В этом протоколе описаны шаги по использованию автоматизированной платформы Lustro для выполнения высокопроизводительной характеристики оптогенетических систем в дрожжах.
Оптогенетика обеспечивает точный контроль над поведением клеток, используя генетически закодированные светочувствительные белки. Однако оптимизация этих систем для достижения желаемой функциональности часто требует нескольких циклов проектирования-сборки-тестирования, что может быть трудоемким и трудоемким. Чтобы решить эту проблему, мы разработали Lustro, платформу, которая сочетает в себе световую стимуляцию с лабораторной автоматизацией, обеспечивая эффективный высокопроизводительный скрининг и определение характеристик оптогенетических систем.
Lustro использует автоматизированное рабочее место, оснащенное устройством освещения, встряхивающим устройством и считывателем номерных знаков. Используя роботизированную руку, Lustro автоматизирует перемещение микролунки между этими устройствами, позволяя стимулировать оптогенетические штаммы и измерять их реакцию. Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по использованию Lustro для характеристики оптогенетических систем для контроля экспрессии генов у почковавшихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Протокол охватывает настройку компонентов Lustro, включая интеграцию осветительного устройства с автоматизированным рабочим местом. Он также содержит подробные инструкции по программированию осветительного устройства, считывателя пластин и робота, обеспечивая бесперебойную работу и сбор данных на протяжении всего экспериментального процесса.
Оптогенетика является мощным методом, который использует светочувствительные белки для управления поведением клеток с высокой точностью 1,2,3. Однако прототипирование оптогенетических конструкций и определение оптимальных условий освещения может занимать много времени, что затрудняет оптимизацию оптогенетических систем 4,5. Высокопроизводительные методы быстрого скрининга и определения характеристик активности оптогенетических систем могут ускорить цикл «проектирование-строительство-тестирование» для прототипирования конструкций и изучения их функций.
Платформа Lustro была разработана как метод автоматизации лаборатории, предназначенный для высокопроизводительного скрининга и характеризации оптогенетических систем. Он объединяет считыватель микропланшетов, устройство освещения и устройство встряхивания с автоматизированной рабочей станцией6. Lustro сочетает в себе автоматизированное культивирование и световую стимуляцию клеток в микролуночных планшетах (рис. 1 и дополнительный рис. 1), что позволяет проводить быстрый скрининг и сравнение различных оптогенетических систем. Платформа Lustro обладает широкими возможностями адаптации и может быть универсализирована для работы с другими роботами автоматизации лабораторий, устройствами освещения, считывателями пластин, типами клеток и оптогенетическими системами, в том числе реагирующими на различные длины волн света.
Этот протокол демонстрирует настройку и использование Lustro для характеристики оптогенетической системы. Оптогенетический контроль расщепленных транскрипционных факторов у дрожжей используется в качестве примера системы, чтобы проиллюстрировать функцию и полезность платформы путем исследования взаимосвязи между световыми входами и экспрессией флуоресцентного репортерного гена mScarlet-I7. Следуя этому протоколу, исследователи могут оптимизировать оптогенетические системы и ускорить открытие новых стратегий динамического управления биологическими системами.
Протокол Lustro, представленный здесь, автоматизирует процессы культивирования, освещения и измерения, обеспечивая высокопроизводительный скрининг и определение характеристик оптогенетических систем6. Это достигается за счет интеграции осветительного устройства, считыва…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения R35GM128873 и грантом Национального научного фонда 2045493 (присужден M.N.M.). Меган Николь Макклин, доктор философии, имеет награду за карьеру в Scientific Interface от Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. был поддержан грантом NHGRI на обучение в рамках учебной программы геномных наук 5T32HG002760. Мы признательны за плодотворные дискуссии с сотрудниками лаборатории McClean, и, в частности, благодарны Кирану Суини (Kieran Sweeney) за комментарии к рукописи.
96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
Spark (plate reader) | Tecan | ||
Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |