse tilgange kræver kompleks proteinteknik og overflødige eksperimentelle procedurer. Undersøgelser har vist, at type II prokaryot grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / Cas-systemet er en effektiv genredigeringsteknologi, der specifikt medierer RNA-styret, stedspecifik DNA-spaltning i en lang række celler og arter 8,9,10,11. CRISPR/Cas9-genets knockout-teknologi har revolutioneret områderne grundlæggende biologi, bioteknologi og medicin12.

Bakterier og de fleste arkæer har udviklet et RNA-baseret adaptivt immunsystem, der bruger CRISPR- og Cas-proteiner til at identificere og ødelægge vira og plasmider13. Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) endonuklease indeholder det RuvC-lignende Holliday-krydsresolvase (RuvC) og His-Asn-His (HNH) domæne, som effektivt kan formidle sekvensspecifikke, dobbeltstrengede pauser (DSB'er) ved at tilvejebringe et syntetisk enkeltguide-RNA (sgRNA) indeholdende CRISPR-RNA'er (crRNA) og transaktiverende crRNA (tracrRNA)14,15,16. DSB'er kan repareres gennem den indeldannende ikke-homologe endesammenføjning (NHEJ) eller homologi-rettede reparationsvej (HDR), som introducerer flere mutationer, herunder indsættelser, deletioner eller arløse enkeltnukleotidsubstitutioner, i pattedyrceller 1,8. Både den fejlbehæftede NHEJ og high-fidelity HDR-vejen kan bruges til at formidle genknockout gennem indsættelser eller deletioner, hvilket kan forårsage frameshift-mutationer og for tidlige stopkodoner10.

Kinesin-7 CENP-E er påkrævet til kinetochore-mikrotubulusbinding og kromosomjustering under celledeling 17,18,19. Antistofmikroinjektion 20,21, siRNA-udtømning22,23, kemisk hæmning 24,25,26 og genetisk deletion 27,28,29 af CENP-E fører til kromosomforskydning, aktivering af spindelsamlingskontrolpunkt og mitotiske defekter, hvilket resulterer i aneuploidi- og kromosomal ustabilitet19,30. Hos mus resulterer CENP-E-deletion i unormal udvikling og embryonal dødelighed i de meget tidlige udviklingsstadier 27,29,31. Genetisk deletion af CENP-E fører normalt til kromosomforskydning og celledød 26,27,29, hvilket er en hindring for at studere funktionerne og mekanismerne i CENP-E-proteinerne.

En nylig undersøgelse har etableret en betinget CENP-E knockout-cellelinje ved hjælp af en auxin-inducerbar CRISPR/Cas9-genredigeringsmetode32, som muliggør hurtig nedbrydning af CENP-E-proteiner på relativt kort tid33. Til dato er der imidlertid ikke etableret stabile CENP-E knockout-cellelinjer, hvilket er en uløst teknisk udfordring i CENP-E-biologien. I betragtning af genetisk robusthed34, genetiske kompensationsresponser 35,36,37 og komplekse intracellulære miljøer, da de direkte konsekvenser af fuldstændig sletning af CENP-E kan være komplekse og uforudsigelige, er det vigtigt at etablere CENP-E-knockout-cellelinjer til undersøgelse af mekanismer for kromosomjustering, spindelsamlingskontrolpunkt og nedstrøms signalveje.

Opdagelsen og anvendelsen af CENP-E-hæmmere er vigtig for kræftbehandling. Til dato er syv typer CENP-E-hæmmere blevet fundet og syntetiseret, herunder GSK923295 og dets derivater24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]pyridinstilladsderivater40,41, forbindelse-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 og benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazolderivater47. Blandt disse hæmmere er GSK923295 en allosterisk og effektiv CENP-E-hæmmer, der binder til det motoriske domæne af CENP-E og hæmmer CENP-E mikrotubuli-stimuleret ATPase-aktivitet med en Ki på 3,2 ± 0,2 nM24,25. Sammenlignet med de hæmmende virkninger af GSK923295 på dyrkede kræftceller er de terapeutiske virkninger af GSK923295 hos kliniske kræftpatienter imidlertid ikke ideelle48,49, hvilket også gav anledning til bekymring over specificiteten af GSK923295 for CENP-E. Desuden er andre CENP-E-hæmmeres specificitet og bivirkninger på CENP-E-proteinerne centrale spørgsmål i kræftforskningen.

I dette studie har vi fuldstændig slået CENP-E-genet ud i HeLa-celler ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet. Tre optimerede fænotypebaserede screeningsstrategier er blevet etableret, herunder cellekoloniscreening, kromosomjusteringsfænotyper og de fluorescerende intensiteter af CENP-E-proteiner, for at forbedre screeningseffektiviteten og succesraten for CENP-E-genredigering. Desuden kan CENP-E knockout-cellelinjer bruges til at teste specificiteten af kandidatforbindelser til CENP-E.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Konstruktion af CRISPR/Cas9-genets knockout-vektorer

