Summary
سير عمل تحليلي يعتمد على الكروماتوغرافيا السائلة ، ومطياف حركة الأيونات المحاصرة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة (LC-TIMS-ToF MS / MS) للحصول على ثقة عالية وتحليل "من أسفل إلى أعلى" قابل للتكرار للغاية لتعديلات الهستون وتحديد الهوية بناء على المعلمات الرئيسية (وقت الاحتفاظ [RT] ، المقطع العرضي للتصادم [CCS] ، ونسبة الكتلة إلى الشحنة الدقيقة [m / z]).
Abstract
بروتينات هيستون وفيرة للغاية ومحفوظة بين حقيقيات النوى وتلعب دورا كبيرا في تنظيم الجينات نتيجة للهياكل المعروفة باسم تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs). إن تحديد موضع وطبيعة كل PTM أو نمط من PTMs بالإشارة إلى العوامل الخارجية أو الوراثية يسمح بربط هذه المعلومات إحصائيا بالاستجابات البيولوجية مثل نسخ الحمض النووي أو التكرار أو الإصلاح. في العمل الحالي ، تم وصف بروتوكول تحليلي عالي الإنتاجية للكشف عن PTMs هيستون من العينات البيولوجية. يتيح استخدام الكروماتوغرافيا السائلة التكميلية ، ومطياف الحركة الأيونية المحاصرة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة (LC-TIMS-ToF MS / MS) فصل وتعيين PTM للتعديلات الأكثر صلة بيولوجيا في تحليل واحد. يستفيد النهج الموصوف من التطورات الأخيرة في الحصول على البيانات التابعة (DDA) باستخدام التراكم المتوازي في فخ التنقل ، يليه التجزئة المتسلسلة والتفكك الناجم عن الاصطدام. يتم تعيين Histone PTMs بثقة بناء على وقت الاحتفاظ والتنقل ونمط التجزئة.
Introduction
في الخلايا الحقيقية النوى، يحزم الحمض النووي (DNA) في صورة كروماتين في صورة كروماتين في وحدات وظيفية تسمى النيوكليوسومات. تتكون هذه الوحدات من ثماني من أربعة هيستون أساسية (اثنان من كل من H2A و H2B و H3 و H4) 1،2،3،4. تعد الهستونات من بين البروتينات الأكثر وفرة وحفظا في حقيقيات النوى ، والتي تكون مسؤولة إلى حد كبير عن تنظيم الجينات5. تلعب تعديلات هيستون بعد الترجمة (PTMs) دورا كبيرا في تنظيم ديناميكيات الكروماتين وتلاعب العمليات البيولوجية المختلفة مثل نسخ الحمض النووي والنسخ المتماثل والإصلاح6. تحدث PTMs بشكل أساسي على السطح الذي يمكن الوصول إليه للمناطق الطرفية N من الهستونات التي تتلامس مع DNA 3,7. ومع ذلك ، تؤثر تعديلات الذيل واللب على بنية الكروماتين ، وتغيير التفاعلات بين النوكليوسوم وتجنيد بروتينات معينة 3,8.
يتمثل التحدي الحالي خلال البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) في الشطف المشترك المحتمل للتحليلات ذات الأهمية. وفي حالة التحليلات المعتمدة على البيانات، يترجم ذلك إلى فقدان محتمل للعديد من أيونات السلائف أثناء عملية اقتناء MS/MS 9. تكتسب أجهزة وقت الطيران (ToF) أطيافا بتردد عال جدا 9,10 (حتى عشرات kHz)11 ؛ وهذا يجعلها قادرة على المسح السريع لإجمالي أيونات السلائف داخل عينة معقدة (MS1) ، مما يعد بالحساسية المثلى ومعدلات تسلسل MS / MS (حتى 100 هرتز)9 ويجعلها مثالية لتحليل العينات البيولوجية10. ومع ذلك ، فإن الحساسية المتاحة في معدلات الفحص العالية هذه محدودة بمعدل MS / MS9. تم استخدام إضافة مطياف الحركة الأيونية المحبوسة (TIMS) بالاقتران مع مطياف الكتلة المتعامد رباعي الأقطاب (qToF) للتخفيف من هذه القيود. في TIMS ، تتراكم جميع أيونات السلائف جنبا إلى جنب ويتم استخلاصها كدالة لحركتها ، بدلا من اختيار كتل سليفة مفردة ذات رباعيالقطب 9. يسمح التراكم المتوازي - التجزئة التسلسلية (PASEF) بمئات أحداث MS / MS في الثانية دون أي فقدان للحساسية9.
كان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو إظهار التطورات الأخيرة ل DDA باستخدام التراكم المتوازي في فخ التنقل الذي يتبعه التجزئة المتتالية والتفكك الناجم عن الاصطدام (CID). تم تعيين Histone PTMs بثقة بناء على أوقات الاحتفاظ (RTs) ، والتنقلات ، وأنماط التجزئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم استخراج عينات هيستون باستخدام طريقة مقتبسة من Bhanu et al. (2020) 12.
1. إعداد العينة
- حصاد الخلايا المستزرعة
- عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، تأكد من أنها قابلة للحياة باستخدام استبعاد التريبان الأزرق.
ملاحظة: تم استخدام خط خلايا HeLa S3 لهذه التجارب ، ولكن يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي خلايا مستزرعة. - نضح الوسائط ، ثم ضع 5 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) على كل لوحة.
- قم بتدوير اللوحة (اللوحات) لشطف جميع الوسائط المتبقية ، ثم قم بشفط PBS وتطبيق 5 مل من 1x PBS.
- افصل الخلايا برفق عن اللوحة عن طريق كشطها باستخدام رافع خلية يمكن التخلص منه.
- انقل كل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
- بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 5 دقائق.
- نضح برنامج تلفزيوني من بيليه الخلية.
- انتقل إلى استخراج هيستون.
ملاحظة: قم بتجميد حبيبات الخلية في النيتروجين السائل إذا تعذر معالجتها على الفور. قم بتخزين الكريات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.
- عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، تأكد من أنها قابلة للحياة باستخدام استبعاد التريبان الأزرق.
- استخراج هيستون
- تقدير حجم كل بيليه الخلية ووضع علامة على الغضروف المفصلي مع علامة دائمة.
