Rask in vitro cytotoksisitetsevaluering av Jurkat som uttrykker kimær antigenreseptor ved bruk av fluorescerende avbildning
Summary
En protokoll for å evaluere kvantitativ tumorcelledrap av Jurkat-celler som uttrykker kimær antigenreseptor (CAR) rettet mot enkelttumorantigen. Denne protokollen kan brukes som en screeningplattform for rask optimalisering av CAR-hengselkonstruksjoner før bekreftelse i perifere blodavledede T-celler.
Abstract
Chimeric antigen receptor (CAR) T-celler er i forkant av onkologi. En CAR er konstruert av et målrettingsdomene (vanligvis et enkelt kjedevariabelfragment, scFv), med en tilhørende intrakjedekobling, etterfulgt av et hengsel, transmembran og kostimulerende domene. Modifikasjon av intra-chain linker og hengseldomene kan ha en betydelig effekt på CAR-mediert drap. Tatt i betraktning de mange forskjellige alternativene for hver del av en CAR-konstruksjon, er det et stort antall permutasjoner. Å lage CAR-T-celler er en tidkrevende og kostbar prosess, og å lage og teste mange konstruksjoner er en tung tids- og materialinvestering. Denne protokollen beskriver en plattform for raskt å evaluere hengseloptimaliserte CAR-konstruksjoner i Jurkat-celler (CAR-J). Jurkat-celler er en udødeliggjort T-cellelinje med høyt lentivirusopptak, noe som muliggjør effektiv CAR-transduksjon. Her presenterer vi en plattform for rask evaluering av CAR-J ved hjelp av et fluorescerende bildeapparat, etterfulgt av bekreftelse av cytolyse i PBMC-avledede T-celler.
Introduction
CAR-T-celleterapi har vist stort løfte om hematologiske maligniteter, tydelig fra de 6 FDA-godkjente CAR-T-produktene siden 2017, som rapportert av National Cancer Institute1. Det er mange CAR-T-celler i kliniske studier for å målrette solide svulster. Utvikling av nye CAR-mål og optimalisering av CAR-konstruksjonen er avgjørende for effektiviteten til en CAR-T-celle. Å velge den ideelle CAR-konstruksjonen for hver applikasjon er avgjørende for nøyaktig målretting av tumorassosierte antigener (TAA), samtidig som man unngår lave nivåer av TAA-uttrykk i normalt vev2.
En CAR-konstruksjon er hovedsakelig laget av fem rom: (1) ekstracellulært enkeltkjede variabelt fragment (scFv) domene rettet mot tumorantigen; (2) hengsel domene; (3) transmembran domene; (4) intracellulært cytoplasmatisk T-celle costimulatorisk domene; og (5) signaldomene. Endring av hvert av disse domenene påvirker presisjonen til CAR-T-cellen som engasjerer seg i målcellen3. Derfor er evaluering av cytotoksisiteten og kryssreaktiviteten til disse CAR-konstruksjonene in vitro avgjørende for å velge riktig konstruksjon for å komme videre mot in vivo-eksperimenter. Nåværende metoder for evaluering av cytolyse av T-celler inkluderer 51Cr release assay, laktat dehydrogenase release assay, bioluminescerende imaging assay, real-time impedansbasert celleanalyse og cellebasert flowcytometrianalyse 4,5. Den fluorescerende bildebaserte plattformen beskrevet her identifiserer antall levende vs. døde celler, som er en direkte kvantifisering av T-cellecytolyse i motsetning til en indirekte metode for å evaluere cytolyse av T-celler.
Her er en enkel, kostnadseffektiv, rask og høy gjennomstrømningsteknikk med minimal intervensjon for å evaluere cytotoksisiteten til Jurkat-celler som uttrykker epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) CAR mot MDA-MB-231 trippel-negativ brystkreft (TNBC) celler og EGFR CRISPR slår ut MDA-MB-231-celler. Jurkatceller er udødeliggjorte humane T-lymfocyttceller6 som har blitt mye brukt til å studere T-celleaktivering og signalmekanismer7. Videre har Jurkat-celler blitt brukt til in vitro CAR-testing i flere studier 8,9,10,11. Jurkat-celler blir lett transdusert av lentivirus og har vedvarende spredning, og dette systemet ble utnyttet for å optimalisere hengseldomenet til forskjellige EGFR CAR-konstruksjoner.
Denne analysen kan brukes til screening av flere CAR-konstruksjoner rettet mot forskjellige tumorantigener og brukes mot flere adherente tumorcellelinjer og i forskjellige effektor til tumor (E: T) forhold. I tillegg kan flere tidspunkter evalueres, og antall replikater kan endres for å identifisere beste drap blant de forskjellige CAR-konstruksjonene. De beste konstruksjonene må bekreftes ved bruk av mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) avledet CD3 T-celler. Det overordnede målet bak utviklingen av denne metoden er å raskt optimalisere CAR-hengselgeometrien på en høy gjennomstrømningsmåte som overvinner barrierer som lav transduksjonseffektivitet, etterfulgt av bekreftelse i PBMC-avledede T-celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi foreslått en rask metode for effektivt å evaluere den målspesifikke cytolytiske aktiviteten indusert av CAR-ekspresjon i Jurkat-celler. Alle CAR-konstruksjoner har samme scFv, men forskjellige hengsel- og transmembrandomener som har vist seg å påvirke CAR-T-cellers styrke13. Videre evaluering av uspesifikke drap av disse CAR-J ble gjort ved å dyrke dem med antigen knock out (KO) celler. Dette viser at drapet er tumorantigenspesifikt og ikke skyldes basal aktivering av CAR-J. Cytot…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231 var en snill gave fra Dr. Shane Stecklein. Forfatterne anerkjenner finansiering fra University of Kansas Cancer Center for å gjennomføre denne forskningen.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
Riferimenti
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. . Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- . Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023)
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