  1. Vælg målgenomisk DNA-sekvens på det humane CENP-E-gen (GenBank-tiltrædelsesnr . NM_001286734.2) og designe sgRNA'et ved hjælp af et online CRISPR-designværktøj (http://crispor.tefor.net/).
  2. Indtast en enkelt genomisk sekvens, vælg genomet af "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysesæt) + enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er): dbSNP148", og vælg protospaceren tilstødende motiv "20 bp-NGG-spCas9". Vælg to guidesekvenser, herunder sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' og sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', i henhold til specificitetsscorerne50, den forudsagte effektivitet10 og de minimale off-targets.
  3. Bestil og syntetiser de enkeltstrengede DNA-oligonukleotider (ssODN'er). ssODN'erne fortyndes i ddH2O til en slutkoncentration på 100 μM. For at phosphorylere og anneal sgRNA-oligoerne tilsættes 1 μL fremadrettet oligo, 1 μL omvendt oligo, 0,5 μL T4-polynukleotidkinase, 1 μL T4-polynukleotidkinasebuffer og 6,5 μL RNasefrit vand i et polymerasekædereaktionsrør (PCR), og røret inkuberes ved 37 °C i 30 minutter, 95 °C i 5 minutter; derefter rampes ned til 25 °C ved 5 °C min-1.
  4. Fordøje pX458-plasmidet ved hjælp af Bbs-restriktionsenzymetEquation 1 . Der tilsættes 1 μg pX458-plasmid, 2 μL 10x buffer G, 1 μL BbsEquation 1, og der tilsættes RNasefri ddH2O til 20 μL i et 1,5 ml centrifugeglas. Reagensglasset inkuberes ved 37 °C i 2 timer. Rens derefter det lineære plasmid ved hjælp af kolonnen DNA-gelekstraktionssæt i henhold til producentens protokoller.
  5. Ligate sgRNA oligoerne ind i pX458 plasmidet (pSpCas9 (BB) -2A-grønt fluorescerende protein (GFP) plasmid, Addgene ID. 48138). Der tilsættes 1 μL af de udglødede oligonukleotider, 25 ng af det lineære plasmid, 1 μL 10x T4 DNA-ligeringsbuffer, 0,5 μL T4 DNA-ligase (350 E/μL) og fyld op til 10 μL med ddH2O i et 1,5 ml centrifugeglas. Inkubation af ligeringsopløsningen ved 16 °C i 2 timer.
  6. 10 μL af det konstruerede plasmid inkuberes med de kompetente DH5α-celler på is i 30 minutter, varmechok ved 42 °C i 45 sekunder, og de lægges straks på is i 5 minutter. Der tilsættes 500 μL Luria-Bertani (LB) substrat og frø cellerne på en LB-plade indeholdende ampicillin (100 μg/ml). Den inkuberes ved 37 °C i 16 timer, og de resistente kloner screenes.
  7. Vælg 5-10 enkeltkolonier med en steriliseret pipettespids og overfør dem til en 1 ml kultur af LB-medium med ampicillin (100 μg/ml). Kulturen inkuberes ved 37 °C og rystes ved 180 o/min i 12-16 timer.
  8. Isoler plasmid-DNA'et ved hjælp af et plasmidekstraktionssæt i henhold til producentens protokoller. Valider plasmid-DNA'et for hver koloni ved Sanger-sekventering fra U6-promotorstedet ved hjælp af U6-Fwd-primeren 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.
  9. Uddrag og rens plasmiderne ved hjælp af det endofrie plasmid-DNA-sæt i henhold til producentens protokoller.

2. Transfektion, isolering og screening af CENP-E knockout HeLa-cellerne

  1. Dyrkning af HeLa-celler i Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin/streptomycin i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
  2. HeLa-cellerne inkuberes ved hjælp af 0,25% trypsin/ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) ved 37 °C i 2-3 minutter, cellerne dissocieres ved at pipettere forsigtigt, og derefter frø cellerne i nye plader i et fortyndingsforhold på 1:4 for cellepassage.
  3. Frø cellerne i en 12-brøndplade og kultur til 60-70% sammenløb før transfektion. Transfekter pX458-sgRNA-plasmiderne ind i HeLa-celler ved hjælp af de refererede reagenser i henhold til producentens protokoller (se materialetabellen).
    1. Bland forsigtigt 1 μg valideret pX458-sgRNA-plasmid og 50 μL reduceret serummedium i reagensglas A. Bland derefter forsigtigt 2 μL transfektionsreagenset og 50 μL reduceret serummedium i glas B. Inkuber glas A og B separat ved stuetemperatur i 5 min.
    2. Bland både tube A og tube B forsigtigt og inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Tilsæt blandingen til en 12-brøndplade, inkuber cellerne i 6 timer, og erstat mediet med et frisk DMEM-medium.
  4. Undersøg HeLa-celler efter 24 timer eller 48 timer ved hjælp af et fluorescensmikroskop for transfektionseffektivitet. Efter transfektion i 48 timer dissocieres de transfekterede HeLa-celler fuldstændigt ved hjælp af 0,25% trypsin / EDTA ved 37 ° C i 3-5 minutter, tæller antallet af celler ved hjælp af et Neubauer-kammer eller en automatiseret celletæller og plade cellerne i tre separate 96-brøndplader for hver transfekteret population i henhold til serielle fortyndingsmetoder10.
  5. Returner cellerne til en befugtet inkubator og dyrk dem derefter i yderligere 1-2 uger. Skift kulturmediet en gang hver 3. dag. Til fænotypebaseret screening og validering af CENP-E-knockout adskilles og udvides cellerne i plader med 24 brønde eller 12 brønde i 5-7 dage.
  6. Screene mutantcellerne med mindre cellekolonidiametre ved hjælp af et omvendt mikroskop udstyret med 10x og 20x objektivlinser.
    BEMÆRK: CENP-E-mutationer resulterer normalt i en signifikant stigning i antallet af delende celler i cellekolonier, hvilket kan være en af nøgleindikatorerne for screening af CENP-E-mutantcellerne .
  7. Høst cellerne til DNA-ekstraktion ved hjælp af kolonnedyrets genomiske DNA-ekstraktionssæt i henhold til producentens protokoller. PCR-reaktionerne indstilles som følger: 0,25 μL Taq-polymerase, 5 μL 10x buffer (Mg2+ plus), 4 μL dNTP-blandinger, 500 ng DNA-skabelon, 1 μL fremadrettet oligo, 1 μL omvendt oligo, og juster ddH2O til 50 μL. Brug følgende PCR-programindstillinger til genamplifikation: 98 °C, 10 s; 98 °C, 10 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 60 s i 33 cyklusser 72 °C, 10 min, og hold derefter ved 4 °C.
    BEMÆRK: De specifikke primere til kloning af målstedet er anført som følger: CENP-E-mål F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E-mål R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'; CENP-E-mål F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E-mål R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. Ligate mål-DNA'et ind i pMD18-T-vektoren i henhold til producentens protokoller. Transfekter det ligerede plasmid til kompetente DH5a-celler og kultur til udvælgelse af kloner.
  9. Udfør Sanger-sekventering for at bestemme typerne af CENP-E-knockout . Isoler plasmid-DNA'et ved hjælp af et plasmidekstraktionssæt i henhold til producentens protokoller. Udfør Sanger-sekventering af plasmid-DNA'et i hver koloni ved hjælp af M13 fremadgående og omvendte primere. M13F primer, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; M13R primer, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. Frø vildtype- og CENP-E-mutante HeLa-celler på 12 mm glasdæksler i en plade med 24 brønde. Fjern det komplette DMEM-medium og fastgør cellerne i 4% paraformaldehyd/fosfatbufret saltvand (PBS) fikseringsopløsning ved stuetemperatur i 10 minutter.
  11. Plet kernerne med 4',6-diamidino-2-phenylindolopløsningen (DAPI) ved stuetemperatur i 5 minutter. Screene og validere CENP-E-mutantcellerne baseret på fænotypen af kromosomjustering ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med et Plan Fluor 40x / Numerical Aperture (NA) 0,75 mål.
  12. Screene og validere CENP-E-knockoutcellerne ved hjælp af immunfluorescensfarvning og analyse (se afsnit 3) af CENP-E-proteiner.