- تحضير ما يكفي من عازلة العزل النووي (NIB ؛ 15 mM Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 15 mM NaCl ، 60 mM KCl ، 5 mM MgCl2 ، 1 mM CaCl2 ، و 250 mM السكروز) لجميع العينات. بدلا من ذلك ، إذا كانت هناك حاجة إلى معالجة العديد من العينات بمرور الوقت ، فقم بعمل المخزن المؤقت بكميات كبيرة وتخزينه في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر ، أو قم بتجميد القسمة وتجميدها عند -15 درجة مئوية إلى -25 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى عن طريق إذابة الكمية اللازمة فقط لكل عملية استخراج.
ملاحظة: يجب أن يظل المخزن المؤقت واضحا أثناء التخزين. إذا اتخذ المخزن المؤقت مظهرا غائما أو غير طبيعي في أي وقت ، فتخلص من المخزن المؤقت الجديد وقم بإعداده. - تحضير 50 ضعف حجم كريات الخلية من العازلة للغسيل وإضافة مثبطات على النحو التالي (حوالي 10 مل من العازلة للغسيل لكل 2 عينات).
- لتحضير 10 مل من محلول الغسيل ، امزج 10 مل من NIB ، 30 ميكرولتر من 200 mM 4- (2-aminoethyl) بنزين سلفونيل فلوريد هيدروكلوريد [AEBSF] ، 10 ميكرولتر من 1 M dithiothreitol [DTT] ، 20 ميكرولتر من 5 ميكروسيستين ميكرومتر ، 20 ميكرولتر من 5 M زبدات الصوديوم.
- قم بإزالة 1/5 من المخزن المؤقت للغسيل لتحضير المخزن المؤقت للتحلل (حجم 1/5 من المخزن المؤقت للغسيل ، 0.3٪ NP-40 أو بديل NP-40).
ملاحظة: لا تستخدم Triton-X 100 بدلا من بديل NP-40 أو NP-40 ، لأنه قد يكون كاشطا جدا لأنواع معينة من الخلايا. - اغسل حبيبات الخلية جيدا عن طريق تعليقها في 5 أعمدة من المخزن المؤقت للغسيل والطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أكمل هذه الخطوة مرتين ، مع شفط والتخلص من المادة الطافية بين الغسلات.
- تأكد من أن حجم حبيبات الخلية لا يزال مميزا بعلامة دائمة. إعادة التعليق في 10 مجلدات من المخزن المؤقت للتحلل.
- اخلطي كل حبة جيدا لإنعاشها ، ثم احتضانها لمدة 15 دقيقة على الثلج.
- بعد 15 دقيقة ، أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- نضح وتجاهل طاف.
ملاحظة: يجب أن تقلل الحبيبات إلى ≤ 1/2 حجم الحبيبات الأصلي (كما هو موضح بخط العلامة). إذا لم تنخفض الحبيبات بشكل كاف ، كرر إجراء التحلل وقم بتضمين خطوة تجانس لطيفة باستخدام مدقة لفتح الخلايا. - بمجرد اكتمال التحلل ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل ، ثم الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح وتخلص من المادة الطافية ، ثم كرر خطوة الغسيل مرة أخرى لإزالة جميع آثار NP-40.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، تتكون الحبيبات من الكروماتين الذي يحتوي على هستونات. - أعد تعليق الحبيبات في 5 مجلدات (من حجم حبيبات الخلية الأصلي) من 0.4 N H2SO4.
- احتضان لمدة 2 ساعة في غرفة باردة أو ثلاجة باستخدام المحرض.
- بعد 2 ساعة ، قم بطرد مركزي للعينة (العينات) عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. لا تتخلص من المادة الطافية.
- نقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة ، ورفع حمض ثلاثي كلورو الخليك بنسبة 100٪ (TCA) إلى 1/3 حجم المحتويات (سيكون تركيز TCA النهائي حوالي 20٪).
- اقلب الأنبوب برفق ولاحظ أن المحلول الصافي عديم اللون يتحول إلى اللون الأبيض و / أو الغائم ، مما يشير إلى ترسيب البروتين.
ملاحظة: بالنسبة للمحاليل ذات تركيزات الهستون المنخفضة ، قد لا يكون ترسيب البروتين ملحوظا على الفور ، ولكن يجب أن يكون الراسب مرئيا بعد الحضانة طوال الليل. - احتضان دون اضطراب بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) عند 4 درجات مئوية لترسيب بروتينات الهستون تماما.
- في اليوم التالي ، أجهزة الطرد المركزي عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- نضح الطافع ، مع الحرص على عدم لمس جوانب الأنبوب بطرف الماصة. في هذه المرحلة ، يتم ترسيب الهستونات بشكل أساسي كفيلم حول جوانب الأنبوب (الأنابيب).
- أضف 500 ميكرولتر من الأسيتون المثلج + 0.1٪ حمض الهيدروكلوريك (الأسيتون الحمضي) إلى كل أنبوب ، باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، ثم اقلب الأنبوب (الأنابيب) برفق عدة مرات. رتب العينات بالترتيب (1 ، 2 ، 3 ، إلخ) أثناء القيام بذلك ، لأن أي أسيتون خاطئ قد يزيل العلامات الموجودة على الأنابيب. جهاز طرد مركزي عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وصب المادة الطافية برفق.
- كرر خطوة الشطف هذه مع 500 ميكرولتر من الأسيتون المثلج 100٪ ، أيضا باستخدام ماصة باستور زجاجية. جهاز طرد مركزي عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وصب المادة الطافية برفق.
- اترك الأنابيب مفتوحة لتجف في درجة حرارة الغرفة حتى يتبخر الأسيتون المتبقي.
- عندما تجف ، أضف 100 ميكرولتر من ماء قياس الطيف الكتلي (MS) إلى كل أنبوب. استخدم هذه القطرة لمسح جميع جوانب الحاوية لإعادة تعليق فيلم هيستون بالكامل. افعل ذلك عن طريق سحب القطرة على جانب الأنبوب وتدويرها أثناء السحب لأعلى ولأسفل أو توزيع نصف 100 ميكرولتر واستخدام الطرف لتحريكها في كل مكان. مزيج من كلتا الطريقتين يعمل بشكل أفضل. الهستونات قابلة للذوبان في الماء بسهولة وستكون في المحلول.
