الأيض المستهدف على الخلايا الأولية النادرة
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس المستقلبات بدقة وموثوقية في أنواع الخلايا النادرة. تتيح التحسينات التقنية ، بما في ذلك سائل غمد معدل لفرز الخلايا وتوليد عينات فارغة ذات صلة ، إجراء تقدير كمي شامل للمستقلبات بإدخال 5000 خلية فقط لكل عينة.
Abstract
تعتمد الوظيفة الخلوية بشكل حاسم على التمثيل الغذائي ، ويمكن دراسة وظيفة الشبكات الأيضية الأساسية عن طريق قياس وسيطة الجزيئات الصغيرة. ومع ذلك ، فإن الحصول على قياسات دقيقة وموثوقة لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، لا سيما في أنواع الخلايا النادرة مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم ، يتطلب تقليديا تجميع الخلايا من متعددة. يمكن البروتوكول الآن الباحثين من قياس المستقلبات في أنواع الخلايا النادرة باستخدام فأر واحد فقط لكل عينة مع توليد نسخ متماثلة متعددة لأنواع خلايا أكثر وفرة. هذا يقلل من عدد المطلوبة لمشروع معين. يتضمن البروتوكول المقدم هنا العديد من الاختلافات الرئيسية عن بروتوكولات الأيض التقليدية ، مثل استخدام 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم كسائل غمد ، والفرز مباشرة في الأسيتونيتريل ، واستخدام القياس الكمي المستهدف مع الاستخدام الصارم للمعايير الداخلية ، مما يسمح بقياسات أكثر دقة وشمولية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي. على الرغم من الوقت اللازم لعزل الخلايا المفردة ، وتلطيخ الفلورسنت ، والفرز ، يمكن للبروتوكول الحفاظ على الاختلافات بين أنواع الخلايا والعلاجات الدوائية إلى حد كبير.
Introduction
الأيض هو عملية بيولوجية أساسية تحدث في جميع الخلايا الحية. تتضمن عمليات التمثيل الغذائي شبكة واسعة من التفاعلات الكيميائية الحيوية المنظمة بإحكام والمترابطة ، مما يسمح للخلايا بإنتاج الطاقة وتوليف الجزيئات الحيوية الأساسية1. لفهم وظيفة الشبكات الأيضية ، يقيس الباحثون مستويات الجزيئات الصغيرة الوسيطة داخل الخلايا. تعمل هذه المواد الوسيطة كمؤشرات مهمة للنشاط الأيضي ويمكن أن تكشف عن رؤى مهمة في الوظيفة الخلوية.
قياس الطيف الكتلي (MS) هو الخيار الأكثر شيوعا للكشف المحدد عن المستقلبات في العينات المعقدة 1,2. يتميز الرنين المغناطيسي النووي (NMR) بمزايا في القياس الكمي المطلق للمركبات وتوضيح البنية ، ولكن يمكن لمرض التصلب العصبي المتعدد في كثير من الأحيان حل المزيد من المكونات في الخلائط المعقدة مثل السوائل الحيوية أو مستخلصات الخلايا. في أكثر الأحيان ، يتم دمج MS مع الفصل المسبق للمركب عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري (CE) أو كروماتوغرافيا الغاز (GC) أو الكروماتوغرافيا السائلة (LC) 3. إن اختيار منصة الفصل مدفوع في الغالب بنطاق المستقلبات المستهدفة ونوع العينة ، وفي بيئة العالم الحقيقي ، بتوافر الآلات والخبرات. تحتوي جميع منصات الفصل الثلاثة على مجموعة واسعة ومتداخلة من المستقلبات المناسبة ولكن لها قيود مختلفة. باختصار ، يمكن ل CE فصل الجزيئات المشحونة فقط ويتطلب الكثير من الخبرة لتنفيذ تحليل قوي لعدد كبير من العينات4. يقتصر GC على الجزيئات الصغيرة وغير القطبية بما يكفي للتبخر قبل أن تتحلل3. بالنظر إلى جميع أعمدة LC المتاحة تجاريا ، يمكن فصل أي مستقلبين بواسطة هذه التقنية5. ومع ذلك ، فإن العديد من طرق LC تظهر قوة حل أقل من طرق CE أو GC ذات الطول المماثل.
عادة ما تكون الكمية النموذجية للمواد الأولية لقياسات الأيض في حدود 5 × 105 إلى 5 × 107 خلايا لكل عينة ، أو 5-50 مجم من الأنسجة الرطبة ، أو 5-50 ميكرولتر من سائل الجسم6. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب الحصول على مثل هذه الكميات من المواد الأولية عند العمل مع الخلايا الأولية لأنواع الخلايا النادرة ، مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) أو الخلايا السرطانية المنتشرة. غالبا ما توجد هذه الخلايا بأعداد قليلة جدا ولا يمكن زراعتها دون المساس بالميزات الخلوية الحرجة.
الخلايا الجذعية السرطانية والخلايا السلفية متعددة القدرات (MPPs) هي الخلايا الأقل تمايزا في نظام المكونة للدم وتنتج باستمرار خلايا دم جديدة طوال حياة الكائن الحي. تنظيم تكون الدم له أهمية سريرية في حالات مثل سرطان الدم وفقر الدم. على الرغم من أهميتها ، تعد HSCs و MPPs من بين أندر الخلايا داخل نظام المكونة للدم. من ماوس واحد ، عادة ، يمكن عزل حوالي 5000 HSCs7،8،9. نظرا لأن طرق الأيض التقليدية تتطلب المزيد من مواد الإدخال ، فقد كان تجميع الخلايا من فئران متعددة ضروريا في كثير من الأحيان لتحليل أنواع الخلايا النادرة10,11.