3. Immunofluorescensfarvning og konfokalmikroskopi med høj opløsning

  1. Fastgør cellerne med 4% paraformaldehyd/PBS-fikseringsopløsning ved stuetemperatur i 10 minutter og nedsænk i 2 x 5 minutter i 1x PBS.
    BEMÆRK: Sørg for, at cellerne er i sund tilstand, og cellerne opsamles og fastgøres forsigtigt for at undgå metafasecelleløsning.
  2. Permeabiliser cellerne med 0,25% Triton X-100/PBS ved stuetemperatur i 10 min og nedsænk dem i 1x PBS i 2 x 5 min.
  3. Bloker cellerne med 1% BSA/PBST (0,1% Tween 20 i PBS) ved stuetemperatur i 1 time. De primære antistoffer fortyndes med 1 % BSA/PBST og prøverne inkuberes ved 4 °C i 12 timer.
  4. Kassér de primære antistofopløsninger, skyl cellerne 3 x 5 min med 1x PBS, og inkuber cellerne med fortyndede sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 2 timer.
  5. Kassér de sekundære antistoffer og skyl cellerne i 1x PBS i 3 x 5 min.
  6. Plet kernerne med DAPI ved stuetemperatur i 5 min. Monter diasene med monteringsmediet. Forsegl diasene med neglelak.
  7. Observer og optag fluorescensbillederne ved hjælp af et scanningskonfokalmikroskop udstyret med et 63x / NA 1.40-mål.

4. Kromosompræparation og karyotypeanalyse

  1. Dyrk vildtypen og CENP-E-/- HeLa-cellerne i komplet DMEM-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin/streptomycin i 24 timer, og inkuber derefter vildtypen og CENP-E-/- HeLa-cellerne med 300 nM colchicin i 5 timer.
  2. Inkuber cellerne med 0,25% trypsin/EDTA ved 37 °C i 3 minutter og saml cellerne i 1,5 ml centrifugeglas.
  3. Cellerne centrifugeres ved 1.000 × g i 5 minutter ved stuetemperatur, supernatanterne kasseres, der tilsættes 1,2 ml 0,075 mol/l KCl-opløsning, og der inkuberes ved 37 °C i 20 minutter.
  4. Cellerne centrifugeres ved 1.000 × g i 5 minutter ved stuetemperatur, supernatanterne kasseres, der tilsættes 0,2 ml af fikseringsopløsningen (methanol: iseddike = 3:1) til præfiksering, og blandes forsigtigt i 1 min.
  5. Centrifuger cellerne ved 1.000 × g i 5 minutter ved stuetemperatur, opsaml pillerne, tilsæt 1,5 ml af fikseringsopløsningen ved stuetemperatur i 10 minutter, og centrifuger derefter ved 1.000 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  6. Supernatanterne kasseres, der tilsættes 0,6 ml af de fikserende opløsninger, og der fremstilles en cellesuspension. Tilsæt 3-5 dråber af cellesuspensionerne fra en højde på 35-40 cm på isgliderne.
    BEMÆRK: Hold højden for frigivelse af cellesuspensionerne på diasene på 35-40 cm; Ellers kan kromosomerne være for spredte eller ikke adskilt fra hinanden.
  7. Tør diasene straks med en alkohollampe, pletter prøverne med 10% Giemsa-farvningsopløsning i 7 minutter, skyl diasene med rindende vand i 2 min, og observer prøverne ved hjælp af et lysmikroskop udstyret med et Plan Fluor 40x / NA 0.75-mål.

