Knockdown van FAM83A om de rol ervan in de groei van baarmoederhalskankercellen en de gevoeligheid voor cisplatine te verifiëren
Summary
Hier laten we de procedures zien voor het neerhalen van FAM83A ; de tests om de effecten ervan op proliferatie, migratie en invasie van baarmoederhalskankercellen te detecteren; en de sensibilisatie van deze cellen voor cisplatine. Deze studie biedt een veelbelovend doelgen voor baarmoederhalskanker en een referentie voor verder geneesmiddelenonderzoek.
Abstract
De exploratie van tumordoelgenen is van het grootste belang voor de preventie en behandeling van baarmoederhalskanker. In deze studie schetsen we de stappen die betrokken zijn bij de identificatie van een tumordoelgen FAM83A bij baarmoederhalskanker. Ten eerste werd de Cancer Genome Atlas-dataset gebruikt om de expressie en prognostische significantie van FAM83A bij vrouwen te valideren. Een klein interfererend RNA (siRNA) werd gebruikt voor het uitschakelen van het FAM83A-gen di HeLa- en C33a-cellen . Vervolgens werd 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) kleuring uitgevoerd om de effecten op de proliferatiemogelijkheden van de tumorcellen te bepalen. Wondgenezing en poreuze membraaninsert-assays werden uitgevoerd om tumorcelmigratie en invasievermogen te evalueren.
Western blotting werd gebruikt om apoptose-gerelateerde eiwitniveaus te kwantificeren. JC-1-kleuring werd gebruikt om veranderingen in de mitochondriale functie te evalueren. Bovendien werd cisplatine (diaminedichloorplatina, DDP) interventie gebruikt om het therapeutisch potentieel van het doelgen te beoordelen. Flowcytometrie en kolonievormingstesten werden uitgevoerd om de antikankerkenmerken van het gen verder te valideren. Als gevolg hiervan bleek FAM83A-knockdown de proliferatie, migratie en invasie van baarmoederhalskankercellen te remmen en deze cellen gevoelig te maken voor cisplatine. Deze uitgebreide methodologieën valideren gezamenlijk FAM83A als een tumor-geassocieerd doelgen, veelbelovend als een potentieel therapeutisch doelwit bij de preventie en behandeling van baarmoederhalskanker.
Introduction
Baarmoederhalskanker is een wereldwijd probleem, aangezien het wereldwijd een van de belangrijkste vormen van gynaecologische maligniteit is en de belangrijkste oorzaak is van kankergerelateerde sterfte bij vrouwen. Radicale chirurgie en chemoradiotherapie worden in verband gebracht met hoge genezingspercentages in de primaire fase. De behandelingsresultaten voor patiënten in een vergevorderd stadium van baarmoederhalskanker die gemetastaseerde ziekte ontwikkelen, zijn echter zeer ongunstig2. Daarom is het van cruciaal belang om de biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de migratie en invasie van baarmoederhalskankercellen beter te begrijpen en potentiële therapeutische doelen voor de preventie en behandeling van deze ziekte te identificeren.
Het identificeren van doelgenen die betrokken zijn bij de progressie van kanker en het vinden van manieren om hun expressie of werking te remmen, bieden veelbelovende behandelingsopties. In deze studie identificeerden we FAM83 als een kankerverwekkend gen en onderzochten we verder de remmende effecten ervan op C33a– en HeLa-cellen. Oncogenen van de FAM83-familie (FAM83A-H) worden op grote schaal gerapporteerd bij menselijke kankers 3,4. Onlangs werd gemeld dat FAM83A wordt opgereguleerd bij longkanker5, borst6, eierstokkanker7 en pancreas8, wat aangeeft dat FAM83A een belangrijke rol speelt bij de progressie van kanker door het bevorderen van de proliferatie, invasie, stamcelachtige eigenschappen en resistentie tegen geneesmiddelen in de tumorcellen. Belangrijk is dat FAM83A werd geïdentificeerd als een van de nieuwe kandidaat-genen die geassocieerd zijn met progressie van cervicale laesies en carcinogenese9. Ondanks de bevestiging van verhoogde FAM83A-expressie in menselijke baarmoederhalskankercellen, blijven de specifieke impact en onderliggende mechanismen van FAM83A bij baarmoederhalskanker onduidelijk.
In deze studie schetsen we de protocollen die betrokken zijn bij de identificatie van FAM83A als een tumordoelgen bij baarmoederhalskanker en gebruiken we een klein interfererend RNA (siRNA) voor de knockdown van het FAM83A-gen di HeLa- en C33a-cellen . 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)-kleuring werd uitgevoerd om de effecten op de proliferatie van tumorcellen te bepalen, terwijl wondgenezing en poreuze membraaninsert-assays hielpen bij het evalueren van tumorcelmigratie en invasiecapaciteiten.
Western blotting werd uitgevoerd om de niveaus van apoptose-gerelateerde eiwitten te bepalen, en JC-1-kleuring werd gebruikt om mitochondriale functieveranderingen te evalueren. Zo meldden we dat FAM83A een cruciale rol speelt bij celproliferatie, metastase en invasie bij baarmoederhalskanker. Door middel van PI3K/AKT-pathway-geassocieerde mitochondriale disfunctie en apoptose, sloeg FAM83A baarmoederhalskankercellen uit voor cisplatine (diaminedichloorplatina, DDP). Deze studie biedt een nieuw doelwit voor baarmoederhalskanker en mogelijk andere vormen van kanker en een referentie voor de ontwikkeling van strategieën om de resistentie van kankercellen tegen bepaalde chemotherapeutische geneesmiddelen te overwinnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het onderzoek naar tumordoelgenen is van het grootste belang voor zowel de preventie als de behandeling van baarmoederhalskanker. Inzicht in de specifieke genen die een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling en progressie van baarmoederhalskanker biedt waardevol inzicht in de onderliggende moleculaire mechanismen van de ziekte. Bovendien kan het identificeren van deze doelgenen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën en gerichte therapieën. In deze studie beschrijven we het gebruik van TCGA…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation (nr. 2020HC06).
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
Riferimenti
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
