Esperimenti di optogenetica ad alto rendimento nel lievito utilizzando la piattaforma automatizzata Lustro
Summary
Questo protocollo delinea i passaggi per l’utilizzo della piattaforma automatizzata Lustro per eseguire la caratterizzazione ad alto rendimento dei sistemi optogenetici nel lievito.
Abstract
L’optogenetica offre un controllo preciso sul comportamento cellulare utilizzando proteine sensibili alla luce geneticamente codificate. Tuttavia, l’ottimizzazione di questi sistemi per ottenere la funzionalità desiderata richiede spesso più cicli di progettazione-costruzione-test, che possono richiedere molto tempo e manodopera. Per affrontare questa sfida, abbiamo sviluppato Lustro, una piattaforma che combina la stimolazione della luce con l’automazione di laboratorio, consentendo uno screening efficiente ad alto rendimento e la caratterizzazione dei sistemi optogenetici.
Lustro utilizza una stazione di lavoro di automazione dotata di un dispositivo di illuminazione, un dispositivo di scuotimento e un lettore di piastre. Impiegando un braccio robotico, Lustro automatizza il movimento di una piastra a micropozzetti tra questi dispositivi, consentendo la stimolazione di ceppi optogenetici e la misurazione della loro risposta. Questo protocollo fornisce una guida passo-passo sull’utilizzo di Lustro per caratterizzare i sistemi optogenetici per il controllo dell’espressione genica nel lievito in gemmazione Saccharomyces cerevisiae. Il protocollo copre la configurazione dei componenti Lustro, compresa l’integrazione del dispositivo di illuminazione con la workstation di automazione. Fornisce inoltre istruzioni dettagliate per la programmazione del dispositivo di illuminazione, del lettore di piastre e del robot, garantendo un funzionamento regolare e l’acquisizione dei dati durante tutto il processo sperimentale.
Introduction
L’optogenetica è una potente tecnica che utilizza proteine sensibili alla luce per controllare il comportamento delle cellule con elevata precisione 1,2,3. Tuttavia, la prototipazione di costrutti optogenetici e l’identificazione delle condizioni di illuminazione ottimali possono richiedere molto tempo, rendendo difficile l’ottimizzazione dei sistemi optogenetici 4,5. I metodi ad alto rendimento per lo screening e la caratterizzazione rapida dell’attività dei sistemi optogenici possono accelerare il ciclo di progettazione-costruzione-test per la prototipazione dei costrutti e l’esplorazione della loro funzione.
La piattaforma Lustro è stata sviluppata come tecnica di automazione di laboratorio progettata per lo screening e la caratterizzazione ad alto rendimento di sistemi optogenetici. Integra un lettore di micropiastre, un dispositivo di illuminazione e un dispositivo di scuotimento con una workstationdi automazione 6. Lustro combina la coltura automatizzata e la stimolazione luminosa delle cellule in piastre a micropozzetti (Figura 1 e Figura 1 supplementare), consentendo lo screening rapido e il confronto di diversi sistemi optogenetici. La piattaforma Lustro è altamente adattabile e può essere generalizzata per funzionare con altri robot di automazione di laboratorio, dispositivi di illuminazione, lettori di piastre, tipi di cellule e sistemi optogenici, compresi quelli che rispondono a diverse lunghezze d’onda della luce.
Questo protocollo dimostra l’impostazione e l’uso di Lustro per la caratterizzazione di un sistema optogenetico. Il controllo optogenetico dei fattori di trascrizione divisi nel lievito è utilizzato come sistema di esempio per illustrare la funzione e l’utilità della piattaforma sondando la relazione tra gli input luminosi e l’espressione di un gene reporter fluorescente, mScarlet-I7. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono semplificare l’ottimizzazione dei sistemi optogenetici e accelerare la scoperta di nuove strategie per il controllo dinamico dei sistemi biologici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo Lustro qui presentato automatizza i processi di coltivazione, illuminazione e misurazione, consentendo lo screening e la caratterizzazione ad alto rendimento dei sistemi optogenetici6. Ciò si ottiene integrando un dispositivo di illuminazione, un lettore di micropiastre e un dispositivo di scuotimento in una stazione di lavoro di automazione. Questo protocollo dimostra in modo specifico l’utilità di Lustro per lo screening di diversi costrutti optogenetici integrati nel lievito <em…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Institutes of Health R35GM128873 e dalla sovvenzione della National Science Foundation 2045493 (assegnata al M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. detiene un premio alla carriera presso lo Scientific Interface del Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. è stato supportato da una sovvenzione di formazione NHGRI per il programma di formazione in scienze genomiche 5T32HG002760. Riconosciamo le fruttuose discussioni con i membri del laboratorio McClean e, in particolare, siamo grati a Kieran Sweeney per aver fornito commenti sul manoscritto.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
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