Summary
En analytisk arbejdsgang baseret på væskekromatografi, fanget ionmobilitetsspektrometri og time-of-flight massespektrometri (LC-TIMS-ToF MS / MS) for høj tillid og meget reproducerbar "bottom-up" analyse af histonmodifikationer og identifikation baseret på hovedparametre (retentionstid [RT], kollisionstværsnit [CCS] og nøjagtigt masse-til-ladning [m / z] forhold).
Abstract
Histonproteiner er meget rigelige og konserverede blandt eukaryoter og spiller en stor rolle i genregulering som følge af strukturer kendt som posttranslationelle modifikationer (PTM'er). Identifikation af positionen og arten af hver PTM eller mønster af PTM'er i forhold til eksterne eller genetiske faktorer gør det muligt at korrelere disse oplysninger statistisk med biologiske reaktioner såsom DNA-transkription, replikation eller reparation. I dette arbejde beskrives en analytisk protokol med høj kapacitet til påvisning af histon-PTM'er fra biologiske prøver. Anvendelsen af komplementær væskekromatografi, fanget ionmobilitetsspektrometri og time-of-flight massespektrometri (LC-TIMS-ToF MS/MS) muliggør separation og PTM-tildeling af de mest biologisk relevante modifikationer i en enkelt analyse. Den beskrevne tilgang udnytter den seneste udvikling inden for afhængig dataindsamling (DDA) ved hjælp af parallel akkumulering i mobilitetsfælden efterfulgt af sekventiel fragmentering og kollisionsinduceret dissociation. Histone PTM'er tildeles trygt baseret på deres retentionstid, mobilitet og fragmenteringsmønster.
Introduction
I eukaryote celler pakkes DNA som kromatin i funktionelle enheder kaldet nukleosomer. Disse enheder består af en oktam af fire kernehistoner (to hver af H2A, H2B, H3 og H4)1,2,3,4. Histoner er blandt de mest rigelige og højt konserverede proteiner i eukaryoter, som i høj grad er ansvarlige for genregulering5. Histone posttranslationelle modifikationer (PTM'er) spiller en stor rolle i reguleringen af kromatindynamik og rigger forskellige biologiske processer såsom DNA-transkription, replikation og reparation6. PTM'er forekommer primært på den tilgængelige overflade af de N-terminale regioner af histoner, der er i kontakt med DNA 3,7. Imidlertid påvirker hale- og kernemodifikationer kromatinstrukturen, ændrer internukleosominteraktioner og rekrutterer specifikke proteiner 3,8.
En aktuel udfordring under proteomics baseret på væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) er den potentielle sameluering af analysander af interesse. I tilfælde af dataafhængige analyser (DDA) betyder dette det potentielle tab af flere prækursorioner under MS/MS-erhvervelsesprocessen9. Time-of-flight-instrumenter (ToF) får spektre ved meget høj frekvens 9,10 (op til snesevis af kHz)11 dette gør dem i stand til hurtigt at scanne de samlede prækursorioner i en kompleks prøve (MS1), hvilket lover optimal følsomhed og MS/MS-sekventeringshastigheder (op til 100 Hz)9 og gør dem ideelle til biologisk prøveanalyse10. Ikke desto mindre er den følsomhed, der er tilgængelig ved disse høje scanningshastigheder, begrænset af MS / MS-hastigheden9. Tilføjelsen af fanget ionmobilitetsspektrometri (TIMS) i kombination med et ortogonalt quadrupole time-of-flight (qToF) massespektrometer blev brugt til at afbøde disse begrænsninger. I TIMS akkumuleres alle forløbere i tandem og elueres som en funktion af deres mobilitet snarere end at vælge enkeltforløbermasser med en quadrupol9. Parallel akkumuleringsseriel fragmentering (PASEF) giver mulighed for hundredvis af MS/MS-hændelser pr. sekund uden tab af følsomhed9.
Hovedformålet med dette arbejde var at vise den seneste udvikling i Dohaudviklingsdagsordenen ved hjælp af parallel akkumulering i mobilitetsfælden efterfulgt af sekventiel fragmentering og kollisionsinduceret dissociation (CID). Histone PTM'er blev med sikkerhed tildelt baseret på deres retentionstider (RT'er), mobilitet og fragmenteringsmønstre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Histonprøver blev ekstraheret ved hjælp af en metode tilpasset fra Bhanu et al. (2020)12.
1. Forberedelse af prøver
- Høstning af dyrkede celler
- Når celler er 80% sammenflydende, skal du sikre dig, at de er levedygtige ved hjælp af trypanblå udelukkelse.
BEMÆRK: En HeLa S3-cellelinje blev brugt til disse eksperimenter, men denne metode kan anvendes på alle dyrkede celler. - Opsug mediet, og påfør derefter 5 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS) på hver plade.
- Drej pladen (pladerne) for at skylle alle resterende medier, aspirer derefter PBS og påfør 5 ml 1x PBS.
- Adskil forsigtigt cellerne fra pladen ved at skrabe dem med en engangscelleløfter.
- Overfør hver cellesuspension til et 15 ml konisk rør.
- Pillecellerne centrifugeres ved 800 x g i 5 min.
- Opsug PBS fra cellepelleten.
