Summary
Voici un nouveau dispositif automatisé de contusion des lésions de la moelle épinière pour les souris, qui peut produire avec précision des modèles de contusion des lésions de la moelle épinière à des degrés divers.
Abstract
Les lésions de la moelle épinière dues à des blessures traumatiques telles que les accidents de voiture et les chutes sont associées à un dysfonctionnement permanent de la moelle épinière. La création de modèles de contusion de lésions de la moelle épinière par impact sur la moelle épinière entraîne des pathologies similaires à la plupart des lésions de la moelle épinière en pratique clinique. Des modèles animaux précis, reproductibles et pratiques de lésions de la moelle épinière sont essentiels pour étudier les lésions de la moelle épinière. Nous présentons un nouveau dispositif automatisé de contusion des lésions de la moelle épinière pour les souris, le système intelligent de lésions de la moelle épinière de l’Université Guangzhou Jinan, qui peut produire des modèles de contusion des lésions de la moelle épinière avec précision, reproductibilité et commodité. Le système produit avec précision des modèles de différents degrés de lésions de la moelle épinière via des capteurs de distance laser combinés à une plate-forme mobile automatisée et à un logiciel avancé. Nous avons utilisé ce système pour créer trois niveaux de modèles de souris atteintes de la moelle épinière, déterminé leurs scores à l’échelle de souris de Basso (BMS) et effectué des tests comportementaux et de coloration pour démontrer sa précision et sa reproductibilité. Nous montrons chaque étape du développement des modèles de blessures à l’aide de ce dispositif, formant une procédure standardisée. Cette méthode produit des modèles reproductibles de souris contusions de lésions de la moelle épinière et réduit les facteurs de manipulation humaine grâce à des procédures de manipulation pratiques. Le modèle animal développé est fiable pour étudier les mécanismes des lésions de la moelle épinière et les approches thérapeutiques associées.
Introduction
La lésion de la moelle épinière entraîne généralement un dysfonctionnement permanent de la moelle épinière sous le segment blessé. Elle est principalement causée par des objets frappant la colonne vertébrale et une hyperextension de la colonne vertébrale, tels que des accidents de la route et des chutes1. En raison de la disponibilité limitée d’options de traitement efficaces pour les lésions de la moelle épinière, l’élucidation de la pathogenèse des lésions de la moelle épinière à l’aide de modèles animaux sera instructive pour le développement d’approches de traitement appropriées. Le modèle de contusion de lésion de la moelle épinière causée par un impact sur la moelle épinière aboutit au développement de modèles animaux présentant des pathologies similaires à la plupart des cas cliniques de lésion de la moelle épinière 2,3. Par conséquent, il est important de produire des modèles animaux précis, reproductibles et pratiques pour la contusion de la lésion de la moelle épinière.
Depuis l’invention par Allen du premier modèle animal de lésion de la moelle épinière en 1911, il y a eu des progrès majeurs dans le développement d’instruments permettant d’établir des modèles animaux de lésion de la moelle épinière 4,5. Sur la base des mécanismes de blessure, les modèles de lésions de la moelle épinière sont classés comme contusion, compression, distraction, luxation, transsection ou chimique6. Parmi eux, les modèles de contusion, qui utilisent des forces externes pour déplacer et blesser la moelle épinière, sont les plus proches de l’étiologie clinique de la plupart des patients atteints de lésions de la moelle épinière. Par conséquent, le modèle de contusion a été utilisé par de nombreux chercheurs dans des études sur les lésions de la moelle épinière 3,7. Différents instruments sont utilisés pour développer des modèles de contusion des lésions de la moelle épinière. L’impacteur multicentrique de l’Université de New York (NYU) produit des contusions par un dispositif de perte de poids8. Après plusieurs versions mises à jour, l’impacteur MASCIS est largement utilisé pour développer des modèles animaux de contusion de la moelle épinière9. Cependant, lorsque la tige d’impact de MASCIS tombe et heurte