Évaluation rapide de la cytotoxicité in vitro du récepteur de l’antigène chimérique exprimant le jurkat à l’aide de l’imagerie fluorescente
Summary
Un protocole pour évaluer la destruction quantitative des cellules tumorales par les cellules de Jurkat exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) ciblant l’antigène tumoral unique. Ce protocole peut être utilisé comme plate-forme de criblage pour l’optimisation rapide des constructions de charnières CAR avant la confirmation dans les lymphocytes T dérivés du sang périphérique.
Abstract
Les lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) sont à l’avant-garde de l’oncologie. Un CAR est constitué d’un domaine de ciblage (généralement un fragment variable à chaîne unique, scFv), accompagné d’un linker intra-chaîne, suivi d’une charnière, d’une membrane et d’un domaine costimulateur. La modification du domaine de liaison intra-chaîne et de charnière peut avoir un effet significatif sur la destruction médiée par le CAR. Compte tenu des nombreuses options différentes pour chaque partie d’une construction CAR, il existe un grand nombre de permutations. La fabrication de cellules CAR-T est un processus long et coûteux, et la fabrication et le test de nombreuses constructions représentent un investissement important en temps et en matériel. Ce protocole décrit une plate-forme permettant d’évaluer rapidement les constructions CAR optimisées pour les charnières dans les cellules Jurkat (CAR-J). Les cellules Jurkat sont une lignée de lymphocytes T immortalisée avec une absorption élevée des lentivirus, permettant une transduction efficace du CAR. Nous présentons ici une plate-forme permettant d’évaluer rapidement CAR-J à l’aide d’un imageur fluorescent, suivie d’une confirmation de la cytolyse dans les lymphocytes T dérivés de PBMC.
Introduction
La thérapie cellulaire CAR-T s’est révélée très prometteuse dans les hémopathies malignes, comme en témoignent les 6 produits CAR-T approuvés par la FDA depuis 2017, comme l’a rapporté le National Cancer Institute1. Il existe de nombreuses cellules CAR-T dans les essais cliniques pour cibler les tumeurs solides. L’ingénierie de nouvelles cibles CAR et l’optimisation de la construction CAR sont essentielles à l’efficacité d’une cellule CAR-T. Le choix de la construction CAR idéale pour chaque application est essentiel pour cibler avec précision les antigènes associés à la tumeur (TAA) tout en évitant de faibles niveaux d’expression de TAA dans les tissus normaux2.
Une construction CAR est principalement constituée de cinq compartiments : (1) le domaine extracellulaire à fragment variable à chaîne unique (scFv) ciblant l’antigène tumoral ; (2) domaine de charnière ; (3) domaine transmembranaire ; (4) domaine costimulateur des lymphocytes T cytoplasmiques intracellulaires ; et (5) domaine de signalisation. La modification de chacun de ces domaines affecte la précision de l’engagement de la cellule CAR-T avec sa cellule cible3. Par conséquent, l’évaluation de la cytotoxicité et de la réactivité croisée de ces constructions CAR in vitro est essentielle pour choisir la bonne construction pour progresser vers des expériences in vivo. Les méthodes actuelles d’évaluation de la cytolyse par les lymphocytes T comprennent le test de libération de 51Cr, le test de libération de lactate déshydrogénase, le test d’imagerie bioluminescente, l’analyse cellulaire basée sur l’impédance en temps réel et le test de cytométrie en flux cellulaire 4,5. La plate-forme d’imagerie fluorescente décrite ici identifie le nombre de cellules vivantes par rapport aux cellules mortes, ce qui est une quantification directe de la cytolyse des lymphocytes T par opposition à une méthode indirecte d’évaluation de la cytolyse par les lymphocytes T.
Voici une technique simple, rentable, rapide et à haut débit avec une intervention minimale pour évaluer la cytotoxicité des cellules de Jurkat exprimant le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) CAR contre les cellules de cancer du sein triple négatif (TNBC) MDA-MB-231 et les cellules EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231. Les cellules Jurkat sont des lymphocytes T humains immortalisés6 qui ont été largement utilisés pour étudier les mécanismes d’activation et de signalisation des lymphocytes T7. De plus, les cellules de Jurkat ont été utilisées pour des tests in vitro de CAR dans de multiples études 8,9,10,11. Les cellules de Jurkat sont facilement transduites par les lentivirus et ont une prolifération soutenue, et ce système a été exploité pour optimiser le domaine charnière de diverses constructions EGFR CAR.
Ce test peut être utilisé pour le criblage de plusieurs constructions CAR ciblant divers antigènes tumoraux et utilisé contre plusieurs lignées cellulaires tumorales adhérentes et dans divers rapports effecteur/tumeur (E :T). De plus, plusieurs points temporels peuvent être évalués et le nombre de répétitions peut être modifié pour identifier le meilleur abattage parmi les différentes constructions de CAR. Les meilleures constructions doivent être confirmées à l’aide de cellules T CD3 dérivées de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). L’objectif global derrière le développement de cette méthode est d’optimiser rapidement la géométrie de la charnière CAR à haut débit en surmontant des obstacles tels qu’une faible efficacité de transduction, suivie d’une confirmation dans les cellules T dérivées de PBMC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons proposé ici une méthode rapide pour évaluer efficacement l’activité cytolytique spécifique à la cible induite par l’expression de CAR dans les cellules de Jurkat. Toutes les constructions CAR ont le même scFv mais des domaines de charnière et de transmembrane différents dont il a été démontré qu’ils affectent la puissance des cellules CAR-T13. Une évaluation plus poussée de la destruction non spécifique par ces CAR-J a été effectuée en les cultivant avec des cel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231 était un cadeau aimable du Dr Shane Stecklein. Les auteurs reconnaissent le financement du Centre de cancérologie de l’Université du Kansas pour mener cette recherche.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
Riferimenti
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