- Fortsæt til histonekstraktion.
BEMÆRK: Lynfrys cellepillen i flydende nitrogen, hvis den ikke kan behandles med det samme. Opbevar pillerne ved -80 °C, indtil de er klar til at fortsætte.
- Når celler er 80% sammenflydende, skal du sikre dig, at de er levedygtige ved hjælp af trypanblå udelukkelse.
- Udvinding af sten
- Anslå volumenet af hver cellepille og markér menisken med en permanent markør.
- Der fremstilles tilstrækkelig nuklear isolationsbuffer (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mMMgCl2, 1 mMCaCl2 og 250 mM saccharose) til alle prøverne. Alternativt, hvis mange prøver skal behandles over tid, fremstilles bufferen i løs vægt og opbevares ved 2-8 °C i op til 6 måneder eller alikvote og fryses ved -15 °C til -25 °C på ubestemt tid ved kun at tø den mængde op, der er nødvendig for hver ekstraktion.
BEMÆRK: Bufferen skal forblive fri under opbevaring. Hvis bufferen på noget tidspunkt får et uklart eller på anden måde unormalt udseende, skal bufferen kasseres og tilberedes. - Der fremstilles 50 gange volumen af cellepellets af vaskebuffer og tilsættes inhibitorer som følger (ca. 10 ml vaskebuffer pr. 2 prøver).
- For at fremstille 10 ml vaskebuffer blandes 10 ml NIB, 30 μL 200 mM 4-(2-aminoethyl)benzensulfonylfluoridhydrochlorid [AEBSF], 10 μL 1 M dithiothreitol [DTT], 20 μL 5 μM mikrocystin, 20 μL 5 M natriumbutyrat.
- Fjern 1/5 af vaskebufferen for at forberede lysisbufferen (1/5 volumen fra vaskebuffer, 0,3% NP-40 eller NP-40 alternativ).
BEMÆRK: Brug ikke Triton-X 100 i stedet for NP-40 eller NP-40 alternativ, da det kan være for slibende for visse celletyper. - Cellepillen vaskes grundigt ved at opslæmme den i 5 kolonner vaskebuffer og centrifugere ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Dette trin udføres to gange, idet supernatanten suges og kasseres mellem vaskene.
- Sørg for, at cellepillens volumen stadig er markeret med en permanent markør. Resuspender i 10 volumener lysisbuffer.
- Pipette-mix hver pellet grundigt for at resuspendere, og inkuber derefter i 15 minutter på is.
- Efter 15 minutter centrifugeres ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Opsug supernatanten og kassér den.
BEMÆRK: Pelleten skal reducere den oprindelige pelletstørrelse til ≤ 1/2 (som angivet med markørlinjen). Hvis pelleten ikke er reduceret tilstrækkeligt, gentag lysisproceduren og inkluder et blidt homogeniseringstrin ved hjælp af en støder for at bryde cellerne op. - Når lyserne er afsluttet, resuspenderes pellet i 500 μL vaskebuffer, og centrifugeres derefter ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten suges og kasseres, og vasketrinnet gentages derefter endnu en gang for at fjerne alle spor af NP-40.
BEMÆRK: På dette tidspunkt består pelleten af kromatin, som indeholder histoner. - Resuspender pellet i 5 volumener (af den oprindelige cellepelletstørrelse) på 0,4 NH2SO4.
- Inkuber i 2 timer i et kølerum eller køleskab ved hjælp af en omrører.
- Efter 2 timer centrifugeres prøven/prøverne ved 3400 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten må ikke kasseres.
- Supernatanten overføres til nye glas, og der tilsættes 100 % trichloreddikesyre (TCA) til 1:3 af indholdets volumen (den endelige TCA-koncentration vil være ca. 20 %).
- Vend forsigtigt røret på hovedet, og observer, at den klare, farveløse opløsning bliver hvid og/eller uklar, hvilket indikerer proteinudfældning.
BEMÆRK: For opløsninger med lave histonkoncentrationer er proteinudfældningen muligvis ikke umiddelbart mærkbar, men bundfaldet skal være synligt efter inkubationen natten over. - Der inkuberes uden forstyrrelse natten over (12-18 timer) ved 4 °C for fuldstændigt at udfælde histonproteinerne.
- Den følgende dag centrifugeres ved 3400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Opsug supernatanten, og pas på ikke at berøre rørets sider med pipettespidsen. På dette stadium deponeres histonerne primært som en film omkring siderne af røret (e).
- Der tilsættes 500 μL iskold acetone + 0,1% HCl (syreacetone) til hvert glas med en Pasteur-pipette af glas, og vend forsigtigt glasset/glassene på hovedet flere gange. Arranger prøverne i rækkefølge (1, 2, 3 osv.), Mens du gør dette, da enhver vildfaren acetone kan fjerne markeringerne på rørene. Der centrifugeres ved 3400 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten dekanteres forsigtigt.
- Gentag dette skylletrin med 500 μL iskold 100% acetone, også med en Pasteur-pipette af glas. Der centrifugeres ved 3400 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten dekanteres forsigtigt.
- Lad rørene tørre ved stuetemperatur, indtil den resterende acetone er fordampet.