la moelle épinière, de multiples blessures peuvent survenir, ce qui affecte le degré de blessure dans les modèles de lésions de la moelle épinière. De plus, il est également difficile d’atteindre la précision mécanique pour assurer la précision de l’instrument et la répétabilité du modèle de fabrication. Les impacteurs à horizon infini provoquent des contusions en contrôlant la force appliquée à la moelle épinière plutôt que des chutes lourdes10. Il utilise un ordinateur connecté à un capteur pour mesurer directement la force d’impact entre l’impacteur et la moelle épinière. Lorsque le seuil est atteint, l’élément de frappe est immédiatement rétracté, évitant ainsi le rebond du poids et améliorant la précision10,11. Cependant, l’utilisation de cette modalité de motricité fine pour infliger des dommages peut entraîner des dommages incohérents et des déficits fonctionnels6. Le dispositif de l’Université d’État de l’Ohio (OSU) comprime la surface dorsale de la moelle épinière à un rythme transitoire par un pilote électromagnétique12,13. Ce dispositif est similaire aux impacteurs à horizon infini, car il utilise des compressions à courte distance pour provoquer des lésions de la moelle épinière. Cependant, il présente diverses limites dans la mesure où la détermination initiale du point zéro entraînera des erreurs dues à la présence du liquide céphalo-rachidien 6,14. En résumé, il existe de nombreux instruments qui peuvent être utilisés pour développer des modèles animaux de contusion de lésion de la moelle épinière, mais ils ont tous certaines limites qui conduisent à une précision et une reproductibilité insuffisantes des modèles animaux. Par conséquent, afin de créer de manière plus précise, pratique et reproductible des modèles de contusion chez la souris de lésion de la moelle épinière, un impacteur automatisé et intelligent pour les lésions de la moelle épinière est nécessaire.
Nous présentons un nouvel impacteur de lésions de la moelle épinière, le système intelligent de lésions de la moelle épinière de l’Université Guangzhou Jinan (système G smart SCI ; Figure 1), pour produire des modèles de contusion des lésions de la moelle épinière. L’appareil utilise un télémètre laser comme dispositif de positionnement, combiné à une plate-forme mobile automatisée pour automatiser les frappes en fonction des paramètres de frappe définis, y compris la vitesse de frappe, la profondeur de frappe et le temps de séjour. Le fonctionnement automatisé réduit les facteurs humains et améliore la précision ainsi que la reproductibilité des modèles animaux.
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Protocol
Les études impliquant des animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique de l’Université de Jinan.
1. Anesthésie des animaux et laminectomie spinale T10
- Utilisez des souris C57/6J femelles jeunes adultes âgées de 8 semaines pour cette étude. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg) et de diazépam (5 mg/kg). Vérifiez si l’anesthésie est réussie et indiquée par une perte du réflexe de douleur. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Rasez les poils sur le dos des souris à l’aide d’un rasoir pour révéler la peau. Désinfectez la peau avec trois cycles alternés d’iodophore et d’alcool.
- Faites une incision longitudinale médiale de 2,5 cm dans la peau dorsale à l’aide d’un scalpel et exposez la colonne vertébrale au niveau T9-T11 à l’aide d’une pince à épiler.
- Fixez bilatéralement les facettes T10 à l’aide d’un fixateur vertébral. Assurez-vous que la colonne vertébrale est fixée de manière stable. Assurez-vous que les muscles paravertébraux sont dénudés et retirez l’apophyse épineuse ainsi que les lames à l’aide d’une perceuse à micro-meulage pour exposer la moelle épinière du segment T10.
2. Contusion de la moelle épinière T10 à l’aide du système G smart SCI
- Allumez le commutateur et attendez que l’appareil revienne automatiquement à son état d’origine. Placez le fixateur vertébral dans le système G smart SCI et fixez-le à l’aide de vis.
- À l’aide de l’écran tactile de fonctionnement (Figure 2A), définissez les paramètres de dommage, y compris la vitesse d’impact (1 m/s), la profondeur d’impact (0,5 mm, 0,8 mm et 1,1 mm pour trois ensembles de souris différents) et le temps d’arrêt (500 ms)15.