5. Analyse af cellekolonidannelse

  1. Forbered cellesuspensionerne i 6-brøndpladerne ved en celletæthed på 1.000-2.000 celler / brønd. Ryst forsigtigt pladerne for jævnt at fordele cellerne.
  2. 6-brøndspladerne anbringes i en CO2 -inkubator og inkuberes i 2-3 uger ved 37 ° C med 5 % CO2. Skift kulturmedium en gang hver 5. dag. Optag billederne ved hjælp af et omvendt mikroskop udstyret med 10x og 20x objektivlinser. Høst cellerne, når kolonier er synlige (hundredvis af celler i en klon).
  3. For at studere virkningerne af GSK923295 dyrkes cellerne i 6-brøndpladerne i 24 timer, og der tilsættes 2 ml GSK923295 ved de endelige koncentrationer på 10, 25, 50, 100 og 200 nM.
    BEMÆRK: Flyt ikke kulturskålen i det tidlige stadium af klondannelse for at undgå celleafgivelse, som kan danne nye kloner og påvirke screeningen af transfekterede celler.
  4. Kassér dyrkningsmediet og fiksér cellerne med 1% PFA ved stuetemperatur i 10 min. Plet kolonierne med 0,1% krystalviolet farvningsopløsning ved stuetemperatur i 15 min. Prøverne skylles med 1x PBS tre gange. Optag billederne af cellekolonier og kvantificer diametrene for hver koloni ved hjælp af ImageJ-software. Vælg markeringsværktøjet Lige linje , klik på Analysér, vælg Mål, og registrer længden.
  5. Skyl kolonierne med 1 ml 10% eddikesyreopløsning i 5 min. 200 μL supernatantopløsninger overføres til en plade med 96 huller, og absorbansværdierne måles ved hjælp af et mikropladespektrofotometer ved A600 nm.

6. Analyse af cellelevedygtighed

  1. Frø cellerne i pladerne med 24 brønde og dyrk cellerne i 48 timer til 80-90% tæthed.
  2. Inkuber cellerne med 100 μL 0,25% trypsin/EDTA ved 37 °C i 3 min.
  3. 400 μL PBS blandes med cellerne med en pipettepistol. 100 μL af cellesuspensionerne overføres til 96-brøndpladen.
  4. Der tilsættes 20 μL MTS-opløsning i hvert hul med en slutkoncentration på 317 μg/ml og blandes forsigtigt i henhold til producentens protokoller. Prøverne inkuberes ved 37 °C i 1-3 timer i en CO2 -inkubator.
  5. Absorbansværdierne for hvert hul registreres ved absorbanstoppunktet A490 nm ved hjælp af et mikropladespektrofotometer. Brug en referencebølgelængde på A630 nm til at trække baggrunden bidraget af celleaffald og uspecifik absorbans (cellelevedygtighed = A490nm- A630 nm).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CENP-E-/- HeLa-cellerne blev genereret med succes ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet (figur 1). Tidslinjen og de kritiske eksperimentelle trin i denne metode er vist i figur 1. Først designede og syntetiserede vi de CENP-E-specifikke sgRNA'er, udglødede og ligerede sgRNA'erne i pX458-plasmidet, transfekterede plasmidet til HeLa-celler og dyrkede dem i 48 timer. De transfekterede celler blev dissocieret og podet i en 96-brøndplade ved hjælp af serielle fortyndinger (figur 1A). Enkelte kolonier blev udvalgt og screenet ved hjælp af tre fænotypebaserede strategier. Mutationstyperne og CENP-E-knockoutcellerne blev valideret ved hjælp af PCR, Sanger-sekventering og immunofluorescensassays (figur 1A). Exon 1 og exon 13 af CENP-E-genet blev valgt på kromosom 4 som målretningssteder (figur 1B). CRISPR/Cas9-systemet kan inducere DSB'er proksimalt til protospacer-tilstødende motivsekvenser (PAM) ved hjælp af RuvC- og HNH-endonukleasedomænerne, som udløser NHEJ-vejene og resulterer i genredigering - lille indsættelse, sletning og substitution (figur 1C). På grund af disse fejlbehæftede reparationsmekanismer opnåede vi fire gen-knockout HeLa-cellepopulationer. Transfektionseffektiviteten af pX458-sgRNA blev detekteret ved anvendelse af et immunofluorescensassay (figur 1D). Vi ekstraherede også det genomiske DNA fra kontrol-, mål-1- og mål 2-HeLa-cellerne (figur 1E), amplificerede DNA'et fra målstedet og ligerede dem til pMD18-T til DNA-sekventering og validering af mutationstyperne (figur 1F). Sammenfattende blev ca. 100 kloner screenet, og fire stabile CENP-E knockout HeLa-celler blev genereret med succes, herunder indsættelse af + 1 bp (position 28 i klon 1 og klon 2), sletning af -7 bp (position 1102-1108 i klon 3) og en sletning af -1 bp (position 1102 bp i klon 4) (CENP-E-kodningssekvens, GenBank tiltrædelse nr. NM_001286734.2) (figur 1G,H). Disse mutationer resulterede begge i frameshift-mutationer og for tidlige stop, hvilket resulterede i fuldstændig deletion af CENP-E-genet i Klon 1/2 og to CENP-E-mutanter i Klon 3/4 HeLa-celler.

For at forbedre effektiviteten og den eksperimentelle succes af CENP-E-knockout-eksperimenterne blev der udviklet tre fænotypebaserede skærmstrategier. Disse var baseret på cellekoloniscreening ved hjælp af fasekontrastmikroskopi (figur 2A), på kromosomjustering ved hjælp af DAPI-farvning (figur 2B) og på fluorescensintensiteterne af CENP-E-proteinerne ved anvendelse af immunofluorescensanalysen (figur 2C). De kritiske trin i CRISPR / Cas9-systemet omfattede guide-RNA-kloning, transfektion af pX458-sgRNA til cellelinjer, inkubation i 48 timer, cellefortynding til en 96-brøndplade, cellehøst, screening og validering ved hjælp af tre fænotypebaserede strategier (figur 2D). Immunofluorescensfarvning af kontrol- og CENP-E-/- grupperne viste, at CENP-E-proteinernes fluorescensintensiteter blev slået fuldstændigt ud i CENP-E-/- Klon 1-cellerne og signifikant reduceret i CENP-E-mutant Klon 3-celler (figur 2E), hvilket yderligere demonstrerer effektiviteten af den CRISPR/Cas9-medierede genknockout af CENP-E gen i HeLa-celler. Forholdet mellem metafaseceller med kromosomforskydning steg fra 0,30 ± 0,21% i kontrolgruppen til 4,15 ± 0,57% i Clone 1 HeLa-cellerne og til 5,85 ± 0,80% i Clone 3 HeLa-cellerne (figur 2F). I mellemtiden steg forholdet mellem metafaseceller fra 3,49 ± 0,47% i kontrollen til 5,86 ± 0,57% CENP-E-/- Klon 1-celler og til 6,70 ± 0,77% i CENP-E-mutant Klon 3-celler (figur 2G). Derudover steg forholdet mellem interfaseceller lidt i klon 1- og klon3-grupperne efter CENP-E-sletning sammenlignet med kontrolgruppen (figur 2H). Både hastigheden af profase-, anafase- og telofaseceller blev let reduceret efter CENP-E-deletion, mens hastighederne af metafaseceller blev øget efter CENP-E-deletion (figur 2I). For yderligere at undersøge fænotyperne af CENP-E-deletion udførte vi immunofluorescensfarvning af BubR1, et nøgleprotein i spindelsamlingskontrolpunktet, og fandt ud af, at lokaliseringen af BubR1 var unormal, og kinetochore-akkumulering af BubR1 blev signifikant påvirket i fravær af CENP-E (figur 2J-L).