- Når det er tørt, tilsættes 100 μL massespektrometri (MS)-vand til hvert rør. Brug denne dråbe til at pode alle sider af beholderen for at resuspendere hele histonfilmen. Gør dette ved at pipettere dråben på siden af røret og dreje den, mens du pipetterer op og ned eller dispenserer halvdelen af 100 μL og bruger spidsen til at røre rundt i den. En kombination af begge metoder fungerer bedst. Histoner er let opløselige i vand og vil være i opløsningen.
- Efter resuspendering af alle prøver, hvis der er noget resterende hvidt fast stof, sonikeres i et bad ved stuetemperatur i 5 min.
- Der centrifugeres ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør den klare opløsning til friske rør. Kassér eventuel resterende uopløselig pellet.
- Kør en SDS-PAGE under reducerende forhold for at kontrollere, at ekstraktionen er ren.
BEMÆRK: Geler kan køres med en passende koncentration af polyacrylamid, så længe det kan differentiere proteiner i området 10-20 kDa. Se materialetabellen for de geler, der anvendes i denne protokol. - Udfør et proteinkoncentrationsassay (dvs. Bradford eller BCA) for at bestemme den samlede proteinkoncentration.
- Kemisk derivatisering (propionylering) af lysinresterne
- Der overføres 20 μg histoner (bestemt ved proteinanalysen) til et rent rør. Denne prøve tørres til <5 μL ved hjælp af en vakuumkoncentrator, og derefter resuspenderes med 20 μL 100 mM ammoniumbicarbonat (NH4CO3) (~1 μg/μL opløsning). Juster pH til ~8 ved hjælp af ammoniumhydroxid, hvis det er nødvendigt.
FORSIGTIG: Brug ikke ammoniumhydroxid (NH4OH) til at resuspendere, kun for at justere pH, hvis det er nødvendigt. Ellers vil proteiner denaturere og udfælde.
BEMÆRK: For at kontrollere pH-værdien med minimalt prøvetab skal du bruge en pipettespids til at dyppe prøven i og duppe på en pH-strimmel. Denne testprocedure vil være nyttig i de resterende prøveforberedelsestrin. - Forbered propionyleringsreagenset ved at tilsætte propionsyreanhydrid til acetonitril (ACN) i forholdet 1:3 (v/v) (dvs. for at fremstille 40 μL reagens kombineres 10 μL propionsyreanhydrid med 30 μL ACN).
BEMÆRK: Traditionelt er methanol eller isopropanol blevet anvendt til fremstilling af et propionyleringsreagens. Da propionylering er en amiddannelsesreaktion, kræves et ikke-protonisk opløsningsmiddel, som acetonitril, for at forhindre uønskede sideprodukter og reaktioner, såsom methylpropionylester, som skyldes anvendelse af methanol. Forbered kun nok propionyleringsreagens til op til 4 prøver ad gangen, så reagenset forbliver frisk. Brug reagenset inden for 1-2 minutter efter tilberedning. Når reagenset sidder, vil propionsyreanhydridet reagere med enhver omgivende fugtighed, og eddikesyre begynder at dannes, hvilket kan ændre reagensets effektivitet og ændre histonopløsningens pH, når reagenset er tilsat. - Der tilsættes propionyleringsreagens til hver prøve i en 1:4 (v/v) (dvs. for 20 μL histoner tilsættes 5 μL propionyleringsreagens).
- Der tilsættes hurtigt 1:5 (v/v)NH4OH(dvs. tilsættes 4 μL for 20 μL histonopløsningen) for at genoprette opløsningens pH til ~8. Hvis pH-værdien stadig er for lav, tilsættes 1-2 μLNH4OHad gangen, indtil der opnås en pH-værdi på 8. Typisk er et forhold på 1: 5 (v / v) tilstrækkeligt.
- Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 15 minutter uden forstyrrelser.
- Propionyleringsreaktionen gentages i højst 3-4 prøver pr. batch propionyleringsreagens for at sikre minimal syredannelse.
- Propionyleringsproceduren, trin 1.3.2-1.3.5, gentages. En anden runde af propionylering sikrer, at >95% af de tilgængelige lysiner er derivatiseret.
- Prøverne tørres ned til <5 μL ved hjælp af en vakuumkoncentrator. Dette vil fordampe ethvert ureageret propionyleringsreagens, syreprodukter og ammoniakgas frigivet fraNH4OH. Hvis prøverne tørrer helt ud, er det fint, da der ikke forekommer væsentlige prøvetab.
BEMÆRK: Fortræng luft i propionsyreanhydridflasken med argongas før opbevaring for at forhindre dannelse af eddikesyre på grund af kontakt med omgivende fugt, der er tilbage i flasken.
- Der overføres 20 μg histoner (bestemt ved proteinanalysen) til et rent rør. Denne prøve tørres til <5 μL ved hjælp af en vakuumkoncentrator, og derefter resuspenderes med 20 μL 100 mM ammoniumbicarbonat (NH4CO3) (~1 μg/μL opløsning). Juster pH til ~8 ved hjælp af ammoniumhydroxid, hvis det er nødvendigt.
- Proteolytisk fordøjelse med trypsin
- Histoner resuspenderes i 100 mMNH4HCO3 for at opnå et volumen på 20 μL, hvorved der opnås en optimal koncentration på 1 μg/μL.
