Optogenetikexperiment med hög genomströmning i jäst med hjälp av den automatiserade plattformen Lustro
Summary
Detta protokoll beskriver stegen för att använda den automatiserade plattformen Lustro för att utföra karakterisering av optogenetiska system i jäst med hög genomströmning.
Abstract
Optogenetik erbjuder exakt kontroll över cellulärt beteende genom att använda genetiskt kodade ljuskänsliga proteiner. Att optimera dessa system för att uppnå önskad funktionalitet kräver dock ofta flera design-build-test-cykler, vilket kan vara tidskrävande och arbetskrävande. För att möta denna utmaning har vi utvecklat Lustro, en plattform som kombinerar ljusstimulering med laboratorieautomation, vilket möjliggör effektiv screening och karakterisering av optogenetiska system med hög genomströmning.
Lustro använder en automatiserad arbetsstation utrustad med en belysningsanordning, en skakanordning och en plattläsare. Genom att använda en robotarm automatiserar Lustro förflyttningen av en mikrobrunnsplatta mellan dessa enheter, vilket möjliggör stimulering av optogenetiska stammar och mätning av deras svar. Detta protokoll ger en steg-för-steg-guide om hur man använder Lustro för att karakterisera optogenetiska system för kontroll av genuttryck i den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. Protokollet täcker installationen av Lustros komponenter, inklusive integrationen av belysningsenheten med automationsarbetsstationen. Den ger också detaljerade instruktioner för programmering av belysningsanordningen, plattläsaren och roboten, vilket säkerställer smidig drift och datainsamling under hela experimentprocessen.
Introduction
Optogenetik är en kraftfull teknik som använder ljuskänsliga proteiner för att kontrollera cellernas beteende med hög precision 1,2,3. Att ta fram prototyper av optogenetiska konstruktioner och identifiera optimala belysningsförhållanden kan dock vara tidskrävande, vilket gör det svårt att optimera optogenetiska system 4,5. Metoder med hög genomströmning för att snabbt screena och karakterisera aktiviteten hos optogenetiska system kan påskynda design-build-test-cykeln för prototyper av konstruktioner och utforska deras funktion.
Lustro-plattformen utvecklades som en laboratorieautomatiseringsteknik utformad för screening och karakterisering av optogenetiska system med hög genomströmning. Den integrerar en mikroplattläsare, belysningsanordning och skakanordning med en automatiseringsarbetsstation6. Lustro kombinerar automatiserad odling och ljusstimulering av celler i mikrobrunnsplattor (Figur 1 och Kompletterande Figur 1), vilket möjliggör snabb screening och jämförelse av olika optogenetiska system. Lustro-plattformen är mycket anpassningsbar och kan generaliseras för att fungera med andra laboratorieautomationsrobotar, belysningsenheter, plattläsare, celltyper och optogenetiska system, inklusive de som reagerar på olika våglängder av ljus.
Detta protokoll visar installationen och användningen av Lustro för att karakterisera ett optogenetiskt system. Optogenetisk kontroll av delade transkriptionsfaktorer i jäst används som ett exempelsystem för att illustrera plattformens funktion och användbarhet genom att undersöka förhållandet mellan ljusinsläpp och uttrycket av en fluorescerande reportergen, mScarlet-I7. Genom att följa detta protokoll kan forskare effektivisera optimeringen av optogenetiska system och påskynda upptäckten av nya strategier för dynamisk kontroll av biologiska system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lustro-protokollet som presenteras här automatiserar odlings-, belysnings- och mätprocesserna, vilket möjliggör screening med hög genomströmning och karakterisering av optogenetiska system6. Detta uppnås genom att integrera en belysningsanordning, en mikroplattläsare och en skakanordning i en automatiserad arbetsstation. Detta protokoll visar specifikt Lusiros användbarhet för screening av olika optogenetiska konstruktioner integrerade i jästen S. cerevisiae och jämförelse av…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-anslaget R35GM128873 och National Science Foundation-anslaget 2045493 (tilldelat M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. har ett karriärpris vid Scientific Interface från Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. stöddes av ett NHGRI-utbildningsbidrag till Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760. Vi är tacksamma för givande diskussioner med McCleans labbmedlemmar, och i synnerhet är vi tacksamma mot Kieran Sweeney för att ha gett kommentarer på manuskriptet.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
Riferimenti
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. . A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- . Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- . YPD media. 2010 (9), (2010).
- . . Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -. B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioingegneria. 7 (4), 151 (2020).