For bedre at forstå cellevæksten og spredningskapaciteten i CENP-E knockout HeLa-cellerne blev kolonidannelsesanalyser og krystalviolet farvning udført for fire CENP-E-/- HeLa-celler, herunder klon 1, klon 2, klon 3 og klon 4-celler (figur 3A, B). CENP-E-sletning resulterer i en reduceret klondannelsesevne, mindre kolonidiameter og nedsat celleantal i hver klon (figur 3A-D), hvilket tyder på, at CENP-E er afgørende for klondannelse og celleproliferation. Desuden brugte vi 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, indre salt (MTS) metode og udførte cellelevedygtighedsassays og fandt, at sammenlignet med 1,05 ± 0,00 i kontrolgruppen blev cellelevedygtighedsværdier reduceret til 0,66 ± 0,01 og 0,79 ± 0,00 i CENP-E-/- HeLa-cellerne (figur 3E). For yderligere at undersøge CENP-E's roller i kromosomstabilitet udførte vi kromosomforberedelse, Giemsa-farvning og karyotypeanalyse og fandt et fald i kromosomtal fra 67,09 ± 0,50 i vildtype HeLa-celler til 56,08 ± 0,6 - 61,68 ± 0,83 i CENP-E-/- HeLa-cellerne (figur 3F,G). Tilsammen indikerer disse resultater, at CENP-E-deletion signifikant hæmmer celleproliferation, kolonidannelse og cellelevedygtighed, hvilket tyder på, at CENP-E er afgørende for cellevækst, proliferation og kromosomstabilitet.

I dette studie er CENP-E knockout-cellelinjen blevet udviklet som et værdifuldt værktøj til identifikation og validering af CENP-E-specifikke hæmmere. Der er etableret en nyttig metode til validering af CENP-E-hæmmeres specificitet og toksicitet (figur 4). Ved hjælp af GSK92329524,25 som et eksempel behandlede vi vildtype HeLa-celler og CENP-E-/- Klon 1 HeLa-cellelinjer med en række koncentrationer af GSK923295 og undersøgte yderligere virkningerne af CENP-E-hæmmere på disse to HeLa-celler ved hjælp af kolonidannelsesassays og immunofluorescensassays (figur 4). De enkelte celler, der blev podet i 6-brøndpladerne, blev udsat for kolonidannelsesassays. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af GSK923295 og dyrket i 2-3 uger og derefter høstet til yderligere analyse (figur 4A-D). Efter krystalviolet farvning blev kolonidiametrene af vildtype HeLa-celler og CENP-E-/-celler målt ved hjælp af ImageJ-softwaren. I vildtype HeLa-celler blev kolonidannelsen signifikant reduceret efter behandlingen af de stigende koncentrationer af GSK923295. Derudover blev koloniernes diametre mindre efter CENP-E-hæmning i vildtype HeLa-cellerne (figur 4B-D). Især viste CENP-E knockout Clone 1 HeLa-celler intet signifikant fald i klondiametre i nærvær af forskellige koncentrationer af GSK923295, hvilket tyder på, at GSK923295 er en specifik hæmmer uden signifikante virkninger uden for målet og ingen åbenlyse toksiske bivirkninger i koncentrationsområdet 10 nM til 10 μM.

Derefter blev den kromosomale justeringsfænotype i vildtype HeLa-cellerne og CENP-E-/-cellerne undersøgt ved hjælp af immunofluorescensanalysen (figur 4E). Kvantitativ analyse har vist, at forholdet mellem metafaseceller steg signifikant efter behandling af 50 nM, 100 nM, 400 nM, 2 μM og 10 μM GSK923295 (figur 4E, F). Derudover blev CENP-E-/- Clone 1 HeLa-cellerne sammenlignet med den signifikante stigning i forkert justerede kromosomer i vildtype HeLa-celler ikke påvirket af forskellige koncentrationer af GSK923295. Samlet set er denne CENP-E-/- Klon 1-cellelinje en specifik type GSK923295-resistent cellelinje, som ikke reagerer på CENP-E-hæmmerne på grund af CENP-E-deletion og tilpasning, genetisk redundans34 og potentielle genetiske kompensationseffekter 35,36,37. Disse resultater viser, at CENP-E-/- Clone 1 HeLa-cellen er et kraftfuldt og nyttigt værktøj til at validere specificiteten, toksiciteten og bivirkningerne af CENP-E-hæmmere.