هنا ، كنا نهدف إلى تطوير بروتوكول يتيح قياس المستقلبات في أقل من 5000 خلية لكل عينة لتمكين توليد بيانات الأيض من HSCs لفأر واحد12. في الوقت نفسه ، تسمح هذه الطريقة بتوليد نسخ متماثلة متعددة من فأر واحد لأنواع خلايا أكثر وفرة مثل الخلايا الليمفاوية. يقلل هذا النهج من عدد المطلوبة لمشروع معين ، وبالتالي يساهم في “3R” (الحد ، الاستبدال ، الصقل) للتجارب على.
يمكن أن يكون للمستقلبات في الخلايا معدلات دوران عالية جدا ، غالبا في حدودثوان 13. ومع ذلك ، فإن إعداد العينات لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) يمكن أن يستغرق ساعات ، ويمكن أن يستغرق فرز FACS نفسه من دقائق إلى ساعات ، مما يؤدي إلى تغييرات محتملة في الأيض بسبب الظروف غير الفسيولوجية. بعض الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول (مثل محلول تحلل كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم [ACK]) يمكن أن يكون لها تأثيرات مماثلة. يمكن أن تسبب هذه الحالات الإجهاد الخلوي وتؤثر على مستويات ونسب المستقلبات داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى قياسات غير دقيقة أو متحيزة لعملية التمثيل الغذائي الخلوي14،15،16. يشار أحيانا إلى التغيرات الأيضية الناتجة عن تحضير العينة باسم فرز القطع الأثرية. يمكن أن تؤدي بروتوكولات الهضم الطويلة والكواشف القاسية التي قد تكون مطلوبة لإنتاج معلقات أحادية الخلية من الأنسجة الصلبة أو الصلبة إلى تفاقم هذه المشكلة. تعتمد التغييرات التي يمكن أن تحدث على الأرجح على نوع الخلية وحالة المعالجة. لا تزال الطبيعة الدقيقة للتغيرات غير معروفة ، حيث لا يمكن قياس الحالة الأيضية للخلايا غير المضطربة في الأنسجة الحية.
يتضمن البروتوكول المقدم هنا العديد من الاختلافات الرئيسية مقارنة بالطرق التقليدية ، وهي استخدام 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم كسائل غمد ، والفرز مباشرة في محلول الاستخراج ، وحقن أحجام عينات كبيرة على كروماتوغرافيا السائل المحبة للماء – قياس الطيف الكتلي (HILIC-MS) ، واستخدام القياس الكمي المستهدف ، والاستخدام الصارم للمعايير الداخلية وضوابط الخلفية (الشكل 1). هذا البروتوكول لديه القدرة على الحفاظ على الاختلافات بين أنواع الخلايا وبين العلاج بالعقاقير ومراقبة المركبات إلى حد كبير12. حتى بالنسبة للخلايا المستزرعة ، فإنه يقارن بشكل إيجابي بالنهج البديلة ، مثل الطرد المركزي الأكثر رسوخا والإزالة اليدوية للطاف. ومع ذلك ، نظرا لاستمرار حدوث فرز القطع الأثرية ، يجب تفسير البيانات بحذر. على الرغم من هذا القيد ، يمثل البروتوكول تحسنا كبيرا في مجال التنميط الأيضي ، مما يسمح بقياسات أكثر دقة وشمولية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي في الخلايا الأولية النادرة12.
إن القدرة على قياس الملامح الأيضية الواسعة في الخلايا الأولية النادرة تفتح الباب أمام تجارب جديدة في البحوث الطبية الحيوية التي تشمل هذه الخلايا. على سبيل المثال ، ثبت أن التنظيم بوساطة التمثيل الغذائي في HSCs يؤثر على قدرة التجديد الذاتي للسكون ، مع آثار على فقر الدم وسرطان الدم11،17. في الخلايا السرطانية المتداولة المشتقة من المريض ، ظهرت اختلافات في التعبير عن الجينات الأيضية بين الورم والخلايا المجاورة18,19. يسمح هذا البروتوكول الآن للباحثين بدراسة هذه الاختلافات بشكل منهجي على مستوى التمثيل الغذائي ، والذي يعتبر عموما أقرب إلى النمط الظاهري الخلوي من التعبير الجيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
أهم الخطوات للتنفيذ الناجح للمستقلبات المستهدفة باستخدام هذا البروتوكول هي 1) استراتيجية تلطيخ وبوابات قوية من شأنها أن تنتج مجموعات خلايا نظيفة 2) معالجة دقيقة لأحجام السائل ، 3) توقيت قابل للتكرار لجميع الخطوات التجريبية ، ولا سيما جميع الخطوات قبل استخراج الأيض. من الناحية المثالية ، يج…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا منشأة التابعة لمعهد ماكس بلانك لعلم المناعة وعلم التخلق على توفير المستخدمة في هذه الدراسة.
Materials
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
Riferimenti
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023)
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -. Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
