敲低 FAM83A 以验证其在宫颈癌细胞生长和顺铂敏感性中的作用

Summary

在这里，我们展示了 FAM83A 敲除的程序;检测其对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭影响的测定;以及这些细胞对顺铂的致敏性。该研究为宫颈癌提供了一个有前途的靶基因，并为进一步的药物研究提供了参考。

Abstract

肿瘤靶基因的探索对于宫颈癌的防治具有重要意义。在这项研究中，我们概述了在宫颈癌中鉴定肿瘤靶基因FAM83A所涉及的步骤。首先，利用癌症基因组图谱数据集验证FAM83A在女性中的表达和预后意义。使用小干扰 RNA （siRNA） 敲低 HeLa 和 C33a 细胞中的 FAM83A 基因。接下来，进行5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）染色以确定对肿瘤细胞增殖能力的影响。进行伤口愈合和多孔膜插入试验以评估肿瘤细胞迁移和侵袭能力。

Western blotting用于量化细胞凋亡相关蛋白水平。采用JC-1染色评估线粒体功能改变。此外，顺铂（二胺二氯铂，DDP）干预用于评估靶基因的治疗潜力。进行流式细胞术和集落形成试验以进一步验证该基因的抗癌特性。结果显示， FAM83A 敲低可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并使这些细胞对顺铂敏感。这些综合方法共同验证 了FAM83A 作为肿瘤相关靶基因，有望成为预防和治疗宫颈癌的潜在治疗靶点。

Introduction

宫颈癌是全球主要的妇科恶性肿瘤类型之一，也是女性癌症相关死亡的主要原因，因此是一个全球关注的问题¹。根治性手术和放化疗与初级阶段的高治愈率有关。然而，对于发生转移性疾病的宫颈癌晚期患者，治疗结果非常不利²。因此，进一步了解宫颈癌细胞迁移和侵袭的生物学机制，确定预防和治疗该疾病的潜在治疗靶点至关重要。

识别参与癌症进展的靶基因并找到抑制其表达或作用的方法提供了有希望的治疗选择。在这项研究中，我们将FAM83鉴定为致癌基因，并进一步研究了其对C33a和HeLa细胞的抑制作用。FAM83 家族癌基因 （FAM83A-H） 在人类癌症中被广泛报道 ^3,4。最近有报道称，FAM83A在肺⁵癌、乳腺癌⁶癌、卵巢^癌7癌和胰腺^癌8中上调，表明FAM83A通过促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、干细胞样性状和耐药性在癌症进展中发挥重要作用。重要的是，FAM83A 被鉴定为与宫颈病变进展和癌变相关的新型候选基因^{之一 9}。尽管证实了FAM83A在人宫颈癌细胞中的表达升高，但FAM83A在宫颈癌中的具体影响和潜在机制仍不清楚。

在这项研究中，我们概述了鉴定FAM83A作为宫颈癌肿瘤靶基因所涉及的方案，并使用小干扰RNA（siRNA）敲低HeLa和C33a细胞中的FAM83A基因。进行5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）染色以确定对肿瘤细胞增殖的影响，而伤口愈合和多孔膜插入试验有助于评估肿瘤细胞迁移和侵袭能力。

进行蛋白质印迹以确定细胞凋亡相关蛋白的水平，并采用 JC-1 染色评估线粒体功能改变。因此，我们报道 了FAM83A 在宫颈癌的细胞增殖、转移和侵袭中起着关键作用。通过PI3K/AKT通路相关的线粒体功能障碍和细胞凋亡， FAM83A 敲低宫颈癌细胞对顺铂（二胺二氯铂，DDP）敏感。这项研究为宫颈癌和可能的其他癌症提供了一个新的靶点，并为开发克服癌细胞对某些化疗药物耐药性的策略提供了参考。

Protocol

该研究完全符合TCGA（https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines）提供的出版指南。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅材料表 。 1. 数据来源和生物信息学分析 从癌症基因组图谱 （TCGA） 数据库 （https://cancergenome.nih.gov） 获取 RNA 测序数据以进行聚类分析。使用基于网络的 GEPIA （http://gepia.cancer-pku.cn/） 工具重新计算来自 …

Representative Results

TCGA数据库分析和PCR验证 根据TCGA数据库分析，我们对306个宫颈癌细胞样本和13个正常细胞样本中的mRNA表达水平进行了比较分析，以研究FAM83A的差异表达。FAM83A在宫颈癌中上调，而其在正常宫颈组织中的表达可以忽略不计（图1A）。为了进一步了解 FAM83A 表达的预后意义，我…

Discussion

肿瘤靶基因的研究对于宫颈癌的防治都具有重要意义。了解在宫颈癌发展和进展中起重要作用的特定基因为了解该疾病的潜在分子机制提供了宝贵的见解。此外，识别这些靶基因可以导致新的治疗策略和靶向疗法的开发。在这项研究中，我们描述了使用TCGA数据集分析来鉴定 FAM83A 作为靶基因并研究其在宫颈癌中的机制作用。我们观察到宫颈癌细胞中 FAM83A 的表达显着高，这与宫颈癌?…

Materials

Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0