BEMÆRK: Prøveopløsninger med koncentrationer lavere end 1 μg / μL vil resultere i nedsat trypsineffektivitet. - Tilsæt trypsin til histonprøver i forholdet 1:10 (wt/wt) (dvs. tilsæt 2 μL 1 μg/μL opløsning af trypsin til 20 μg histoner).
- Inkubationsreaktioner ved 37 °C i 6-8 timer. Alternativt inkuberes natten over (12-18 timer) ved stuetemperatur.
- Fordøjelsen standses ved nedfrysning ved -80 °C i mindst 1 time.
BEMÆRK: Brug ikke syre til at slukke fordøjelsesreaktionen, da dette vil medføre et uønsket fald i pH på dette tidspunkt i proceduren. Prøven kan opbevares ved -80 °C, indtil den er klar til at fortsætte (midlertidigt stoppunkt).
- Histoner resuspenderes i 100 mMNH4HCO3 for at opnå et volumen på 20 μL, hvorved der opnås en optimal koncentration på 1 μg/μL.
- Kemisk derivatisering (propionylering) af peptid N-terminaler
- Prøverne tørres til <5 μL ved hjælp af en vakuumkoncentrator.
- Prøverne resuspenderes op til 20 μL (1 μg/μL) med 100 mMNH4HCO3.
- Propionylering gentages som før (trin 1.3).
BEMÆRK: Det er normalt, at prøverne tager længere tid at tørre på dette trin på grund af et højere vandigt: organisk faseforhold.
- Prøve afsaltning med scenespidser
- Resuspender eller fortynd prøver med 50 μL vand af MS-kvalitet + 0,1% TFA.
- Brug en 11-G prøvekorer til at stanse 5 diske C18-materiale fra en fastfaseekstraktionsskive (stans alle 5 diske, før de overføres til pipettespidsen). Indsæt og sørg for, at skiverne er sikkert og jævnt klemt fast i bunden af en 200 μL pipettespids (figur 1).
BEMÆRK: Brug 15-G corer, hvis der afsaltes over 25 μg prøve gennem en enkelt trinspids. - Brug en centrifugeadapter til at holde trinspidserne på plads i 1,5 ml eller 2 ml mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Til følgende centrifugeringstrin skal du bruge langsom (400-500 x g) omdrejning ved 4 °C i 1-2 minutter ad gangen; opløsningsmidlerne passerer normalt gennem harpiksen på mindre end 1 min, afhængigt af hvor tæt C18-materialet er pakket ind i spidserne. - Skyl harpiksen ved centrifugering med 50 μL 100% acetonitril for at aktivere C18-materialet og fjerne potentielle forurenende stoffer.
BEMÆRK: Det kan være lettere at lægge opløsninger på scenespidserne ved hjælp af pipettespidser med gelilægning. Når C18-materialet er aktiveret, er det vigtigt ikke at lade harpiksen tørre ud under afsaltningsproceduren. - Diskmaterialet afbalanceres med 80 μL vand af MS-kvalitet + 0,1 % TFA ved centrifugering.
- Syr prøven til pH 4 eller lavere ved hjælp af iseddike. Kontroller pH med pH-strimler som før for at minimere prøvetab.
- Hele prøven lægges på harpiksskiven ved langsom centrifugering.
- Prøven vaskes med 80 μL vand af MS-kvalitet + 0,1 % TFA ved centrifugering.
- Eluer prøven i et rent 1,5 ml rør ved at skylle 70 μL 75% acetonitril og 0,5% eddikesyre ved langsom centrifugering. Der kan anvendes yderligere centrifugeringstid for at sikre, at hele prøvevolumenet elueres fra trinspidsen. Det er okay, hvis harpiksen tørrer ud med den ekstra centrifugeringstid, da den ikke længere er nødvendig efter elueringen af prøven.
- Hver prøve tørres helt i en vakuumkoncentrator.
BEMÆRK: Prøven (prøverne) kan opbevares ved -80 °C, indtil den er klar til at fortsætte (midlertidigt stoppunkt). - Til LC-MS/MS-analyse rekonstitueres prøverne i et volumen opløsningsmiddel A (0,1% myresyre) fra væskekromatografiprotokollen (LC), der giver den endelige koncentration på 0,4 μg/μL (dvs. 20 μg histoner opløses i 50 μL opløsningsmiddel A).
2. TIMS software grænseflade
- Vælg fanen Instrument , og skift til Betjen (kontroller, at instrumentnavnet bliver fremhævet med grønt) (Figur 2).
- Kontroller TIMS-parametre (figur 2).
- Bekræft MS-indstillinger (scanningsstart, scanningsafslutning, ionpolaritet, scanningstilstand) (figur 2).
- Kontroller TIMS-indstillinger (tilstand, mobilitetsstart, mobilitetsslut, rampetid, akkumuleringstid, driftscyklus, rampehastighed, MS-hastighed, MS-gennemsnit og autokalibrering) (figur 2).
- Gå til fanen Kilde , og aktiver kun sprøjteindstillingen (Hamilton 500 μL) for kalibreringstrinnet TuneMix (figur 3)13.