Figure 1
Figur 1: Konstruktionen af CENP-E-/- HeLa-celler ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet. (A) Protokoltidslinje for CRISPR/Cas9-vektorkonstruktion, transfektion, celleklondannelse og -udvælgelse og funktionelle valideringer. Tidslinje for konstruktionen af CENP-E-/- cellelinjerne, herunder sgRNA-design, konstruktion af pX458-sgRNA-plasmid og screening af mutantceller. (B) En skematisk model af kloning af sgRNA i den lineariserede pX458-vektor. Exon 1 og exon 13 af CENP-E-genet i kromosom 4 blev valgt som målsteder. C) CRISPR/Cas9-systemets mekanismer til genredigering. DSB efterfulgt af ikke-homolog endesammenføjning genererer tre tilfældige mutationer, herunder indsættelse, sletning og substitution. (D) Repræsentative fluorescensbilleder af HeLa-celler transfekteret med pX458-sgRNA1 (mål 1) og pX458-sgRNA2 (mål 2). Skalastænger = 50 μm. (E) Repræsentativ agarosegelelektroforese af genomisk DNA i kontrol, mål 1 og mål 2. (F-H) Sanger-sekventeringsresultater for målområderne i kontrol-, Klon 1- og Klon 3-grupperne. PCR-amplifikation blev udført under anvendelse af de specifikke fremadgående og omvendte primere for målstedet i isolerede klon 1- og klon3-celler. DNA-fragmenterne blev klonet til pMD18-T-vektorer og transfekteret til DH5α E. coli til klondannelse og Sanger-sekventering. Repræsentative sekventeringsresultater vises. I Klon 1 HeLa-celler var der en indsættelse på + 1 bp ved 28 bp. I Klon 2 HeLa-celler var der også en indsættelse af + 1 bp ved 28 bp. I Klon 3 var der en sletning af -7 bp ved 1.102-1.108 bp. I Klon 4 var der en sletning af -1 bp ved 1,102 bp. Disse to mutationer resulterer begge i en frameshift-mutation og et for tidligt stop i CENP-E-proteinerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Den konstruktions- og fænotypebaserede screeningsstrategi for CRISPR/Cas9-medierede CENP-E knockout HeLa-cellelinjer. (A) Screeningstrategien er baseret på cellekolonier. Sammenlignet med kontrolgruppen viste CENP-E-knockoutcellerne en signifikant stigning i delende celler. Skalabjælke = 50 μm. (B) Screeningsstrategien er baseret på kromosomjustering. Sammenlignet med kontrolgruppen viste CENP-E-knockoutcellerne en stigning i kromosomforskydning. Flere kromosomer var placeret proksimalt til spindelpolen efter CENP-E-sletning. DAPI, blå. Skalabjælke = 10 μm. (C) Screeningsstrategien er baseret på fluorescensintensiteter af CENP-E-proteiner. CENP-E, grøn. Skalabjælke = 10 μm. (D) Konstruktionen af CRISPR/Cas9-systemet. Det CENP-E-specifikke sgRNA blev ligeret i pX458-plasmidet og sekventeret til validering. pX458-sgRNA-plasmidet blev transfekteret til HeLa-celler ved anvendelse af et transfektionsreagens og dyrket i 48 timer. Celler blev lyseret ved hjælp af 0,25% trypsin / EDTA, podet i 96-brøndpladen og dyrket til dannelse af cellekolonier. E) Repræsentative immunofluorescensbilleder af CENP-E og α-tubulin i kontrol- og CENP-E-/-grupperne. DAPI, blå; CENP-E, grøn; α-tubulin, rød. Skalabjælke = 10 μm. (F) Forholdet mellem metafaseceller med forskydningskromosomer i kontrolgruppen og CENP-E-/- grupperne. kontrol, 0,30 ± 0,21%, n = 9; Klon 1, 4, 15 ± 0, 57%, n = 9; Klon 3, 5, 85 ± 0, 80%, n = 9. G) Forholdet mellem metafaseceller i kontrol- og CENP-E-/- grupperne. Kontrol, 3,49 ± 0,47%, n = 9; Klon 1, 5, 86 ± 0, 57%, n = 9; Klon 2, 6, 70 ± 0, 77%, n = 9. (H) Forholdet mellem interfaseceller i kontrol- og CENP-E-/-grupperne. Kontrol, 70, 08 ± 2, 71%, n = 7; Klon 1, 86, 77 ± 0, 91%, n = 7; Klon 3, 87, 67 ± 0, 91%, n = 7. I) Mitotisk indeksanalyse af kontrol- og CENP-E-/-grupperne, herunder forholdet mellem profase-, metafase-, anafase- og telofasecellerne. J) Repræsentative immunfluorescensbilleder af BubR1 og CENP-B i kontrolgruppen og CENP-E-/--gruppen. DAPI, blå; BubR1, grøn; CENP-B, rød. Skalabjælke = 10 μm. (K) Line-scan analyse af BubR1 og CENP-B i kontrol- og CENP-E-/- grupperne. X-aksen angiver den relative afstand. Y-aksen angiver fluorescensintensiteten. (L) Relative fluorescensintensiteter af BubR1 (fluorescensintensiteter af BubR1 ved kinetochores/fluorescensintensiteter af BubR1 i cytoplasmaet) i kontrol- og CENP-E-/-grupperne. kontrol, 1, 44 ± 0, 10, n = 16; Klon 1, 0, 98 ± 0, 07, n = 18. For alle grafer blev der vist gennemsnitlig ± SEM. I figur 2F-I, ANOVA Dunnetts test af