- Alignez le télémètre laser au centre de la moelle épinière exposée en déplaçant la plate-forme. (Figure 2B)
- Cliquez sur le bouton Prêt sur l’écran tactile (Figure 2C). La tête d’impact s’ajustera automatiquement à une hauteur spécifique en fonction des paramètres de réglage. La table de support déplace automatiquement le site d’impact de la moelle épinière sous la tête d’impact.
- Appuyez manuellement sur la tête d’impact pour déterminer davantage le site d’impact. Cliquez sur le bouton Démarrer , la tête d’impact frappera la moelle épinière en fonction des paramètres définis.
- Retirez les souris de l’appareil et observez-les sous un stéréomicroscope (20x) pour déterminer les lésions de la moelle épinière (Figure 3). Pour déterminer le succès du développement du modèle, observez la congestion locale, l’effondrement et la rupture de la membrane vertébrale.
- Suturez le muscle, le fascia et la peau couche par couche à l’aide de sutures 3-0. Placez les souris dans une boîte chaude et attendez leur récupération.
3. Soins postopératoires
- Injecter quotidiennement du méloxicam (5 mg/kg) par voie sous-cutanée pendant 7 jours après la chirurgie. Videz manuellement la vessie toutes les 8 h jusqu’à ce que les fonctions de la vessie soient rétablies.
- 14 jours après l’opération, retirez les fils de suture.
4. Tester les effets d’une lésion de la colonne vertébrale
- Calculez les scores BMS pour les souris à partir du premier jour postopératoire 16,17.
- Le 30e jour postopératoire, effectuez des expériences comportementales sur les animaux, y compris les passerelles, les fautes de pied et le rotarod16,17. Passerelle : Distance record de 45 cm ; Durée maximale de fonctionnement 8 s ; Gain de la caméra 28,02 ; Seuil d’intensité 0,01. Faute de pied : Enregistrez 60 pas pour chaque souris. Rotation : Vitesse 20 tr/min. Enregistrez le temps de chute de la souris et enregistrez-le à 120 s pendant plus de 120 s.
- Le 31e jour postopératoire, anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg) et de diazépam (5 mg/kg), puis euthanasier les souris par perfusion avec 4 % de PFA. Retirez soigneusement la moelle épinière et interceptez 5 mm au-dessus et au-dessous du site de la blessure pour l’enrobage de paraffine. Faites une coupe de 5 μm du centre de la lésion de la moelle épinière de la souris et effectuez une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine17.
- Pour l’analyse statistique, utilisez un logiciel commercial. Exprimer les données sous forme de moyenne ± d’erreur-type de la moyenne (MEB) et comparer à l’aide d’une ANOVA à un facteur ; P < 0,05 a été considéré comme significatif.
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Representative Results
La laminectomie a été réalisée sur 24 souris femelles (âgées de 8 semaines) comme décrit ci-dessus. Les souris du groupe placebo (n = 6) n’ont pas été soumises à des lésions de la moelle épinière, tandis que le reste des souris, y compris le groupe de 0,5 mm (n = 6), le groupe de 0,8 mm (n = 6) et le groupe de 1,1 mm (n = 6) ont été soumis à différentes profondeurs de conflit de la moelle épinière. Les scores BMS ont été régulièrement enregistrés jusqu’à 1 mois postopératoire (Figure 4). Il y avait des différences significatives dans les scores de BMS postopératoires des souris dans différents groupes. Après 1 mois, les souris du groupe 0,5 mm avaient 4 à 6 scores postopératoires et se sont rétablies à un niveau similaire à celui du groupe fictif. Les souris des groupes de 0,8 mm et 1,1 mm ont eu 1 à 2 scores postopératoires. Après 1 mois, le groupe de 0,8 mm a récupéré à 4 à 6 scores, tandis que les souris du groupe de 1,1 mm ont à peine récupéré.