- Gå til fanen Kalibrering , klik på m/z, vælg Kalibreringstilstand, og vælg tilstanden (generelt Forbedret Q), zoom (+0,01%) STD Dev (0,24), og klik på Kalibrer; Når der opnås en score på 100%, accepter (figur 4).
- Gå til fanen Mobilitet, og gentag kalibreringsprocessen (Lineær tilstand, generelt), detektionsområde (+5%), bredde (0,1 Da), STD Dev (0,1855), og klik derefter på kalibrere; når du får en score ≥ 98,5%, accepter (figur 5).
- Gå til metoden, og vælg den metode, der skal bruges; i dette eksempel blev Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl valgt (figur 5).
3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS
- Brug de typiske nESI-driftsbetingelser: 4500 V kapillærspænding, 800 V slutpladeforskydning, 3,0 bar forstøvertryk, 10,0 l / min tør gas, 200 ° C tørvarmer og 50 μL / min injektionsstrømningshastighed.
- Brug de typiske MS-indstillinger: 6 eV kollisionsenergi, 1200 Vpp kollision RF, 75 μs overførselstid, 5 μs prepulse storage.
- Bestem drivgasstrømmen ved hjælp af trykforskellen fra indgangstragten P1 og udgangstragten P2. Parallel akkumulering-seriel fragmentering (PASEF) forekommer i TIMS-cellen og akkumulerer alle forløbere samtidigt snarere end individuelt. Precursorioner frigives derefter i smalle iontoppe versus de normalt meget bredere toppe (ca. 50 gange kortere), hvilket øger signal-støj-forholdet, mens de stadig adskiller co-eluerende peptider via mobilitet14.
- Udvikle en LC-TIMS-ToF MS / MS metode til analyse af proteolytiske histonpeptider. Kombiner en højtydende væskekromatograf (HPLC) udstyret med en C18 (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) søjle med et kommercielt TIMS-TOF MS-instrument med proprietær PASEF-teknologi.
BEMÆRK: Denne kolonnestørrelse blev bestemt til at give god adskillelse ved både høj og lav pH for peptidblandinger, baseret på tidligere offentliggjorte værker 15,16,17.- Indstil injektionsvolumen til 20 μL (8 μg) prøve og en 0,4 ml / min strømningshastighed.
- Kør en 60-min, ikke-lineær LC-gradient med vand med 0,1% myresyre (opløsningsmiddel A) og acetonitril med 0,1% myresyre (opløsningsmiddel B). Indstil gradienten: 10% B i 2,7 min, derefter til 20% B på 5,3 min, 28% B på 4 min, 35% B på yderligere 18 min, til 40% B på 13 min og 100% B på yderligere 2 min. Efter at have holdt 100% B i 5 min, sænk koncentrationen til 10% B på 5 min og hold i de sidste 5 min.
- Kontroller prøveeluering fra HPLC til TIMS-TOF via nanoelektrosprayionisering (nESI) i positiv ioniseringstilstand.
4. Analyse af data
- Identificer peptidsekvenserne og modifikationsstederne.
- Forbered en teoretisk liste over peptider ved hjælp af ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] under MS-digest-værktøjet.
- Udfør en teoretisk fordøjelse under hensyntagen til fordøjelsesbetingelserne (anvendt enzym), typer PTM'er, der søges efter (f.eks. mono-, di- eller trimethylering), størrelsesområdet for peptider, der søges efter, samt massedetekteringsområde og det potentielle antal ubesvarede spaltninger.
- Forbered en teoretisk liste over peptider ved hjælp af ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] under MS-digest-værktøjet.
- Analysér manuelt de erhvervede data baseret på teoretiske peptider (figur 6)12.
- Søg efter masserne ved flere ladningstilstande (+1 til +4) for hvert teoretisk peptid, der søges efter.
- Efter den indledende identifikation af hver m/z vælges toppen, og MS / MS bekræftes ved hjælp af en teoretisk liste over fragmenteringsioner baseret på peptidsekvensen, herunder PTM'er.
BEMÆRK: Hvis mobiliteten af det identificerede peptid var kendt tidligere, bekræftes dette også.
- Beregn de relative mængder af forskellige PTM'er, og rapporter hver ændring som en procentdel af den specificerede peptidsekvens.
- Den relative forekomst af hver detekteret PTM beregnes ved hjælp af følgende ligning:
Relativ forekomst = Areal af PTM/Samlet areal af umodificeret og PTM for et givet peptid
- Den relative forekomst af hver detekteret PTM beregnes ved hjælp af følgende ligning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En bottom-up proteomisk arbejdsgang (figur 7) involverer typisk følgende: ekstraktion af målproteinet (-erne) fra en rå prøve efterfulgt af kvantificering af koncentrationen af proteinet (proteinerne) og derefter fraktionering, normalt ved gelelektroforese eller væskekromatografi. Efter fraktionering fordøjes proteinerne under anvendelse af et proteolytisk enzym (ofte trypsin) og endelig massespektrometrisk analyse af de resulterende peptider og proteinidentifikation under anvendelse af en etableret database18. Sekvensinformation udledes af prækursorioner inden for det angivne masse-til-ladningsområde (m/z), som udsættes for kollisionsinduceret dissociation (CID), hvilket frembringer fragmenteringsmønstre, der skal identificeres og sekventeres ved hjælp af en database19 (figur 8).