flere sammenligninger. ns, p > 0,05; **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001. I figur 2L, den uparrede elevs t-test. , p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Cellevækstassays af CENP-E knockout HeLa-celler , herunder cellekolonidannelse, cellelevedygtighedsanalyse og karyotypeanalyse. (A) Repræsentative billeder af cellekolonien i kontrol- og CENP-E-/- grupperne. Skalabjælke = 50 μm. (B) Repræsentativ krystalviolet farvning af cellekoloni i kontrol- og CENP-E-/- grupperne. Skalabjælke = 1 cm. (C) Antallet af celler pr. klon i wild-type (Control) og CENP-E-/-grupperne . Vildtype, 81,97 ± 4,09, n = 32; Klon 1, 31, 52 ± 2, 51, n = 33; Klon 2, 13, 97 ± 1, 31, n = 33. Klon 3, 48, 48 ± 3, 01, n = 33; Klon 4, 33, 39 ± 1, 87, n = 33. (D) Cellekoloniens relative cellelevedygtighed blev målt ved krystalviolet absorbans ved A600 nm. Vildtype, 0,42 ± 0,00, n = 6; Klon 1, 0,12 ± 0,00, n = 6; Klon 2, 0, 13 ± 0, 00, n = 6. Klon 3, 0,18 ± 0,00, n = 6; Klon 4, 0, 12 ± 0, 00, n = 6. E) Cellelevedygtigheden af vildtype- og CENP-E-/-grupperne ved anvendelse af MTS- og cellelevedygtighedsassayet. Vildtype, 1,05 ± 0,00, n = 8; Klon 1, 0, 77 ± 0, 01, n = 8; Klon 2, 0, 67 ± 0, 01, n = 7. Klon 3, 0,79 ± 0,00, n = 7; Klon 4, 0, 66 ± 0, 01, n = 7. (F) Kromosomtallene pr. celle i vildtype- og CENP-E-/- grupperne. Vildtype, 67,09 ± 0,50, n = 66; Klon 1, 61, 68 ± 0, 83, n = 105; Klon 2, 56, 08 ± 0, 6, n = 106. Klon 3, 61, 28 ± 0, 63, n = 90; Klon 4, 64, 18 ± 0, 83, n = 61. (G) Repræsentative billeder af kromosomspredningen i kontrolgruppen og CENP-E-/-gruppen. Skalabjælke = 10 μm. For alle grafer, ANOVA Dunnetts flere sammenligninger tester. Fejlbjælker, gennemsnit ± SEM. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Brug af CENP-E knockout HeLa-celler til at validere specificiteten og toksiciteten af CENP-E-hæmmerne. A) Repræsentativ krystalviolet farvning af kontrol- og CENP-E-/-grupperne efter behandling af forskellige koncentrationer af GSK923295. Skalabjælke = 1 cm. (B) Repræsentative billeder af cellekolonien i kontrol- og CENP-E-/- grupperne efter behandling med forskellige koncentrationer af GSK923295. Skalastang = 50 μm. (C) Diametrene af cellekolonier i kontrolgruppen efter behandling af forskellige koncentrationer af GSK923295. Kontrol, 28, 68 ± 0, 85 μm, n = 149; 10 nM, 25,40 ± 0,86 μm, n = 223; 25 nM, 26, 07 ± 0, 68 μm, n = 255; 50 nM, 26, 41 ± 0, 60 μm, n = 180; 100 nM, 16,02 ± 0,32 μm, n = 185; 200 nM, 15,61 ± 0,29 μm, n = 185. D) diameteren af cellekolonier i CENP-E-/- grupperne efter behandling af forskellige koncentrationer af GSK923295. Klon 1, 17, 64 ± 0, 40 μm, n = 230; 10 nM, 17, 98 ± 0, 39 μm, n = 230; 25 nM, 15, 03 ± 0, 26 μm, n = 230; 50 nM, 16, 14 ± 0, 32 μm, n = 230; 100 nM, 21, 13 ± 0, 42 μm, n = 230; 200 nM, 19,00 ± 0,40 cm, n = 230. E) Repræsentative immunfluorescensbilleder af α-tubulin i kontrol- og CENP-E-/- grupperne efter behandling med forskellige koncentrationer af GSK923295, DAPI, blå. α-tubulin, grøn. Skalabjælke = 10 μm. (F) Forholdet mellem metafaseceller i kontrol- og CENP-E-/- gruppen efter behandling med forskellige koncentrationer af GSK923295. G) Forholdet mellem metafaseceller med fejljusteringskromosomer i kontrol- og CENP-E-/- grupperne efter behandling med forskellige koncentrationer af GSK923295. For alle grafer, ANOVA Dunnetts flere sammenligninger tester. Fejlbjælker, gennemsnit ± SEM. ns, p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; , p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kinesin-7 CENP-E er en nøgleregulator i kromosomjustering og spindelsamlingskontrolpunkt under celledeling 17,19,20. Genetisk deletion af CENP-E resulterer normalt i aktivering af spindelsamlingskontrolpunkt, cellecyklusstop og celledød 27,29,51,52. Således er konstruktionen af stabile CENP-E knockout-cellelinjer et vigtigt uløst problem i CENP-E-biologien. I denne undersøgelse er CENP-E knockout HeLa-cellerne blevet genereret med succes ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet. Denne undersøgelse har etableret tre optimerede fænotypebaserede screeningsstrategier - cellekoloniscreening, kromosomjusteringsfænotyper og fluorescerende intensiteter af CENP-E-proteiner - hvilket signifikant forbedrer effektiviteten og succesraten for CENP-E-knockoutcellerne.