Après 1 mois, des tests de comportement animal, y compris des fautes de pied, des rotarods et des passerelles, ont été effectués. Dans l’essai de faute plantaire (figure 5A), il n’y avait pas de différence significative dans la faute du pied postérieur entre les groupes de 0,5 mm et de tromperie. Cependant, la faute du pied postérieur pour le groupe de 0,8 mm était significativement différente de celle de tous les autres groupes. Le taux de fautes de pied des souris du groupe de 1,1 mm était de 100 % parce que les membres postérieurs ne pouvaient pas soutenir l’animal au sol et était significativement différent des autres groupes. Dans le test de rotarod (Figure 5B), nous avons enregistré le temps de latence pour tomber dans différents groupes de souris. Les groupes de 0,8 mm et de 1,1 mm étaient significativement différents des autres groupes, mais le groupe placebo avait des résultats similaires à ceux du groupe de 0,5 mm. Dans le test de la passerelle (Figure 6), nous avons enregistré et analysé l’indice de régularité et la surface de contact maximale postérieure dans différents groupes de souris. Il y avait des différences significatives dans l’indice de régularité et les zones de contact maximum postérieur entre les souris de différents groupes, ce qui implique des différences significatives dans les fonctions de marche entre les souris avec différentes profondeurs de lésion de la moelle épinière. Par conséquent, des modèles de souris avec différentes profondeurs de lésion de la moelle épinière et avec des différences significatives dans leurs fonctions des membres postérieurs peuvent être créés à l’aide du dispositif développé.
Enfin, nous avons réséqué la moelle épinière de souris (Figure 7A) et réalisé des coupes pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) (Figure 7C). Il y avait différents degrés de dommages dans les images de la moelle épinière et les coupes colorées à l’HE. En résumé, nous avons développé avec précision différents types de modèles de souris atteintes de lésions de la moelle épinière à l’aide de l’instrument proposé.
Figure 1 : Système intelligent de lésions de la moelle épinière de l’université de Guangzhou Jinan (système G smart SCI). Fixez l’antidémarrage rachidien pour immobiliser la souris sur la table porteuse. Définissez les paramètres d’impact via l’écran tactile. Utilisez le micropilote latéral pour régler les positions latérales du porte-bagages et utilisez l’écran tactile pour régler les positions frontales. Le télémètre laser confirme la position de l’impact et mesure la hauteur de l’impact afin que la tête d’impact puisse frapper avec précision en fonction de la position et de la profondeur de frappe définies. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’écran tactile de fonctionnement. (A) Dans la page des paramètres, les paramètres de dommage, y compris la vitesse d’impact (0,5 -2,0 m/s), la profondeur d’impact (0 -3 mm) et le temps d’arrêt (500 -2 ms) peuvent être réglés. (B) Dans la page mobile, la hauteur de la tête d’impact et la position du fixateur de colonne vertébrale peuvent être réglées. (C) Dans la page de préparation, cliquer sur le bouton Prêt entraînera un ajustement automatique de la tête d’impact et de la table de support à une position spécifique en fonction des paramètres définis. En cliquant sur le bouton Démarrer, la tête d’impact frappera la moelle épinière en fonction des paramètres définis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Moelle épinière après une blessure. (A) Groupe fictif. L’immobilisateur rachidien a immobilisé les vertèbres T10 et la moelle épinière est exposée après laminectomie sans dommage. (B) Groupe de 0,5 mm. La moelle épinière a été légèrement blessée après avoir été frappée à une profondeur de 0,5 mm et il y a eu une petite congestion. (C) Groupe de 0,8 mm. La moelle épinière était modérément blessée et présentait une congestion évidente après avoir été frappée à une profondeur de 0,8 mm. (D) Groupe de 1,1 mm. La moelle épinière a été gravement blessée après avoir été frappée à une profondeur de 1,1 mm et il y avait beaucoup de congestion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les scores BMS. Les scores BMS des souris ont été enregistrés du premier jour postopératoire à un mois postopératoire (n = 6 /groupe). *p< 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 par rapport à l’ANOVA à un facteur. La date est exprimée en moyenne ± erreur type de la moyenne (MEB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Test de piétinement et test de rotarod. (A) Défauts du pied postérieur chez des souris présentant différents degrés de lésions de la moelle épinière (n = 6 /groupe). p <0,001 comparé à l’aide d’une ANOVA à un facteur. (B) La latence de chute pendant l’accélération de la rotation a été comparée chez des souris présentant différents degrés de lésions de la moelle épinière (n = 6 /groupe). * p < 0,05, *** p < 0,001 par rapport à l’ANOVA à un facteur. La date est exprimée en moyenne ± erreur type de la moyenne (MEB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Test de défilé. (A, C) Indices de régularité chez les souris présentant différents degrés de lésions de la moelle épinière (n = 6 /groupe). * p < 0,05, *** p < 0,001 par rapport à l’ANOVA à un facteur. (B, D) Les zones de contact maximales ont été analysées automatiquement à l’aide du logiciel (n = 6 /groupe). ** p < 0,01, *** p < 0,001 comparés en utilisant l’ANOVA à un facteur. La date est exprimée en moyenne ± erreur type de la moyenne (MEB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Coloration de la moelle épinière et de l’H&E. (A) Moelle épinière de souris présentant différents degrés de lésion 1 mois après la chirurgie. (B) Chiffres agrandis. (C) Coloration H&E des sites de lésions de la moelle épinière chez des souris présentant différents degrés de lésion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les lésions de la moelle épinière peuvent entraîner des déficits sensoriels et moteurs, ce qui peut entraîner de graves déficiences physiques et mentales. En Chine, l’incidence des lésions de la moelle épinière dans les différentes provinces varie de 14,6 à 60,6 par million18. L’augmentation de la prévalence des lésions médullaires exercera une pression accrue sur le système de santé. Actuellement, il existe peu d’options de traitement efficaces pour les lésions de la moelle épinière, car ses mécanismes pathologiques et ses processus de réparation ne sont pas encore entièrement compris19. Il est nécessaire de créer des modèles animaux précis et reproductibles de lésions de la moelle épinière pour étudier les mécanismes pathologiques et les processus de réparation des lésions de la moelle épinière. À cette fin, nous avons développé un instrument de lésion de la moelle épinière précis, reproductible et simple.
De nombreux dispositifs, y compris l’impacteur NYU-MASCIS, l’impacteur à horizon infini et l’impacteur OSU, sont utilisés pour créer des modèles de contusion des lésions de la moelle épinière 8,9,12,13,20. Ces appareils sont complexes à utiliser et peuvent produire des erreurs importantes en raison des différentes compétences du personnel. De plus, il existe divers défauts dans la conception de ces appareils qui les rendent moins précis et reproductibles6. L’emplacement spécifique de la lésion de la moelle épinière détermine sa gravité, donc lors de l’établissement des modèles de lésion de la moelle épinière, la méthode de positionnement détermine la précision de la modélisation21. Le système G smart SCI utilise un télémètre laser pour localiser le site de la lésion de la moelle épinière et ajuste la hauteur de la tête d’impact en fonction des données du télémètre pour régler la profondeur de frappe. Un autre dispositif de percussion qui utilise le positionnement laser est l’impacteur LISA (Louisville Injury System Apparatus) de la faculté de médecine de l’Université de l’Indiana15. Bien que LISA utilise le positionnement laser, il nécessite une détermination et un réglage manuels de la hauteur de la tête d’impact pour obtenir une profondeur de frappe contrôlée, ce qui augmente l’intervention humaine. Pendant ce temps, LISA utilise des gâches pneumatiques et un contrôle par ordinateur portable, ce qui nécessite plus d’espace expérimental et augmente les coûts d’exploitation10. G smart SCI réduit les erreurs humaines en automatisant semi-le processus d’exploitation et est facile à déplacer grâce à sa conception légère.
Sur la base de paramètres définis, l’appareil peut avoir un impact précis sur la moelle épinière des souris, créant ainsi des modèles avec différents degrés de lésions de la moelle épinière. Dans cette étude, des souris présentant différents degrés de lésions de la moelle épinière présentaient des différences significatives dans les fonctions des membres postérieurs. Il est important de noter que les tests sont reproductibles et peuvent générer des modèles de SCI de manière cohérente.
