Valutazione rapida della citotossicità in vitro del recettore dell'antigene chimerico che esprime Jurkat mediante imaging fluorescente

Siddharth Subham; John D. Jeppson; Benjamin K. Gibbs; Jacqueline Babai; Riza Alker; Andrew K. Godwin; David Akhavan

doi:10.3791/65560

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Articolo metodologico

Valutazione rapida della citotossicità in vitro del recettore dell'antigene chimerico che esprime Jurkat mediante imaging fluorescente

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DOI:

10.3791/65560

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27 ottobre 2023

Siddharth Subham^*¹^,²^,³ , John D. Jeppson^*¹ , Benjamin K. Gibbs⁴ , Jacqueline Babai² , Riza Alker¹ , Andrew K. Godwin⁴^,⁵^,⁶ , David Akhavan¹^,²^,³

¹Department of Radiation Oncology, University of Kansas Cancer Center, ²Department of Cancer Biology, University of Kansas Cancer Center, ³BioEngineering Program, University of Kansas, ⁴Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Kansas Medical Center, ⁵University of Kansas Cancer Center, ⁶Kansas Institute for Precision Medicine, University of Kansas Medical Center

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Un protocollo per valutare l'uccisione quantitativa delle cellule tumorali da parte delle cellule Jurkat che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) mirato all'antigene tumorale singolo. Questo protocollo può essere utilizzato come piattaforma di screening per una rapida ottimizzazione dei costrutti di cerniera CAR prima della conferma nelle cellule T derivate dal sangue periferico.

Abstract

Le cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) sono all'avanguardia in oncologia. Una CAR è costituita da un dominio di targeting (di solito un frammento variabile a catena singola, scFv), con un linker intra-catena di accompagnamento, seguito da un dominio cerniera, transmembrana e costimolatorio. La modifica del linker intra-catena e del dominio della cerniera può avere un effetto significativo sull'uccisione mediata da CAR. Considerando le molte opzioni diverse per ogni parte di un costrutto CAR, esiste un gran numero di permutazioni. La produzione di celle CAR-T è un processo lungo e costoso e la realizzazione e il collaudo di molti costrutti richiede un notevole investimento in termini di tempo e materiali. Questo protocollo descrive una piattaforma per valutare rapidamente i costrutti CAR ottimizzati per cerniera nelle cellule Jurkat (CAR-J). Le cellule Jurkat sono una linea di cellule T immortalizzate con un elevato assorbimento di lentivirus, che consente un'efficiente trasduzione delle CAR. Qui, presentiamo una piattaforma per valutare rapidamente CAR-J utilizzando un imager fluorescente, seguito dalla conferma della citolisi nelle cellule T derivate da PBMC.

Introduzione

La terapia cellulare CAR-T si è dimostrata molto promettente nelle neoplasie ematologiche, come evidenziato dai 6 prodotti CAR-T approvati dalla FDA dal 2017, come riportato dal National Cancer Institute¹. Ci sono numerose cellule CAR-T negli studi clinici per colpire i tumori solidi. La progettazione di nuovi bersagli CAR e l'ottimizzazione del costrutto CAR sono fondamentali per l'efficacia di una cellula CAR-T. La scelta del costrutto CAR ideale per ogni applicazione è essenziale per un targeting accurato degli antigeni associati al tumore (TAA), evitando al contempo bassi livelli di espressione di TAA nei tessuti normali^2<....