- بعد تعليق جميع العينات ، إذا كان هناك أي مادة صلبة بيضاء متبقية ، صوتنة في الحمام في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل الحل واضحة إلى أنابيب جديدة. تخلص من أي حبيبات غير قابلة للذوبان متبقية.
- قم بتشغيل SDS-PAGE تحت ظروف التقليل للتحقق من أن الاستخراج نظيف.
ملاحظة: يمكن تشغيل المواد الهلامية باستخدام أي تركيز مناسب من بولي أكريلاميد طالما أنه يمكن أن يميز البروتينات في حدود 10-20 كيلو دالتون. انظر جدول المواد للمواد الهلامية المستخدمة في هذا البروتوكول. - قم بإجراء فحص تركيز البروتين (أي برادفورد أو BCA) لتحديد تركيز البروتين الكلي.
- الاشتقاق الكيميائي (البروبيونيلاتيون) لبقايا اللايسين
- نقل 20 ميكروغرام من الهستونات (يحددها فحص البروتين) إلى أنبوب نظيف. جفف هذه العينة إلى <5 ميكرولتر باستخدام مكثف فراغ ، ثم أعد التعليق باستخدام 20 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 100 مللي متر (NH4CO3) (~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر محلول). اضبط الرقم الهيدروجيني على ~ 8 باستخدام هيدروكسيد الأمونيوم إذا لزم الأمر.
تنبيه: لا تستخدم هيدروكسيد الأمونيوم (NH4OH) للإنعاش ، فقط لضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر. خلاف ذلك ، سوف تتشوه البروتينات وتترسب.
ملاحظة: للتحقق من الرقم الهيدروجيني بأقل قدر من فقدان العينة، استخدم طرف ماصة للغمس في العينة وربت على شريط الأس الهيدروجيني. سيكون إجراء الاختبار هذا مفيدا خلال خطوات تحضير العينة المتبقية. - تحضير كاشف البروبيونيلات عن طريق إضافة أنهيدريد البروبيونيك إلى الأسيتونيتريل (ACN) بنسبة 1: 3 (v / v) (أي لصنع 40 ميكرولتر من الكاشف ، اجمع 10 ميكرولتر من أنهيدريد البروبيونيك مع 30 ميكرولتر من ACN).
ملاحظة: تقليديا ، تم استخدام الميثانول أو الأيزوبروبانول في تحضير كاشف البروبيونيل. وبما أن البروبيونيلات تفاعل لتكوين أميد، يلزم وجود مذيب غير بروتوني، مثل الأسيتونيتريل، لمنع المنتجات الجانبية والتفاعلات غير المرغوب فيها، مثل إستر ميثيل بروبيونيل، الذي ينتج عن استخدام الميثانول. قم فقط بإعداد ما يكفي من كاشف البروبيونيلات لما يصل إلى 4 عينات في المرة الواحدة حتى يظل الكاشف طازجا. استخدم الكاشف في غضون 1-2 دقيقة من التحضير. أثناء وضع الكاشف ، سيتفاعل أنهيدريد البروبيونيك مع أي رطوبة محيطة ، وسيبدأ حمض الأسيتيك في التكون ، مما قد يغير فعالية الكاشف وسيغير الرقم الهيدروجيني لمحلول الهستون بمجرد إضافة الكاشف. - أضف كاشف البروبيونيلات إلى كل عينة في 1: 4 (v / v) (أي ، ل 20 ميكرولتر من الهستونات ، أضف 5 ميكرولتر من كاشف البروبيونيل).
- أضف بسرعة 1: 5 (v / v) NH4OH (أي أضف 4 ميكرولتر مقابل 20 ميكرولتر من محلول هيستون) لإعادة إنشاء الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى ~ 8. إذا كان الرقم الهيدروجيني لا يزال منخفضا جدا ، أضف 1-2 ميكرولتر من NH4OH في المرة الواحدة حتى يتم تحقيق درجة الحموضة 8. عادة ما تكون نسبة 1: 5 (v / v) كافية.
- احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة دون إزعاج.
- كرر تفاعل البروبيونيلات لما لا يزيد عن 3-4 عينات لكل دفعة من كاشف البروبيونيلات لضمان الحد الأدنى من تكوين الحمض.
- كرر خطوات إجراء البروبيونيلات 1.3.2-1.3.5. تضمن الجولة الثانية من البروبيونيلات اشتقاق >95٪ من اللايسينات المتاحة.
- جفف العينات حتى <5 ميكرولتر باستخدام مكثف فراغ. سيؤدي ذلك إلى تبخر أي كاشف بروبيونيل غير متفاعل ، ومنتجات حمضية ، وغاز الأمونيا المنطلق من NH4OH. إذا جفت العينات تماما ، فلا بأس بذلك ، حيث لا تحدث خسائر كبيرة في العينة.
ملاحظة: قم بإزاحة الهواء في زجاجة أنهيدريد البروبيونيك بغاز الأرجون قبل التخزين لمنع تكوين حمض الأسيتيك بسبب ملامسته للرطوبة المحيطة المتبقية في الزجاجة.
- نقل 20 ميكروغرام من الهستونات (يحددها فحص البروتين) إلى أنبوب نظيف. جفف هذه العينة إلى <5 ميكرولتر باستخدام مكثف فراغ ، ثم أعد التعليق باستخدام 20 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 100 مللي متر (NH4CO3) (~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر محلول). اضبط الرقم الهيدروجيني على ~ 8 باستخدام هيدروكسيد الأمونيوم إذا لزم الأمر.
- الهضم المحلل للبروتين مع التربسين
- أعد تعليق الهستونات في 100 mM NH4HCO3 لتحقيق حجم 20 ميكرولتر ، وتحقيق تركيز مثالي يبلغ 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
ملاحظة: ستؤدي محاليل العينات ذات التركيزات الأقل من 1 ميكروغرام / ميكرولتر إلى انخفاض كفاءة التربسين. - أضف التربسين إلى عينات الهستون بنسبة 1:10 (بالوزن / الوزن) (أي أضف 2 ميكرولتر من محلول 1 ميكروغرام / ميكرولتر من التربسين إلى 20 ميكروغرام من الهستونات).
- احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعات. بدلا من ذلك ، احتضان بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) في درجة حرارة الغرفة.
- أوقف عملية الهضم عن طريق التجميد عند -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
ملاحظة: لا تستخدم الحمض لإخماد تفاعل الهضم ، لأن هذا سيؤدي إلى انخفاض غير مرغوب فيه في درجة الحموضة في هذه المرحلة من الإجراء. يمكن تخزين العينة عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة (نقطة التوقف المؤقتة).
- أعد تعليق الهستونات في 100 mM NH4HCO3 لتحقيق حجم 20 ميكرولتر ، وتحقيق تركيز مثالي يبلغ 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
- الاشتقاق الكيميائي (البروبيونيل) لأطراف الببتيد N
- جفف العينات إلى <5 ميكرولتر باستخدام مكثف فراغ.
- أعد تعليق العينات حتى 20 ميكرولتر (1 ميكروغرام / ميكرولتر) باستخدام 100 mM NH4HCO3.
- كرر البروبيونيلات كما كان من قبل (الخطوة 1.3).
ملاحظة: من الطبيعي أن تستغرق العينات وقتا أطول لتجف في هذه الخطوة بسبب ارتفاع نسبة الطور العضوي: المائي.
- عينة تحلية مع نصائح المرحلة
- أعد تعليق أو تخفيف العينات باستخدام 50 ميكرولتر من الماء بدرجة MS + 0.1٪ TFA.
- باستخدام آلة حفر العينات 11-G ، قم بثقب 5 أقراص من مادة C18 من قرص استخراج الطور الصلب (قم بثقب جميع الأقراص الخمسة قبل نقلها إلى طرف الماصة). أدخل الأقراص وتأكد من تثبيتها بشكل آمن ومتساو في الجزء السفلي من طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر (الشكل 1).
ملاحظة: استخدم 15-G corer في حالة تحلية أكثر من 25 ميكروغرام من العينة من خلال طرف مرحلة واحد. - استخدم محول طرد مركزي لتثبيت أطراف المسرح في مكانها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل أو 2 مل.
ملاحظة: بالنسبة لخطوات الطرد المركزي التالية ، استخدم ثورة بطيئة (400-500 × جم) عند 4 درجات مئوية ، لمدة 1-2 دقيقة في المرة الواحدة ؛ تمر المذيبات عادة عبر الراتنج في أقل من 1 دقيقة ، اعتمادا على مدى إحكام تعبئة مادة C18 في الأطراف. - شطف الراتنج عن طريق الطرد المركزي مع 50 ميكرولتر من 100٪ أسيتونيتريل لتنشيط مادة C18 وإزالة الملوثات المحتملة.
ملاحظة: قد يكون من الأسهل تحميل المحاليل على أطراف المرحلة باستخدام أطراف ماصة تحميل الهلام. بمجرد تنشيط مادة C18 ، من المهم عدم السماح للراتنج بالجفاف طوال مدة إجراء التحلية. - موازنة مادة القرص مع 80 ميكرولتر من الماء بدرجة MS + 0.1٪ TFA عن طريق الطرد المركزي.
- تحمض العينة إلى درجة الحموضة 4 أو أقل باستخدام حمض الخليك الجليدي. تحقق من درجة الحموضة باستخدام شرائط الأس الهيدروجيني كما كان من قبل لتقليل فقد العينة.
- قم بتحميل العينة بأكملها على قرص الراتنج عن طريق الطرد المركزي البطيء.
- اغسل العينة ب 80 ميكرولتر من الماء بدرجة MS + 0.1٪ TFA عن طريق الطرد المركزي.
- قم بسحب العينة في أنبوب نظيف سعة 1.5 مل عن طريق شطف 70 ميكرولتر من 75٪ أسيتونيتريل و 0.5٪ حمض الخليك عن طريق الطرد المركزي البطيء. يمكن استخدام وقت إضافي للطرد المركزي لضمان استخلاص حجم العينة الكامل من طرف المرحلة. لا بأس إذا جف الراتنج مع وقت الطرد المركزي الإضافي ، حيث لم تعد هناك حاجة إليه بعد شطف العينة.
- جفف كل عينة تماما في مكثف فراغ.
ملاحظة: يمكن تخزين العينة (العينات) عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة (نقطة التوقف المؤقتة). - لتحليل LC-MS / MS ، أعد تكوين العينات في حجم المذيب A (0.1٪ حمض الفورميك) من بروتوكول الكروماتوغرافيا السائلة (LC) الذي يعطي التركيز النهائي البالغ 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر (أي إذابة 20 ميكروغرام من الهستونات في 50 ميكرولتر من المذيب أ).
2. واجهة برنامج TIMS
- حدد علامة التبويب الأداة وانتقل إلى تشغيل (تحقق من تمييز اسم الأداة باللون الأخضر) (الشكل 2).
- تحقق من معلمات TIMS (الشكل 2).
- تحقق من إعدادات MS (بدء المسح ، نهاية المسح ، قطبية الأيونات ، وضع المسح) (الشكل 2).
- تحقق من إعدادات TIMS (الوضع ، بدء التنقل ، نهاية التنقل ، وقت المنحدر ، وقت التراكم ، دورة العمل ، معدل المنحدر ، معدل MS ، متوسط MS ، والمعايرة التلقائية) (الشكل 2).
- انتقل إلى علامة التبويب المصدر وقم بتنشيط خيار الحقنة (Hamilton 500 μL) فقط لخطوة معايرة TuneMix (الشكل 3)13.
- انتقل إلى علامة التبويب المعايرة ، وانقر فوق m / z ، وحدد وضع المعايرة ، واختر الوضع (Q المحسن ، بشكل عام) ، والتكبير (+ 0.01٪) STD Dev (0.24) ، وانقر فوق معايرة ؛ عند تحقيق درجة 100٪ ، اقبل (الشكل 4).
- انتقل إلى علامة تبويب التنقل وكرر عملية المعايرة (الوضع الخطي ، بشكل عام) ، نطاق الكشف (+5٪) ، العرض (0.1 Da) ، STD Dev (0.1855) ، ثم انقر فوق معايرة ؛ عندما تحصل على درجة ≥ 98.5٪ ، تقبل (الشكل 5).