Der er flere afgørende trin i denne undersøgelse. For det første er design af optimeret sgRNA afgørende for at minimere effekter uden for målet. For det andet kan transfektionen af CRISPR-plasmiderne til dyrkede celler gennem lipidbaserede reagenser, elektroporation eller lentivirustransfektion forbedre transfektionseffektiviteten og genudskæringscelleforholdene. Desuden ville anvendelserne af fluorescensaktiveret cellesortering 53,54,55 og puromycinselektion 56,57 fremskynde skærmhastigheden og forkorte forsøgsperioden. For det tredje kan valideringen af genknockout-fænotyper opfyldes ved PCR, western blot, immunofluorescensanalyser og genomisk DNA-sekventering. For det fjerde kan den funktionelle analyse af CENP-E knockout-fænotyper studeres ved hjælp af en række assays, herunder celleproliferationsassays, immunofluorescens, cellecyklusanalyser og billeddannelse med høj opløsning.

Sammenlignet med traditionelle genomredigeringsteknologier, såsom ZFN'er og TALEN'er, udviser CRISPR/Cas9-systemet flere fordele, herunder enkelhed, høj effektivitet, nem tilpasning, alsidighed og multiplexkapacitet10. Desuden kan CRISPR/Cas9-systemet skaleres op til high-throughput screening og store ingeniørprojekter58,59. CRISPR/Cas9-systemet er også blevet tilpasset som en effektiv genredigeringsteknologi, der muliggør ettrinsmutationer i flere gener60, hvilket fremskynder studierne af funktionelt overflødige gener, interagerende gener og polygene genetiske sygdomme. Derudover kan CRISPR/Cas9-systemet forbedres i effektivitet og alsidighed8. High-fidelity HDR-vejen, en alternativ større DNA-reparationsvej, kan bruges til at formidle den præcise genredigering på målstedet ved opdeling af celler i fremtiden10. Desuden kan co-transfektion af multipelt sgRNA resultere i stor deletion og fuldstændig knockout af CENP-E i celler, hvilket forbedrer stabiliteten og pålideligheden af CENP-E knockout-celler.

En vigtig begrænsning ved CRISPR/Cas9-systemet er, at SpCas9 er tilbøjelig til mutagenese uden for målet, som lejlighedsvis retter sig mod de utilsigtede steder i genomet og fører til virkninger uden for målet. Dette kan minimeres ved forbedret guide-RNA-design, off-target forudsigelsesalgoritmer og helgenomsekventering10,59. Flere tilgange, herunder brugen af alternative Cas12a- eller Cas13-proteiner53, brugen af baseeditorer61 og levering af Cas9-proteiner og guide-RNA12, er blevet udviklet for at reducere off-target-effekter. Den anden begrænsning er, at den meget anvendte Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) kræver en nødvendig 5'-NGG PAM til målgenkendelse af loci, hvilket begrænser udvælgelsen af målstederne for SpCas9 i genomer. Udviklingen af konstruerede SpCas9-varianter, der genkender de afslappede eller forskelligartede PAM'er, kan øge målområdet for Cas9 i CRISPR/Cas9-genomingeniørværktøjskassen 62,63,64. Derudover fører CRISPR/Cas9-systemet i flere tilfælde til mosaik og resulterer i forskellige redigeringer i cellepopulationer65. Nogle dyr kan stimulere et immunrespons på Cas9-proteinerne, hvilket begrænser dets anvendelser i visse arter12,66. På trods af disse begrænsninger forbliver CRISPR/Cas9-systemet en kraftfuld genredigeringsteknologi til genomredigering og undersøgelse af genfunktioner inden for grundvidenskab, bioteknologi, genterapi og medicin.

Interaktionsmetoderne og molekylære mekanismer i CENP-E og dets hæmmere er vigtige forskningsområder inden for cellebiologi og kræftforskning. Site-directed mutagenese og molekylærbiologiske undersøgelser har vist, at GSK923295 interagerer med Ile182 og Thr183 og med CENP-E-proteinerne, der er klemt mellem spiraler α2 og α3 og nær loop 525. I denne undersøgelse er CENP-E knockout HeLa-cellelinjen blevet etableret som et værdifuldt værktøj til validering af specificiteten og toksiciteten af CENP-E-hæmmere. Til dato er bindingsstederne og mekanismerne for de fleste CENP-E-hæmmere ikke godt forstået. Kombinationerne af molekylær massespektrometribilleddannelse 67, kernemagnetisk resonansspektroskopi68, optisk pincet69, molekylære strukturmodifikationer, røntgenkrystallografi70 og kryo-elektronmikroskopi71,72 ville bidrage til belysning af interaktionssteder og mekanismer for CENP-E-hæmning. I fremtiden kan homologi-rettet reparationsmedieret målmodifikation af CENP-E på specifikke steder generere CENP-E-genredigeringsceller, hvilket ville bidrage til at afsløre de specifikke bindingssteder og mekanismer for CENP-E-specifikke hæmmere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker alle medlemmer af cytoskeletlaboratoriet ved Fujian Medical University for nyttige diskussioner. Vi takker Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin og Min-Xia Wu på Public Technology Service Center, Fujian Medical University for deres tekniske assistance. Vi takker Si-Yi Zheng, Ying Lin og Qi Ke på Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences ved Fujian Medical University for deres støtte. Denne undersøgelse blev støttet af følgende bevillinger: National Natural Science Foundation of China (bevillingsnummer 82001608 og 82101678), Natural Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (bevillingsnummer 2019J05071), Joint Funds for Innovation of Science and Technology, Fujian-provinsen, Kina (bevillingsnummer 2021Y9160) og Fujian Medical University talenter videnskabeligt forskningsfinansieringsprojekt på højt niveau (bevillingsnummer XRCZX2017025).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764 (2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056 (2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Research. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358 (2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675 (2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010 (2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381 (2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481 (2020).

Tags

Biologi udgave 196 CENP-E knockout centromerassocieret protein-E kinesin kinetochore-mikrotubulusindfangning kromosomjustering spindelsamlingskontrolpunkt HeLa-celler fænotypebaseret screening kromosomforskydning BUB1 mitotisk kontrolpunkt serin / threonin kinase B (BubR1) mitotiske defekter
Generering af centromer-associeret protein-E <em>CENP-E<sup>-/- knockout-cellelinjer</sup></em> ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, M. F., Chen, J., Xu, Y., Zhang,… More

Xu, M. F., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J. L., Zhou, Y., He, J. J., Wu, S., Wei, Y. L., She, Z. Y. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter