Hurtig in vitro cytotoksicitetsevaluering af jurkat, der udtrykker kimær antigenreceptor ved hjælp af fluorescerende billeddannelse
Summary
En protokol til evaluering af kvantitativ tumorcelledrab af Jurkat-celler, der udtrykker kimær antigenreceptor (CAR) rettet mod enkelt tumorantigen. Denne protokol kan bruges som screeningsplatform til hurtig optimering af CAR-hængselkonstruktioner inden bekræftelse i perifere blodafledte T-celler.
Abstract
Chimeric antigen receptor (CAR) T-celler er i spidsen for onkologi. En CAR er konstrueret af et målretningsdomæne (normalt et enkelt kædevariabelt fragment, scFv) med en ledsagende intra-chain linker efterfulgt af et hængsel, transmembran og costimulatorisk domæne. Ændring af intra-chain linker og hængseldomænet kan have en betydelig effekt på CAR-medieret drab. I betragtning af de mange forskellige muligheder for hver del af en CAR-konstruktion er der et stort antal permutationer. Fremstilling af CAR-T-celler er en tidskrævende og dyr proces, og fremstilling og test af mange konstruktioner er en tung tids- og materialeinvestering. Denne protokol beskriver en platform til hurtig evaluering af hængseloptimerede CAR-konstruktioner i Jurkat-celler (CAR-J). Jurkat-celler er en udødeliggjort T-cellelinje med høj lentivirusoptagelse, hvilket muliggør effektiv CAR-transduktion. Her præsenterer vi en platform til hurtigt at evaluere CAR-J ved hjælp af et fluorescerende kamera efterfulgt af bekræftelse af cytolyse i PBMC-afledte T-celler.
Introduction
CAR-T-celleterapi har vist stort løfte i hæmatologiske maligniteter, hvilket fremgår af de 6 FDA-godkendte CAR-T-produkter siden 2017, som rapporteret af National Cancer Institute1. Der er adskillige CAR-T-celler i kliniske forsøg til målretning af solide tumorer. Konstruktion af nye CAR-mål og optimering af CAR-konstruktionen er afgørende for effektiviteten af en CAR-T-celle. At vælge den ideelle CAR-konstruktion til hver applikation er afgørende for nøjagtig målretning af tumorassocierede antigener (TAA), samtidig med at man undgår lave niveauer af TAA-ekspression i normalt væv2.
En CAR-konstruktion er primært lavet af fem rum: (1) ekstracellulært enkeltkædet variabelt fragment (scFv) domæne rettet mod tumorantigen; (2) hængseldomæne; (3) transmembran domæne; (4) intracellulært cytoplasmatisk T-celle costimulatorisk domæne; og (5) signaldomæne. Ændring af hvert af disse domæner påvirker præcisionen af CAR-T-cellen, der interagerer med dens målcelle3. Derfor er evaluering af cytotoksicitet og krydsreaktivitet af disse CAR-konstruktioner in vitro afgørende for at vælge den rigtige konstruktion til fremskridt mod in vivo-eksperimenter. Nuværende metoder til evaluering af cytolyse af T-celler inkluderer 51Cr-frigivelsesassay, lactatdehydrogenasefrigivelsesassay, bioluminescerende billeddannelsesassay, impedansbaseret celleanalyse i realtid og cellebaseret flowcytometriassay 4,5. Den fluorescerende billeddannelsesbaserede platform, der er beskrevet her, identificerer antallet af levende vs. døde celler, hvilket er en direkte kvantificering af T-cellecytolyse i modsætning til en indirekte metode til evaluering af cytolysen af T-celler.
Her er en nem, omkostningseffektiv, hurtig og høj gennemstrømningsteknik med minimal indgriben til evaluering af cytotoksiciteten af Jurkat-celler, der udtrykker epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) CAR mod MDA-MB-231 triple-negative brystkræftceller (TNBC) og EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231-celler. Jurkatceller er udødeliggjorte humane T-lymfocytceller6, der har været meget udbredt til at studere T-celleaktiverings- og signalmekanismer7. Desuden er Jurkat-celler blevet anvendt til in vitro CAR-test i flere undersøgelser 8,9,10,11. Jurkat-celler transduceres let af lentivirus og har vedvarende spredning, og dette system blev udnyttet til at optimere hængseldomænet for forskellige EGFR CAR-konstruktioner.
Dette assay kan bruges til screening af flere CAR-konstruktioner rettet mod forskellige tumorantigener og anvendes mod flere vedhængende tumorcellelinjer og i forskellige effektor til tumor (E: T) forhold. Derudover kan flere tidspunkter evalueres, og antallet af replikater kan ændres for at identificere det bedste drab blandt de forskellige CAR-konstruktioner. De bedste konstruktioner skal bekræftes ved hjælp af mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) afledte CD3 T-celler. Det overordnede mål bag udviklingen af denne metode er hurtigt at optimere CAR-hængselgeometri på en høj gennemstrømningsmåde og overvinde barrierer såsom lav transduktionseffektivitet efterfulgt af bekræftelse i PBMC-afledte T-celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi foreslået en hurtig metode til effektivt at evaluere den målspecifikke cytolytiske aktivitet induceret af CAR-ekspression i Jurkat-celler. Alle CAR-konstruktioner har samme scFv, men forskellige hængsel- og transmembrandomæner, som har vist sig at påvirke CAR-T-cellernes styrke13. Yderligere evaluering af ikke-specifik drab af disse CAR-J blev udført ved at dyrke dem med antigen knock out (KO) celler. Dette viser, at drabet er tumorantigenspecifikt og ikke skyldes basal aktivering…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231 var en venlig gave fra Dr. Shane Stecklein. Forfatterne anerkender finansiering fra University of Kansas Cancer Center til at udføre denne forskning.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
Riferimenti
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. . Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- . Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023)
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