- انتقل إلى الطريقة وحدد الطريقة المراد استخدامها ؛ على سبيل المثال ، تم اختيار Proteomic_ / 2023-01-19-CF / 20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d / 451.m-TimsControl (الشكل 5).
3. LC-TIMS-PASEF-TOF MS / MS
- استخدم ظروف تشغيل nESI النموذجية: جهد شعري 4500 فولت ، إزاحة لوحة طرفية 800 فولت ، ضغط رذاذات 3.0 بار ، غاز جاف 10.0 لتر / دقيقة ، سخان جاف 200 درجة مئوية ، ومعدل تدفق حقن 50 ميكرولتر / دقيقة.
- استخدم إعدادات MS النموذجية: طاقة تصادم 6 فولت ، 1200 فولت RF تصادم ، وقت نقل 75 ميكرو ثانية ، تخزين نبضي 5 ميكرو ثانية.
- حدد تدفق غاز الانجراف باستخدام فرق الضغط من قمع المدخل P1 وقمع الخروج P2. يحدث التراكم المتوازي - التجزئة التسلسلية (PASEF) في خلية TIMS ، حيث تتراكم جميع أيونات السلائف في وقت واحد وليس بشكل فردي. ثم يتم إطلاق أيونات السلائف في قمم أيونية ضيقة مقابل قمم أيون أوسع عادة (حوالي 50 مرة أقصر) ، مما يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء مع الاستمرار في فصل الببتيدات المحملة عبر التنقل14.
- تطوير طريقة LC-TIMS-ToF MS / MS لتحليل ببتيدات الهستون المحللة للبروتين. قم بإقران كروماتوجراف سائل عالي الأداء (HPLC) مزود بعمود C18 (300 Å ، 5 μm ، 4.6 مم × 250 مم) مع أداة TIMS-TOF MS التجارية مع تقنية PASEF الخاصة.
ملاحظة: تم تحديد حجم العمود هذا لتوفير فصل جيد عند كل من الأس الهيدروجيني العالي والمنخفض لمخاليط الببتيد ، بناء على الأعمال المنشورة سابقا15،16،17.- اضبط حجم الحقن على 20 ميكرولتر (8 ميكروغرام) من العينة ومعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة.
- قم بتشغيل تدرج LC غير خطي لمدة 60 دقيقة باستخدام الماء مع 0.1٪ حمض الفورميك (المذيب أ) والأسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض الفورميك (المذيب ب). اضبط التدرج: 10٪ B لمدة 2.7 دقيقة ، ثم إلى 20٪ B في 5.3 دقيقة ، و 28٪ B في 4 دقائق ، و 35٪ B في 18 دقيقة أخرى ، و 40٪ B في 13 دقيقة ، و 100٪ B في دقيقتين أخريين. بعد الضغط على 100٪ B لمدة 5 دقائق ، اخفض التركيز إلى 10٪ B في 5 دقائق واستمر لمدة 5 دقائق الأخيرة.
- تحقق من شطف العينة من HPLC إلى TIMS-TOF عبر تأين النانو الكهربائي (nESI) في وضع التأين الموجب.
4. تحليل البيانات
- تحديد تسلسلات الببتيد ومواقع التعديل.
- قم بإعداد قائمة نظرية بالببتيدات باستخدام ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] تحت أداة MS-digest.
- قم بإجراء ملخص نظري مع مراعاة ظروف الهضم (الإنزيم المستخدم) ، وأنواع PTMs التي يتم البحث عنها (على سبيل المثال ، أحادي أو ثنائي أو ثلاثي ميثيل) ، ونطاق حجم الببتيدات التي يتم البحث عنها ، بالإضافة إلى نطاق الكشف الشامل والعدد المحتمل للانقسامات المفقودة.
- قم بإعداد قائمة نظرية بالببتيدات باستخدام ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] تحت أداة MS-digest.
- تحليل البيانات المكتسبة يدويا بناء على الببتيدات النظرية (الشكل 6)12.
- يتم البحث عن الكتل في عدة حالات شحن (+1 إلى +4) لكل ببتيد نظري.
- بعد التحديد الأولي لكل m / z ، حدد القمة وقم بتأكيد MS / MS باستخدام قائمة نظرية لأيونات التجزئة بناء على تسلسل الببتيد ، بما في ذلك PTMs.
ملاحظة: إذا كانت حركة الببتيد المحدد معروفة سابقا ، فهذا مؤكد أيضا.
- احسب الوفرة النسبية لمختلف PTMs وأبلغ عن كل تعديل كنسبة مئوية من تسلسل الببتيد المحدد.
- يتم حساب الوفرة النسبية لكل PTM المكتشف باستخدام المعادلة التالية:
الوفرة النسبية = مساحة PTM / المساحة الإجمالية للببتيد غير المعدل و PTMs لببتيد معين
- يتم حساب الوفرة النسبية لكل PTM المكتشف باستخدام المعادلة التالية:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عادة ما يتضمن سير العمل البروتيني من أسفل إلى أعلى (الشكل 7) ما يلي: استخراج البروتين (البروتينات) المستهدف من عينة خام ، متبوعا بتحديد تركيز البروتين (البروتينات) ، ثم التجزئة ، عادة عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي أو اللوني السائل. بعد التجزئة ، يتم هضم البروتينات باستخدام إنزيم محلل للبروتين (غالبا التربسين) ، وأخيرا ، التحليل الطيفي الكتلي للببتيدات الناتجة وتحديد البروتين باستخدام قاعدة بيانات ثابتة18. تستمد معلومات التسلسل من أيونات السلائف ضمن نطاق الكتلة إلى الشحنة (m / z) المشار إليه ، والتي تخضع للتفكك الناجم عن الاصطدام (CID) ، مما ينتج عنه أنماط تجزئة يتم تحديدها وتسلسلها باستخدام قاعدة بيانات19 (الشكل 8).