Dans le protocole, les étapes les plus critiques comprennent la réalisation précise de la laminectomie, la stabilisation des épines des souris et l’utilisation du laser pour un positionnement précis afin d’assurer la précision et la répétabilité de l’expérience. Au cours du processus de conception, nous avons apporté quelques améliorations à l’appareil. Nous avons constaté qu’après la frappe, la scène ne pouvait pas facilement revenir au point de télémétrie, nous avons donc ajouté un bouton pour revenir au point de télémétrie. De plus, les paramètres souhaités ne pouvaient pas être ajustés rapidement, nous avons donc ajouté un clavier numérique pour la saisie. L’entraînement électromagnétique à charge lente de la première version a également été amélioré. Ce dispositif est actuellement limité à l’établissement de modèles de souris contusions pour lésions de la moelle épinière thoracique. Des études devraient être effectuées pour appuyer l’utilisation de cet instrument dans l’établissement de modèles de lésions de la moelle épinière chez le rat ou de modèles de lésions de la moelle épinière cervicale.
En outre, le Dr Bilgen de la faculté de médecine de l’Université du Kansas a décrit un dispositif d’impact contrôlé par ordinateur, qui peut induire des lésions du système nerveux central (SNC), y compris des lésions cérébrales traumatiques (TCC) et des lésions de la moelle épinière (LME)22. Semblable à notre appareil, cet appareil utilise également une variété d’équipements et de systèmes commercialisés, il a donc été commercialisé et utilisé avec succès23. L’équipement que nous décrivons présente les caractéristiques d’automatisation, de précision et de commodité, et devrait être commercialisé à l’avenir et profiter à davantage de chercheurs sur les lésions de la moelle épinière.
En résumé, nous avons conçu un impacteur automatisé de la moelle épinière de souris pour créer des modèles de contusion de la LME. L’appareil améliore la précision avec un télémètre laser et réduit les erreurs humaines grâce à un processus d’exploitation automatisé. De plus, le système G smart SCI est plus facile à utiliser et à transporter que les autres appareils, ce qui facilite la recherche sur les lésions de la moelle épinière. Il est important de noter que l’appareil peut créer avec précision et reproductibilité différentes classes de modèles de souris SCI en fonction des besoins de l’expérience.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, nos 82102314 (à ZSJ) et 32170977 (à HSL) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong, nos 2022A1515010438 (à ZSJ) et 2022A1515012306 (à HSL). Cette étude a été soutenue par le programme de technologie de pointe clinique du premier hôpital affilié de l’Université de Jinan, en Chine, n° JNU1AF- CFTP- 2022- a01206 (à HSL). Cette étude a été soutenue par le projet de plan scientifique et technologique de Guangzhou, n° 202201020018 (à HSL), 2023A04J1284 (à ZSJ) et 2023A03J1024 (à HSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01M PBS (powder, pH7.2-7.4) | Solarbio Life Sciences | P1010 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Macklin | 75-80-9 | |
| 4% paraformaldehyde tissue fixative | Biosharp life science | BL539A | |
| Biomicroscope | Leica | LCC50 HD | |
| CatWalk | Noldus Information Technology | CatWalk XT 9.1 | |
| Cover glass | CITOTEST Scientific | 10212432C | |
| Embedding machine | Changzhou Zhongwei Electronic Instrument | BMJ-A | |
| Ethanol absolute | DAMAO | 64-17-5 | |
| FootFaultScan | Clever Sys Inc. | - | |
| Glass slide | CITOTEST Scientific | 80302-2104 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| micro-grinding drill | FEIYUBIO | 19-7010 | |
| Mouse spinal fixator | RWD Life Science | 68094 | |
| Paraffin microtome | Thermo | shandon finesse 325 | |
| RotaRod for Mice | Ugo Basile | 47600 | |
| Stereomicroscope | KUY NICE | SZM-7045 | |
| Tert-Amyl alcohol | Macklin | 75-85-4 | |
| Xylene | China National Pharmaceutical | #10023418 |
References
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