For dette arbejde var hovedmålet at udvikle og anvende en LC-TIMS-PASEF-ToF MS / MS DDA-metode ved at følge de trin, der er beskrevet tidligere i protokolafsnittet. Bestemmelse af positionaliteten af posttranslationelle modifikationer på isomere og isobariske peptider har været en særlig udfordring med hensyn til identifikation og spektrumfortolkning. I denne undersøgelse blev rekombinante humane histonstandarder og HeLa S3-celler anvendt som prøver.
Histon PTM-analyse af humane histonstandarder via ESI-TIMS-PASEF-ToF MS / MS gav peptider i mellemstor til stor størrelse (3-30 aminosyrer i længden) detekteret med så mange som 5 ladninger pr. peptid. Propionyleringsproceduren havde succes med at producere længere, mere informative peptider end dem, der almindeligvis produceres ved tryptisk fordøjelse. Efter dataanalyse blev peptider identificeret i forskelligt modificerede tilstande. Som en fordel differentierede den TIMS-baserede metode nogle positionelle isomere peptider, der bærer de samme PTM'er. For eksempel kan to isomere arter overlappe hinanden i retentionstid og m / z; De to signaler kunne dog adskilles i mobilitetsdomænet (figur 9).
De tilsvarende fragmenteringsspektre for peptiderne vist i figur 9 blev kommenteret af proteomisk analysesoftware under anvendelse af de relevante FASTA-filer. I figur 9A ses det umodificerede peptid med tre propionylgrupper (+56,03) (på N-terminalen, lysin 18 og lysin 23). I figur 9B observeres peptidet med en acetylgruppe (+42,02) på lysin 18 og to propionylgrupper (en ved N-terminalen og en på lysin 23). Endelig ses peptidet i figur 9C med en acetylering observeret på lysin 23 og to propionylgrupper (på N-terminalen og lysin 18). Som tidligere offentliggjort kan PASEF-fordelen bruges til at øge sekventeringshastigheden og følsomheden ved at målrette mod den samme funktion gentagne gange9. Dette giver brugeren mulighed for at få mere strukturel information fra biologiske prøver. I dette tilfælde anvendes dette på typen og placeringen af PTM'er, der forekommer på hver histon.
Posttranslationel modifikationsanalyse kan også repræsenteres visuelt som et sekvensdækningsplot, som det ses i figur 10. I figur 10A præsenterer histon H3-standarden, som er blevet propionyleret før fordøjelsen, længere peptider, end det ellers ville have resulteret i, betegnet med de blå linjer. Histoner ekstraheret fra HeLa S3-celler blev behandlet på samme måde, som repræsenteret af figur 10B. Flere PTM'er blev indikeret, herunder mange forskellige mønstre ved de samme aminosyrepositioner. Dette kan forventes fra biologiske prøver. Det skal bemærkes, at de få grå linjer i figur 10B angiver peptider, der blev identificeret tvetydigt på grund af manglen på en MS2 som følge af den lave intensitet.
Figur 1: Skematisk gengivelse og fremstilling af scenespidser. (A-G) Trin-for-trin vejledning i fremstilling af en C18-silica disk stage tip. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Databehandling: 20210804 propionylerede standardhistoner Mix_QC peptid. Før du begynder at behandle dataene, skal du sørge for at udarbejde den teoretiske liste over mulige ladningstilstande og deres fragmenteringer (1550.9013; 775.9543; 517.6386; osv.) for at udtrække disse værdier fra basistopkromatogrammet (BPC + All MS). Efter ekstraktion af hvert peptid skal du sørge for, at det ligner analyselisten vist i figuren. Toppen 775.9543 blev valgt som et eksempel. På højre side af figuren vises tre grafer: den første svarer til kromatogrammet (intensitet vs. tidsgraf), den anden til mobilogrammet og den tredje til massespektret med PASEF-fragmentering inkluderet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: timsControl protokol trin 1-4. Figuren viser de første fire trin i timsControl-proceduren. Klik på knappen Instrument øverst til venstre for at tænde og slukke for forbindelsen mellem instrumentet og softwaren. Før man udfører en opgave, skal man sikre sig, at softwaren er i driftstilstand. Endelig skal du kontrollere, at TIMS-parametrene er korrekte. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kildeparametre. I dette tilfælde blev sprøjte Hamilton 500 μL kun brugt til TuneMix. Kontroller, at de andre parametre forbliver korrekte. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Masse-til-ladning (m/z) kalibrering. Vælg Kalibrer , indtil der er opnået en score på 100 % i panelet Kalibreringstilstand nederst til venstre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kalibrering af mobilitet. Vælg Kalibrer , indtil der er opnået en score på mindst 98,5 % i panelet Kalibreringstilstand nederst til venstre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Typisk bottom-up proteomics workflow. Trin for trin i bottom-up-procedurerne fra forberedelse af prøver til identifikation9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Retentionstid, isotopmønster og H3 18-26 mobilitetsprofiler. (A) Umodificeret propionyleret, (B) K23Ac-peptidpropionyleret i de to andre positioner og (C) K18Ac propionyleret i de to andre positioner. Bemærk fordelene ved mobilitetsadskillelsen for de strukturelle isomerer, der er vist i panelerne B og C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Eksempel på MS/MS-fragmenteringspeptidsekventering ved hjælp af PASEF. Fragmentspektre blev opnået fra proteomisk analysesoftware til H3-peptidet med aminosyrepositioner 18-26. (A) umodificeret propionyleret, (B) K23Ac-peptidpropionyleret i de to andre positioner og (C) K18Ac-propionyleret i de to andre positioner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Eksempel på en visuel histon PTM-analyseoversigt. Resultater af observerede peptider og PTM'er fra (A) en H3-standard og (B) H3 fra HeLa S3-celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Standard- og HeLa S3-peptid LC-TIMS-ToF MS/MS-egenskaber. Målliste og observeret peptidliste, herunder eksperimentelle egenskaber (dvs. retentionstid, m/z, 1/Ko og LC-topområder). Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histoner er basiske proteiner, der regulerer kromatinstrukturen ved at interagere med DNA i form af oktamerer bestående af de fire kernehistoner (to hver af H2A, H2B, H3 og H4)20. Histoner indeholder talrige lysin- og argininrester, som let modificeres, hvilket fører til omfattende PTM'er, der ændrer kromatinkemien ved at påvirke histonfunktionen eller ved binding til andre cellulære proteiner21. PTM'er kan fremkalde biologiske reaktioner ved at arbejde sammen, idet specifikke grupper af PTM'er er blevet rapporteret i flere sygdomme, især flere typer kræft22.
