Schnelle In-vitro-Zytotoxizitätsbewertung des Jurkat-exprimierenden chimären Antigenrezeptors mittels Fluoreszenzbildgebung
Summary
Ein Protokoll zur Bewertung der quantitativen Abtötung von Tumorzellen durch Jurkat-Zellen, die chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, der auf ein einzelnes Tumorantigen abzielt. Dieses Protokoll kann als Screening-Plattform für die schnelle Optimierung von CAR-Scharnierkonstrukten vor der Bestätigung in aus dem peripheren Blut gewonnenen T-Zellen verwendet werden.
Abstract
Chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen stehen an der Spitze der Onkologie. Ein CAR besteht aus einer Zieldomäne (in der Regel ein einzelnes kettenvariables Fragment, scFv) mit einem begleitenden Intra-Ketten-Linker, gefolgt von einem Scharnier, einer Transmembran und einer kostimulatorischen Domäne. Die Modifikation des Intra-Chain-Linkers und der Scharnierdomäne kann einen signifikanten Einfluss auf die CAR-vermittelte Tötung haben. In Anbetracht der vielen verschiedenen Optionen für jeden Teil eines CAR-Konstrukts gibt es eine große Anzahl von Permutationen. Die Herstellung von CAR-T-Zellen ist ein zeitaufwändiger und teurer Prozess, und die Herstellung und das Testen vieler Konstrukte ist eine hohe Zeit- und Materialinvestition. Dieses Protokoll beschreibt eine Plattform zur schnellen Evaluierung scharnieroptimierter CAR-Konstrukte in Jurkat-Zellen (CAR-J). Jurkat-Zellen sind eine immortalisierte T-Zelllinie mit hoher Lentivirus-Aufnahme, die eine effiziente CAR-Transduktion ermöglicht. Hier stellen wir eine Plattform zur schnellen Evaluierung von CAR-J mit einem Fluoreszenz-Imager vor, gefolgt von der Bestätigung der Zytolyse in PBMC-abgeleiteten T-Zellen.
Introduction
Die CAR-T-Zelltherapie hat sich bei hämatologischen Malignomen als vielversprechend erwiesen, wie die 6 von der FDA zugelassenen CAR-T-Produkte seit 2017 zeigen, wie das National Cancer Instituteberichtet 1. Es gibt zahlreiche CAR-T-Zellen in klinischen Studien zur Bekämpfung solider Tumore. Die Entwicklung neuartiger CAR-Targets und die Optimierung des CAR-Konstrukts sind entscheidend für die Wirksamkeit einer CAR-T-Zelle. Die Wahl des idealen CAR-Konstrukts für jede Anwendung ist entscheidend für ein genaues Targeting von tumorassoziierten Antigenen (TAA) bei gleichzeitiger Vermeidung einer niedrigen TAA-Expression in normalem Gewebe2.
Ein CAR-Konstrukt besteht hauptsächlich aus fünf Kompartimenten: (1) extrazelluläre einkettige variable Fragmente (scFv)-Domäne, die auf das Tumorantigen abzielt; (2) Scharnier-Domäne; (3) Transmembran-Domäne; (4) intrazelluläre zytoplasmatische T-Zell-komdimulatorische Domäne; und (5) Signalisierungsdomäne. Die Modifikation jeder dieser Domänen beeinflusst die Präzision der CAR-T-Zelle, die mit ihrer Zielzelle3 interagiert. Daher ist die Bewertung der Zytotoxizität und Kreuzreaktivität dieser CAR-Konstrukte in vitro entscheidend, um das richtige Konstrukt für In-vivo-Experimente auszuwählen. Zu den aktuellen Methoden zur Bewertung der Zytolyse durch T-Zellen gehören der 51-Cr-Freisetzungstest, der Laktatdehydrogenase-Freisetzungstest, der biolumineszierende Bildgebungstest, die impedanzbasierte Echtzeit-Zellanalyse und der zellbasierte Durchflusszytometrie-Assay 4,5. Die hier beschriebene auf Fluoreszenzbildgebung basierende Plattform identifiziert die Anzahl lebender vs. toter Zellen, was eine direkte Quantifizierung der T-Zell-Zytolyse im Gegensatz zu einer indirekten Methode zur Bewertung der Zytolyse durch T-Zellen darstellt.
Hier ist eine einfache, kosteneffiziente, schnelle und hochdurchsatztechnische Technik mit minimalen Eingriffen zur Bewertung der Zytotoxizität von Jurkat-Zellen, die den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) CAR exprimieren, gegen MDA-MB-231 triple-negative Brustkrebszellen (TNBC) und EGFR CRISPR knock-out MDA-MB-231-Zellen. Jurkat-Zellen sind immortalisierte menschliche T-Lymphozyten-Zellen6, die häufig für die Untersuchung von T-Zell-Aktivierungs- und Signalmechanismen verwendet werden7. Darüber hinaus wurden Jurkat-Zellen in mehreren Studien für In-vitro-CAR-Tests verwendet 8,9,10,11. Jurkat-Zellen werden leicht durch Lentiviren transduziert und weisen eine anhaltende Proliferation auf, und dieses System wurde genutzt, um die Scharnierdomäne verschiedener EGFR-CAR-Konstrukte zu optimieren.
Dieser Assay kann für das Screening mehrerer CAR-Konstrukte verwendet werden, die auf verschiedene Tumorantigene abzielen und gegen mehrere adhärente Tumorzelllinien und in verschiedenen Effektor-zu-Tumor-Verhältnissen (E:T) verwendet werden. Darüber hinaus können mehrere Zeitpunkte ausgewertet und die Anzahl der Replikate geändert werden, um die beste Tötung unter den verschiedenen CAR-Konstrukten zu identifizieren. Die besten Konstrukte müssen mit CD3-T-Zellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) bestätigt werden. Das übergeordnete Ziel hinter der Entwicklung dieser Methode ist es, die CAR-Scharniergeometrie schnell und mit hohem Durchsatz zu optimieren, um Barrieren wie eine geringe Transduktionseffizienz zu überwinden, gefolgt von einer Bestätigung in PBMC-abgeleiteten T-Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir eine schnelle Methode vorgeschlagen, um die zielspezifische zytolytische Aktivität, die durch die CAR-Expression in Jurkat-Zellen induziert wird, effizient zu bewerten. Alle CAR-Konstrukte haben das gleiche scFv, aber unterschiedliche Scharnier- und Transmembrandomänen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Potenz von CAR-T-Zellen beeinflussen13. Eine weitere Evaluierung der unspezifischen Abtötung durch diese CAR-J erfolgte durch Kultivierung mit Antigen-Knock-out-Zellen (KO). D…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231 waren ein freundliches Geschenk von Dr. Shane Stecklein. Die Autoren danken dem University of Kansas Cancer Center für die Durchführung dieser Forschung.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
Riferimenti
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