蛍光イメージングを用いたキメラ抗原受容体を発現するJurkatの迅速 in vitro 細胞毒性評価
Summary
単一の腫瘍の抗原を目標とするキメラ抗原の受容器(CAR)を表現するJurkatのセルによって量的な腫瘍の細胞の殺害を評価するプロトコル。このプロトコルは末梢血得られたT細胞の確認の前にCARの蝶番の構造の急速な最適化のためのスクリーニングのプラットホームとして使用することができる。
Abstract
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、腫瘍学の最前線にあります。CARは、ターゲティングドメイン(通常は一本鎖可変フラグメント、scFv)と、それに付随する鎖内リンカー、それに続くヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインで構成されています。鎖内リンカーおよびヒンジドメインの修飾は、CARを介した死滅に有意な影響を与える可能性があります。CARコンストラクトの各部分にはさまざまなオプションがあるため、多数の順列があります。CAR-T細胞の製造は時間と費用のかかるプロセスであり、多くのコンストラクトの作成とテストには多大な時間と材料の投資が必要です。このプロトコルは、Jurkatセル(CAR-J)のヒンジ最適化CARコンストラクトを迅速に評価するためのプラットフォームを記述しています。Jurkat細胞は、レンチウイルスの取り込み量が多い不死化T細胞株であり、効率的なCAR形質導入を可能にします。ここでは、蛍光イメージャーを用いてCAR-Jを迅速に評価し、PBMC由来T細胞の細胞溶解を確認するためのプラットフォームを紹介します。
Introduction
CAR-T細胞療法は、米国国立がん研究所が報告したように、2017年以降にFDAが承認した6つのCAR-T製品から明らかなように、血液悪性腫瘍において大きな有望性を示しています1。固形腫瘍を標的とする臨床試験には、多数のCAR-T細胞があります。新しいCAR標的を設計し、CARコンストラクトを最適化することは、CAR-T細胞の有効性に不可欠です。腫瘍関連抗原(TAA)を正確に標的とし、正常組織における低レベルのTAA発現を回避するには、各アプリケーションに最適なCARコンストラクトを選択することが不可欠です2。
CARコンストラクトは、主に5つのコンパートメントで構成されています:(1)腫瘍抗原を標的とする細胞外一本鎖可変フラグメント(scFv)ドメイン;(2)ヒンジドメイン;(3)膜貫通ドメイン;(4)細胞内細胞質T細胞共刺激ドメイン;(5)シグナル伝達ドメイン。これらのドメインのそれぞれを修飾することは、その標的細胞3と係合するCAR-T細胞の精度に影響を及ぼす。したがって、これらのCARコンストラクトの細胞毒性と交差反応性をin vitroで評価することは、in vivo実験に向けて進むための適切なコンストラクトを選択するために重要です。T細胞による細胞溶解を評価する現在の方法には、51Cr放出アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ、生物発光イメージングアッセイ、リアルタイムインピーダンスベースの細胞解析、および細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ4,5が含まれる。ここで説明する蛍光イメージングベースのプラットフォームは、生細胞と死細胞の数を同定し、T細胞による細胞溶解を評価する間接的な方法とは対照的に、T細胞細胞溶解の直接的な定量化です。
これは、MDA-MB-231トリプルネガティブ乳がん(TNBC)細胞に対する上皮成長因子受容体(EGFR)CARを発現するJurkat細胞の細胞毒性を評価するための、最小限の介入で、簡単で費用対効果が高く、迅速でハイスループットな技術であり、EGFR CRISPRはMDA-MB-231細胞をノックアウトします。Jurkat細胞は、不死化ヒトTリンパ球細胞6であり、T細胞の活性化とシグナル伝達のメカニズムの研究に広く用いられている7。さらに、Jurkat細胞は、複数の研究でin vitroCAR試験に使用されています8,9,10,11。Jurkat細胞はレンチウイルスによって容易に形質導入され、増殖が持続するため、このシステムはさまざまなEGFR CARコンストラクトのヒンジドメインを最適化するために活用されました。
このアッセイは、さまざまな腫瘍抗原を標的とする複数のCARコンストラクトのスクリーニングに使用でき、複数の接着腫瘍細胞株に対して、さまざまなエフェクターと腫瘍(E:T)の比率で使用できます。さらに、複数の時点を評価し、反復数を変更して、さまざまなCARコンストラクトの中から最適な殺傷を特定することができます。末梢血単核細胞(PBMC)由来のCD3 T細胞を用いて、最良のコンストラクトを確認する必要があります。この方法の開発の背後にある全体的な目標は、CARヒンジ形状をハイスループットで迅速に最適化し、形質導入効率の低さなどの障壁を克服し、PBMC由来のT細胞で確認することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、Jurkat細胞におけるCAR発現によって誘導される標的特異的な細胞溶解活性を効率的に評価するための迅速な方法を提案しました。すべてのCARコンストラクトは、同じscFvを持っていますが、ヒンジドメインと膜貫通ドメインが異なり、CAR-T細胞の効力に影響を与えることが示されています13。これらのCAR-Jによる非特異的死滅のさらなる評価は、抗原ノックアウト(KO…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231は、シェーン・ステックライン博士からの親切な贈り物でした。著者らは、この研究を実施するためにカンザス大学がんセンターから資金提供を受けていることを認めている。
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
Riferimenti
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