Når DNA-skader genkendes på celleniveau, efterfølges det øjeblikkeligt af virkningen af en kompleks signalkaskade, hvor læsioner markeres, efterfulgt af koordinering af cellecyklusprogression og aktivering af de krævede reparationsveje. Derudover inducerer DNA-skader forskellige modifikationer, såsom acetyl- og methyladdukter, som letter proteinrekruttering23. Det store udvalg af PTM'er, der er involveret i DNA-læsioner, fører til spørgsmålet om, hvordan disse molekylære mekanismer regulerer deres sameksistens, og hvad den funktionelle betydning af at forsvare genomets integritet gennem et ekstremt komplekst integreret netværk er. For eksempel har lysin 9 trimethylering af histon H3 (H3K9me3) været forbundet med forskellige patologier i forskellige sygdomme24. Af grunde som dette er det nødvendigt at udvikle instrumentelle analytiske metoder, der muliggør fuldstændig karakterisering af disse modifikationer på cellulært niveau23.
Analyse af HeLa S3-histonekstraktionerne ved hjælp af manuel dataanalysesoftware og proteomisk analysesoftware afslørede PTM'er, herunder acetylering (+42,01 Da), methylpropionylering (+70,04 Da), dimethylering (+28,03 Da) og trimethylering (+42,05) for flere histonproteiner. Derudover var den PASEF-baserede MS/MS-metode i stand til at differentiere nogle positionelle isomere peptider, der bærer de samme PTM'er.
I indledningen beskrives fordelene ved at koble LC-TIMS-ToF MS/MS i undersøgelsen af PTM'er for at vise den seneste udvikling af DDA ved hjælp af parallel akkumulering i mobilitetsfælden efterfulgt af sekventiel fragmentering og kollisionsinduceret dissociation. Hovedideen er at etablere en metode, der muliggør opløsning af signaler, der kommer fra forskellige peptider, og som klassiske teknikker indtil nu ikke har været i stand til at løse. Derivatiseringsprocessen ved anvendelse af propionsyreanhydrid forhindrer spaltning af lysin C-terminaler af Trypsin, genererer længere, mere informative peptider. Peptider med samme m/z og retentionstid kunne identificeres ved deres fragmenteringsmønstre, men det blev også set, at nogle af disse arter kunne adskilles i mobilitetsdomænet ved hjælp af denne LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS-metode.
For bedre at forstå dette repræsenterer figur 8 tre hovedkarakteristika ved ethvert molekyle, hvilket muliggør identifikation af en forbindelse, uanset om de er intakte proteiner, lipider eller peptider (i dette tilfælde histon H3 18-26), for at nævne nogle få eksempler. Disse egenskaber omfatter retentionstiden (min) for en forbindelse i den kromatografiske kolonne, masseladningsforholdet (m / z) for hver forbindelse og mobiliteten (1 / Ko), som disse forbindelser frembyder, når de interagerer med drivgassen. I figur 8A vises det umodificerede H3-peptid 18-26 at have en RT på 28,15 min, og at det præsenterer to bånd i sit mobilitetsspektrum, hvilket indikerer, at det har mindst to konformationer, et resultat, der mistænkes for at være et resultat af de to lysiner (18 og 23), der er blevet propionyleret efter den tidligere beskrevne protokol. Følgende spektre (figur 8B,C) viser det samme peptid (H3 18-26), men varierer acetyleringsgruppens position (42.02) mellem B, K18Ac og C, K23Ac. Disse to isomerer (K18Ac og K23Ac) er blevet identificeret gennem mobilogrammet, da de præsenterer forskellige rumlige fordelinger, hvilket resulterer i forskellige interaktioner med gassen i TIMS-cellen. Betydningen af denne metode ligger i muligheden for at identificere og studere mere detaljeret de forskellige PTM'er, der har været forbundet med forskellige sygdomme gennem for eksempel DNA-skader.