بالنسبة لهذا العمل ، كان الهدف الرئيسي هو تطوير وتطبيق طريقة LC-TIMS-PASEF-ToF MS / MS DDA باتباع الخطوات الموضحة سابقا في قسم البروتوكول. وقد شكل تحديد موضع التعديلات اللاحقة للترجمة على الببتيدات الأيزومرية والمتساوية الضغط تحديا خاصا فيما يتعلق بتحديد الهوية وتفسير الطيف. في هذه الدراسة ، تم استخدام معايير الهستون البشري المؤتلف وخلايا HeLa S3 كعينات.
أظهر تحليل هيستون PTM لمعايير الهستون البشري عبر ESI-TIMS-PASEF-ToF MS / MS ببتيدات متوسطة إلى كبيرة الحجم (3-30 حمضا أمينيا في الطول) تم اكتشافها بما يصل إلى 5 شحنات لكل ببتيد. كان إجراء البروبيونيلات ناجحا في إنتاج ببتيدات أطول وأكثر إفادة من تلك التي ينتجها الهضم التربتيكي عادة. عند تحليل البيانات ، تم تحديد الببتيدات في حالات معدلة مختلفة. كميزة ، ميزت الطريقة القائمة على TIMS بعض الببتيدات الأيزومرية الموضعية التي تحمل نفس PTMs. على سبيل المثال ، قد يتداخل نوعان متساويان في وقت الاحتفاظ و m / z ؛ ومع ذلك ، يمكن فصل الإشارتين في مجال التنقل (الشكل 9).
تم شرح أطياف التجزئة المقابلة للببتيدات الموضحة في الشكل 9 بواسطة برنامج تحليل بروتيني باستخدام ملفات FASTA المناسبة. في الشكل 9 أ ، يظهر الببتيد غير المعدل مع ثلاث مجموعات بروبيونيل (+56.03) (على محطة N ، ليسين 18 ، وليسين 23). في الشكل 9B ، لوحظ الببتيد مع مجموعة أسيتيل (+42.02) على ليسين 18 ومجموعتين من البروبيونيل (واحدة في محطة N والأخرى على ليسين 23). أخيرا ، في الشكل 9C ، يظهر الببتيد مع أستلة لوحظت على ليسين 23 ومجموعتين من البروبيونيل (على N-terminal و lysine 18). كما نشر سابقا ، يمكن استخدام ميزة PASEF لزيادة سرعة التسلسل والحساسية من خلال استهداف نفس الميزة بشكل متكرر9. هذا يسمح للمستخدم بالحصول على مزيد من المعلومات الهيكلية من العينات البيولوجية. في هذه الحالة ، يتم تطبيق هذا على نوع وموضع PTMs التي تحدث على كل هستون.
يمكن أيضا تمثيل تحليل التعديل بعد الترجمة بصريا كمخطط تغطية تسلسلية ، كما هو موضح في الشكل 10. في الشكل 10A ، يظهر معيار هيستون H3 الذي تم بروبيونيل قبل الهضم ، مع ببتيدات أطول مما كان يمكن أن ينتج بخلاف ذلك ، ويرمز إليه بالخطوط الزرقاء. تمت معالجة الهستونات المستخرجة من خلايا HeLa S3 بنفس الطريقة ، كما هو موضح في الشكل 10B. تمت الإشارة إلى العديد من PTMs ، بما في ذلك العديد من الأنماط المختلفة في نفس مواقع الأحماض الأمينية. وهذا متوقع من العينات البيولوجية. تجدر الإشارة إلى أن الخطوط الرمادية القليلة في الشكل 10B تشير إلى الببتيدات التي تم تحديدها بشكل غامض بسبب عدم وجود MS2 الناتج عن الكثافة المنخفضة.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي وإنتاج نصائح المسرح. (A-G) دليل خطوة بخطوة حول تصنيع طرف مرحلة قرص السيليكا C18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: معالجة البيانات: 20210804 الهستونات القياسية البروبيونيلات Mix_QC الببتيد. قبل البدء في معالجة البيانات ، تأكد من إعداد القائمة النظرية لحالات الشحن المحتملة وتجزئتها (1550.9013 ؛ 775.9543 ؛ 517.6386 ؛ إلخ) لاستخراج هذه القيم من مخطط كروماتوجرام الذروة الأساسي (BPC + All MS). بعد استخراج كل ببتيد ، تأكد من أنه يشبه قائمة التحليل الموضحة في الشكل. تم اختيار القمة 775.9543 كمثال. على الجانب الأيمن من الشكل ، يتم عرض ثلاثة رسوم بيانية: الأول يتوافق مع الكروماتوجرام (الرسم البياني للكثافة مقابل الوقت) ، والثاني مع مخطط الحركة ، والثالث مع الطيف الكتلي مع تضمين تجزئة PASEF. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: خطوات بروتوكول timsControl 1-4. يوضح الشكل الخطوات الأربع الأولى من إجراء timsControl. في الجانب العلوي الأيسر ، انقر فوق الزر Instrument لتشغيل وإيقاف الاتصال بين الجهاز والبرنامج. قبل تنفيذ أي مهمة ، يجب على المرء التأكد من أن البرنامج في وضع التشغيل. وأخيرا، تحقق من صحة معلمات TIMS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: معلمات المصدر. في هذه الحالة ، تم استخدام حقنة هاميلتون 500 ميكرولتر فقط ل TuneMix. تحقق من أن المعلمات الأخرى تظل صحيحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: معايرة الكتلة إلى الشحن (م / ض). حدد معايرة حتى يتم الحصول على درجة 100٪ في وضع معايرة اللوحة السفلية اليمنى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: معايرة التنقل. حدد معايرة حتى يتم الحصول على درجة 98.5٪ على الأقل في وضع معايرة اللوحة السفلية اليمنى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: سير عمل البروتيوميات النموذجي من أسفل إلى أعلى. خطوة بخطوة من الإجراءات من أسفل إلى أعلى من إعداد العينة إلى تحديدالهوية 9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: وقت الاستبقاء، والنمط النظيري، وملامح التنقل H3 18-26. (أ) بروبيونيل غير معدل، (ب) بروبيونيل ببتيد K23Ac في الموضعين الآخرين، (ج) بروبيونيل K18Ac في الموضعين الآخرين. لاحظ مزايا فصل التنقل لحالة الأيزومرات الهيكلية الموضحة في اللوحتين B و C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 9: مثال على تسلسل الببتيد المجزأ MS / MS باستخدام PASEF. تم الحصول على أطياف الشظايا من برنامج التحليل البروتيني للببتيد H3 مع مواضع الأحماض الأمينية 18-26. (أ) بروبيونيل غير معدل ، (ب) بروبيونيل ببتيد K23Ac في الموضعين الآخرين ، و (ج) بروبيونيل K18Ac في الموضعين الآخرين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: مثال على ملخص تحليل PTM الهستون البصري. نتائج الببتيدات المرصودة و PTMs من (A) معيار H3 و (B) H3 من خلايا HeLa S3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: خصائص الببتيد القياسي و HeLa S3 LC-TIMS-ToF MS / MS. قائمة الببتيد المستهدفة والمرصودة ، بما في ذلك الخصائص التجريبية (أي وقت الاحتفاظ ، m / z ، 1 / Ko ، ومناطق ذروة LC). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهستونات هي بروتينات أساسية تنظم بنية الكروماتين من خلال التفاعل مع الحمض النووي في شكل أوكتامرات تتكون من أربعة هيستون أساسية (اثنان من كل من H2A و H2B و H3 و H4)20. تحتوي الهستونات على العديد من بقايا اللايسين والأرجينين ، والتي يتم تعديلها بسهولة ، مما يؤدي إلى PTMs واسعة النطاق التي تغير كيمياء الكروماتين عن طريق التأثير على وظيفة الهستون أو عن طريق الارتباط بالبروتينات الخلوية الأخرى21. يمكن أن تثير PTMs استجابات بيولوجية من خلال العمل جنبا إلى جنب ، مع مجموعات محددة من PTMs تم الإبلاغ عنها في العديد من الأمراض ، وأبرزها عدة أنواع من السرطان22.
