ניסויים באופטוגנטיקה בתפוקה גבוהה בשמרים באמצעות הפלטפורמה האוטומטית Lustro
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השלבים לשימוש בפלטפורמה האוטומטית Lustro לביצוע אפיון תפוקה גבוהה של מערכות אופטוגנטיות בשמרים.
Abstract
אופטוגנטיקה מציעה שליטה מדויקת על התנהגות התא על ידי שימוש בחלבונים רגישים לאור המקודדים גנטית. עם זאת, אופטימיזציה של מערכות אלה כדי להשיג את הפונקציונליות הרצויה דורשת לעתים קרובות מחזורי תכנון-בנייה-בדיקה מרובים, שיכולים לגזול זמן רב ולעבוד הרבה. כדי להתמודד עם אתגר זה, פיתחנו את Lustro, פלטפורמה המשלבת גירוי אור עם אוטומציה במעבדה, ומאפשרת סינון יעיל בתפוקה גבוהה ואפיון של מערכות אופטוגנטיות.
Lustro משתמשת בתחנת עבודה אוטומטית המצוידת במכשיר תאורה, מכשיר טלטול וקורא לוחות. על ידי שימוש בזרוע רובוטית, Lustro הופכת את התנועה של צלחת מיקרו-באר בין התקנים אלה לאוטומטית, ומאפשרת גירוי של זנים אופטוגנטיים ומדידת התגובה שלהם. פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לשימוש ב- Lustro לאפיון מערכות אופטוגנטיות לבקרת ביטוי גנים בשמרים הניצנים Saccharomyces cerevisiae. הפרוטוקול מכסה את ההתקנה של רכיבי Lustro, כולל שילוב של התקן התאורה עם תחנת העבודה אוטומציה. הוא גם מספק הוראות מפורטות לתכנות מכשיר התאורה, קורא הלוחות והרובוט, ומבטיח פעולה חלקה ורכישת נתונים לאורך כל תהליך הניסוי.
Introduction
אופטוגנטיקה היא טכניקה רבת עוצמה המשתמשת בחלבונים רגישים לאור כדי לשלוט בהתנהגות התאים בדיוקגבוה 1,2,3. עם זאת, אב טיפוס של מבנים אופטוגנטיים וזיהוי תנאי תאורה אופטימליים יכולים לגזול זמן, מה שמקשה על אופטימיזציה של מערכות אופטוגנטיות 4,5. שיטות בעלות תפוקה גבוהה לסינון ואפיון מהיר של פעילות מערכות אופטוגנטיות יכולות להאיץ את מחזור התכנון-בנייה-בדיקה של מבני אב טיפוס וחקירת תפקודם.
פלטפורמת Lustro פותחה כטכניקת אוטומציה מעבדתית המיועדת לסינון ואפיון מערכות אופטוגנטיות בתפוקה גבוהה. הוא משלב קורא microplate, התקן תאורה ומכשיר רעידות עם תחנת עבודה אוטומציה6. Lustro משלבת תרבית אוטומטית וגירוי אור של תאים בלוחות מיקרו-בארות (איור 1 ואיור משלים 1), ומאפשרת סינון מהיר והשוואה של מערכות אופטוגנטיות שונות. פלטפורמת Lustro ניתנת להתאמה גבוהה וניתן להכליל אותה לעבודה עם רובוטים אחרים לאוטומציה במעבדה, התקני תאורה, קוראי לוחות, סוגי תאים ומערכות אופטוגנטיות, כולל אלה המגיבים לאורכי גל שונים של אור.
פרוטוקול זה מדגים את ההגדרה והשימוש בלוסטרו לאפיון מערכת אופטוגנטית. בקרה אופטוגנטית של גורמי שעתוק מפוצלים בשמרים משמשת כמערכת לדוגמה כדי להמחיש את הפונקציה והתועלת של הפלטפורמה על ידי חקירת הקשר בין קלט אור לבין ביטוי של גן כתב פלואורסצנטי, mScarlet-I7. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, חוקרים יכולים לייעל את האופטימיזציה של מערכות אופטוגנטיות ולהאיץ את הגילוי של אסטרטגיות חדשות לבקרה דינמית של מערכות ביולוגיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול Lustro המוצג כאן הופך את תהליכי הגידול, ההארה והמדידה לאוטומטיים, ומאפשר סינון ואפיון של מערכות אופטוגנטיותבתפוקה גבוהה 6. זה מושג על ידי שילוב התקן תאורה, קורא microplate, ומכשיר טלטול לתוך תחנת עבודה אוטומציה. פרוטוקול זה מדגים באופן ספציפי את התועלת של Lustro לסינון מבנים אופ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי R35GM128873 המענקים של המכונים הלאומיים לבריאות והקרן הלאומית למדע 2045493 (שהוענקה ל-M.N.M). מייגן ניקול מקלין, Ph.D. מחזיקה בפרס קריירה בממשק המדעי מקרן Burroughs Wellcome. Z.P.H. נתמך על ידי מענק הכשרה של NHGRI לתוכנית ההכשרה למדעים גנומיים 5T32HG002760. אנו מודים על דיונים פוריים עם חברי מעבדת McClean, ובמיוחד, אנו אסירי תודה לקירן סוויני על מתן הערות על כתב היד.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
Riferimenti
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. . A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- . Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- . YPD media. 2010 (9), (2010).
- . . Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -. B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioingegneria. 7 (4), 151 (2020).