Når fragmenteringsdata er sparsomme, er det vanskeligt at identificere en ændring ved en specifik restkoncentration, fordi to eller flere forskellige ændringer kan forekomme samtidigt ved (eller i nærheden af) de samme restkoncentrationer og kan forstås som en enkelt ændring25. Dette kan løses ved at sikre, at det umodificerede peptid er blevet identificeret, især ved at bruge en standard til at bekræfte eller benægte tilstedeværelsen af en enkelt modifikation snarere end flere modifikationer (tabel 1).
For at undgå overdreven kontaminering eller ekstraktioner af urene histoner er det vigtigt at kontrollere kvaliteten af reagenserne før brug. Hvis NIB-bufferopløsningen f.eks. opbevares og anvendes i løs vægt, skal du sikre dig, at opløsningen er klar uden ydre forekomst af turbiditet eller unormal præsentation. Uklarhed kan være resultatet af bakterievækst, som ville forurene prøver og kunne resultere i en blanding af histoner og bakterielle proteiner. Derudover anbefales det at udarbejde nye kalibreringskurver til assays, såsom BCA- eller Bradford-assayet, der anvendes til bestemmelse af proteinkoncentrationen, hvilket sikrer, at proteinet, der anvendes til kalibreringskurven, ikke er udløbet eller nedbrudt.
Denne metode kan udvides til andre typer celler eller organismer, for eksempel myg. For hele organismer eller delorganismer er det særlig vigtigt at vælge et passende antal organismer for at sikre, at den endelige histonkoncentration er egnet til analyse.
Som en generel retningslinje for vedligeholdelse af massespektrometer skal frontenden rengøres regelmæssigt for at forhindre opbygning på instrumentet og forurening mellem kørsler. Denne rengøring skal omfatte gardin, åbningsplade og quadrupol efter behov.
Når der anvendes LC, er det generelt nødvendigt at overveje at forberede friske mobile faser hver uge ved hjælp af opløsningsmidler af MS-kvalitet. Det er god praksis at opbevare dedikerede pipetter og glasvarer til mobil faseforberedelse og at rense LC-linjerne, når nye løsninger placeres på systemet. Beskyttelses- og separationskolonner skal normalt udskiftes hver henholdsvis 100-200 injektioner og 500-1500 injektioner26. Sørg for at injicere emner før og efter kørsel af et parti prøver. Hvis der er et stort antal prøver inden for en given batch, kan man også overveje at køre en blindprøve med forskellige intervaller inden for batchen.
Protokollen giver en PASEF-baseret DDA-arbejdsgang til påvisning af histon-PTM'er og differentiering af isobariske og isomere arter baseret på ionmobilitet.
Denne protokol kræver omfattende prøveforberedelse, og der skal tages højde for den samlede eksperimentelle prøveforberedelsestid. I gennemsnit kræver prøveforberedelsesprotokollen 2-3 hverdage at gennemføre. Derudover kan forskelle mellem laboratorier og instrumentversioner påvirke analysens samlede følsomhed.
Meget få proteomiske dataanalysesoftware er blevet anset for tilstrækkelig til brug ved analyse af histoner via bottom-up-metoder uden manuel justering eller korrektion 27,28,29. Resultaterne skal (i det mindste i starten) bekræftes ved hjælp af manuel analyse, hvilket også er tidskrævende. Hvis der anvendes analytisk software, skal den have MS/MS-annoteringsfunktioner, som generelt er lette at bekræfte eller afvise.
Det er også værd at nævne, at det er umuligt at adskille isomerer gennem massespektrometri, medmindre en TIMS-celle indsættes og mobilitetsværdier anvendes; for eksempel kan positionerne af histonmodifikationer bestemmes ved hjælp af fragmenteringsmønstre (PASEF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Melvin A. Park og Matthew Willetts er ansatte hos Bruker Daltonics Inc., producenten af timsTOF-instrumentet.
Acknowledgments
Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation under bevilling nr. HRD-1547798 og bevillingsnr. HRD-2111661. Disse NSF-tilskud blev tildelt Florida International University som en del af Centers of Research Excellence in Science and Technology (CREST) -programmet. Dette er bidrag nummer 1672 fra Institute of Environment, et fremtrædende program ved Florida International University. Yderligere støtte blev ydet af National Institute of Health under tilskud nr. R21AI135469 til Francisco Fernandez-Lima og Grant No. R01HD106051 til Benjamin A. Garcia, samt af National Science Foundation under bevilling nr. CHE-2127882 til Benjamin A. Garcia. Forfatterne vil gerne anerkende den indledende støtte fra Dr. Mario Gomez Hernandez under den indledende metodeudvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -80 °C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
| 1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
| 10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
| 10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
| 200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
| Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
| Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
| Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
| Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
| Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
| Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
| Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
| Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
| Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
| Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
| Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
| Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
| Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
| Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
| Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
| Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
| SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
| Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
| TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
References
- Zhao, Z., Shilatifard, A.
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
- Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
- Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
- Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
- Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T.
- Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
- Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
- Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
- Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
- Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
- Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
- Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
- Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
- Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
- Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
- Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
- Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
- Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
- Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
- Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
- Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
- Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
- Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
- Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).