عندما يتم التعرف على تلف الحمض النووي على المستوى الخلوي ، يتبعه على الفور عمل سلسلة إشارات معقدة حيث يتم تمييز الآفات ، يليها تنسيق تقدم دورة الخلية وتفعيل مسارات الإصلاح المطلوبة. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي تلف الحمض النووي إلى تعديلات مختلفة ، مثل الأسيتيل والميثيل adducts ، والتي تسهل تجنيد البروتين23. يؤدي التنوع الكبير في PTMs التي تشارك في آفات الحمض النووي إلى السؤال عن كيفية تنظيم هذه الآليات الجزيئية لتعايشها وما هي الأهمية الوظيفية للدفاع عن سلامة الجينوم من خلال شبكة متكاملة معقدة للغاية. على سبيل المثال ، تم ربط ليسين 9 ثلاثي ميثيل هيستون H3 (H3K9me3) بأمراض مختلفة في أمراض مختلفة24. لأسباب مثل هذه ، من الضروري تطوير منهجيات تحليلية مفيدة تسمح بالتوصيف الكامل لهذه التعديلات على المستوى الخلوي23.
كشف تحليل مستخلصات هيستون HeLa S3 باستخدام برنامج تحليل البيانات اليدوي وبرنامج التحليل البروتيني عن PTMs ، بما في ذلك أستلة (+42.01 Da) ، ميثيل بروبيونيل (+70.04 Da) ، ثنائي ميثيل (+28.03 Da) ، وثلاثي ميثيل (+42.05) للعديد من بروتينات الهستون. بالإضافة إلى ذلك ، تمكنت طريقة MS / MS المستندة إلى PASEF من التمييز بين بعض الببتيدات الأيزومرية الموضعية التي تحمل نفس PTMs.
في المقدمة ، تم وصف مزايا اقتران LC-TIMS-ToF MS / MS في دراسة PTMs لإظهار التطورات الأخيرة ل DDA باستخدام التراكم المتوازي في فخ التنقل متبوعا بالتجزئة المتسلسلة والتفكك الناجم عن الاصطدام. الفكرة الرئيسية هي إنشاء منهجية تسمح بحل الإشارات القادمة من الببتيدات المختلفة والتي ، حتى الآن ، لم تتمكن التقنيات الكلاسيكية من حلها. تمنع عملية الاشتقاق باستخدام أنهيدريد البروبيونيك انشقاق محطات اللايسين C بواسطة التربسين ، مما يولد ببتيدات أطول وأكثر إفادة. كان من الممكن تحديد الببتيدات التي لها نفس m / z ووقت الاحتفاظ من خلال أنماط تجزئتها ، ولكن لوحظ أيضا أنه يمكن فصل بعض هذه الأنواع في مجال التنقل باستخدام طريقة LC-TIMS-PASEF-ToF MS / MS.
لفهم ذلك بشكل أفضل ، يمثل الشكل 8 ثلاث خصائص رئيسية لأي جزيء ، مما يسمح بتحديد المركب ، سواء كانت بروتينات أو دهون أو ببتيدات سليمة (في هذه الحالة ، هيستون H3 18-26) ، على سبيل المثال لا الحصر. تتضمن هذه الخصائص وقت الاحتفاظ (دقيقة) لمركب في العمود الكروماتوغرافي ، ونسبة شحنة الكتلة (m / z) لكل مركب ، والحركة (1 / Ko) التي تقدمها هذه المركبات عندما تتفاعل مع غاز الانجراف. في الشكل 8A ، يظهر أن الببتيد H3 غير المعدل 18-26 يحتوي على RT يبلغ 28.15 دقيقة وأنه يقدم نطاقين في طيف حركته ، مما يشير إلى أنه يحتوي على شكلين على الأقل ، وهي نتيجة يشتبه في أنها ناتجة عن اثنين من الليسين (18 و 23) اللذين تم بروبيونيلاتهما وفقا للبروتوكول الموصوف سابقا. تظهر الأطياف التالية (الشكل 8B ، C) نفس الببتيد (H3 18-26) ولكن تختلف موضع مجموعة أستلة (42.02) بين B و K18Ac و C ، K23Ac. تم تحديد هذين الأيزومرين (K18Ac و K23Ac) من خلال مخطط الحركة ، حيث يظهران بتوزيعات مكانية مختلفة ، مما يؤدي إلى تفاعلات مختلفة مع الغاز في خلية TIMS. تكمن أهمية هذه الطريقة في إمكانية تحديد ودراسة PTMs المختلفة التي ارتبطت بأمراض مختلفة بمزيد من التفصيل من خلال ، على سبيل المثال ، تلف الحمض النووي.
عندما تكون بيانات التجزئة متفرقة ، فإن تحديد تعديل في بقايا معينة يمثل تحديا لأن تعديلين مختلفين أو أكثر يمكن أن يحدثا في وقت واحد عند (أو بالقرب من) نفس المخلفات ويمكن فهمه على أنه تعديل واحد25. يمكن حل ذلك عن طريق التأكد من تحديد الببتيد غير المعدل ، خاصة باستخدام معيار لتأكيد أو نفي وجود تعديل واحد بدلا من تعديلات متعددة (الجدول 1).
لتجنب التلوث المفرط أو استخراج الهستونات غير النقية ، من المهم التحقق من جودة الكواشف قبل الاستخدام. على سبيل المثال ، إذا تم تخزين محلول المخزن المؤقت NIB واستخدامه بكميات كبيرة ، فتأكد من أن المحلول واضح مع عدم وجود مظهر خارجي للعكارة أو عرض غير طبيعي. قد يكون التعكر ناتجا عن نمو البكتيريا ، مما قد يلوث العينات ويمكن أن يؤدي إلى خليط من الهستونات والبروتينات البكتيرية. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بإعداد منحنيات معايرة جديدة للمقايسات ، مثل مقايسة BCA أو Bradford المستخدمة لتحديد تركيز البروتين ، مما يضمن عدم انتهاء صلاحية البروتين المستخدم في منحنى المعايرة أو تدهوره.
يمكن توسيع هذه الطريقة لتشمل أنواعا أخرى من الخلايا أو الكائنات الحية ، على سبيل المثال ، البعوض. في حالة الكائنات الحية الكاملة أو الجزئية ، يعد اختيار عدد مناسب من الكائنات الحية مهما بشكل خاص للتأكد من أن تركيز الهستون النهائي مناسب للتحليل.
أيضا ، كمبدأ توجيهي عام لصيانة مطياف الكتلة ، يجب تنظيف الواجهة الأمامية بشكل دوري لمنع التراكم على الجهاز والتلوث بين الأشواط. يجب أن يشمل هذا التنظيف الستارة ولوحة الفتحة والقطب الرباعي ، حسب الحاجة.
بشكل عام ، عند استخدام LC ، من الضروري مراعاة إعداد مرحلة (مراحل) متنقلة جديدة كل أسبوع باستخدام مذيبات من الدرجة MS. من الممارسات الجيدة الاحتفاظ بالماصات والأواني الزجاجية المخصصة لإعداد المرحلة المتنقلة وتطهير خطوط LC كلما تم وضع حلول جديدة على النظام. يجب عادة استبدال أعمدة الحماية والفصل كل 100-200 حقنة و 500-1500 حقنة ،على التوالي 26. تأكد من حقن الفراغات قبل وبعد تشغيل مجموعة من العينات. إذا كان هناك عدد كبير من العينات داخل دفعة معينة ، فقد يفكر المرء أيضا في تشغيل فراغ على فترات زمنية مختلفة داخل الدفعة.
يوفر البروتوكول سير عمل DDA قائم على PASEF للكشف عن PTMs الهستوني والتمايز بين الأنواع متساوية الضغط والأيزوميرية على أساس حركة الأيونات.
يتطلب هذا البروتوكول إعدادا مكثفا للعينة ، ويجب حساب الوقت الإجمالي لإعداد العينات التجريبية. في المتوسط ، يتطلب بروتوكول إعداد العينة 2-3 أيام عمل لإكماله. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر الاختلافات بين المختبرات وإصدارات الأجهزة على الحساسية الكلية للتحليل.
تم اعتبار عدد قليل جدا من برامج تحليل البيانات البروتينية كافية للاستخدام في تحليل الهستونات عبر طرق من أسفل إلى أعلى دون تعديل أو تصحيح يدوي27،28،29. يجب تأكيد النتائج (على الأقل في البداية) باستخدام التحليل اليدوي ، والذي يستغرق وقتا طويلا أيضا. إذا تم استخدام برنامج تحليلي ، فيجب أن يحتوي على إمكانات التعليقات التوضيحية MS / MS ، والتي يسهل تأكيدها أو رفضها بشكل عام.
ومن الجدير بالذكر أيضا أنه من المستحيل فصل الأيزومرات من خلال قياس الطيف الكتلي ما لم يتم إدخال خلية TIMS واستخدام قيم التنقل. على سبيل المثال ، يمكن تحديد مواضع تعديلات الهستون باستخدام أنماط التجزئة (PASEF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ملفين أ. بارك وماثيو ويليتس موظفان في شركة Bruker Daltonics Inc. ، الشركة المصنعة لأداة timsTOF.
Acknowledgments
تستند هذه المواد إلى العمل الذي تدعمه المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم. HRD-1547798 والمنحة رقم. HRD-2111661. تم منح منح NSF هذه إلى جامعة فلوريدا الدولية كجزء من برنامج مراكز التميز البحثي في العلوم والتكنولوجيا (CREST). هذه هي المساهمة رقم 1672 من معهد البيئة ، وهو برنامج بارز في جامعة فلوريدا الدولية. وقدم المعهد الوطني للصحة دعما إضافيا في إطار المنحة رقم. R21AI135469 إلى فرانسيسكو فرنانديز ليما وغرانت لا. R01HD106051 إلى بنيامين أ. غارسيا ، وكذلك من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم. CHE-2127882 إلى بنيامين أ. جارسيا. يود المؤلفون أن يشكروا الدعم الأولي للدكتور ماريو غوميز هيرنانديز خلال تطورات الطريقة الأولية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -80 °C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
| 1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
| 10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
| 10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
| 200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
| Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
| Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
| Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
| Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
| Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
| Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
| Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
| Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
| Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
| Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
| Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
| Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
| Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
| Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
| Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
| Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
| SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
| Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
| TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
References
- Zhao, Z., Shilatifard, A.
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
- Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
- Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
- Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
- Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T.
- Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
- Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
- Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
- Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
- Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
- Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
- Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
- Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
- Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
- Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
- Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
- Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
- Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
- Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
- Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
- Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
- Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
- Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
- Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).
