Summary
यहां, हम ट्रिपैनोसोमा इवांसी से संक्रमित चूहों में नोसिसेप्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, एक उपकरण के रूप में इलेक्ट्रॉनिक वॉन फ्रे तंत्र का उपयोग करते हुए, हिंद पंजा और आंत के यांत्रिक थ्रेसहोल्ड को मापते हैं।
Abstract
संक्रामक रोग रोगजनन अभी भी अध्ययन करने के लिए एक जटिल क्षेत्र है। घरेलू जानवरों में एलोडोनिया और दर्द जैसे कई नैदानिक संकेतों का कोर्स देखा जा सकता है। हालांकि, उनके रास्ते और सही उपचार के ज्ञान को नियंत्रित प्रयोगों की आवश्यकता होती है, उनमें से कई प्रयोगशाला जानवरों का उपयोग करते हैं। हिंद पंजा और विसरा के यांत्रिक थ्रेसहोल्ड में परिवर्तन को मापना कृन्तकों में दर्द की धारणा में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है। निकासी प्रतिक्रिया को पहले आधारभूत परीक्षणों में मापा जा सकता है, जो प्रयोगात्मक समूहों का बेहतर नियंत्रण बनाता है। संक्रमण को प्रेरित करने और प्रोटोकॉल में दवाओं को जोड़ने के बाद बाद के परीक्षण किए जा सकते हैं। दर्द जैसे परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए चेहरे के पैमाने के उपयोग से जुड़े इलेक्ट्रॉनिक वॉन फ्रे तंत्र का उपयोग चूहों में एलोडोनिया और दर्द का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल, सटीक और सुसंगत मूल्यांकन की अनुमति देता है। इस प्रकार, ट्रिपैनोसोमा इवांसी संक्रमण के लिए वर्तमान पद्धति का उपयोग करने वाले प्रयोग प्रयोगशाला संक्रमित जानवरों में एलोडोनिया और दर्द का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी विधि का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसे पशुधन जानवरों के लिए पारंपरिक उपचार पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
Trypanosoma evansi दक्षिण अमेरिका 1,2 में "surra" या "mal-das-cadeiras" नामक रोग के etiological एजेंट है. यह आमतौर पर घोड़ों और मवेशियों को प्रभावित करता है, लेकिन यह भी जंगली जीव, हेमटोफैगस चमगादड़ द्वारा प्रेषित किया जा रहा है, tabanids, और stomoxes मक्खीकाटने 1,3. सुर्रा घरेलू जानवरों में एक प्रमुख बीमारी है, जो सही उपचार के अभाव में घातक हो सकती है, एनीमिया जैसे निरर्थक नैदानिक संकेतों का प्रदर्शन, भूख और वजन में कमी, मांसपेशियों की कमजोरी, और गर्भपात, जो मेजबान और भौगोलिक क्षेत्र 2,4,5,6के अनुसार भिन्न हो सकते हैं।
रोग के पाठ्यक्रम के दौरान संक्रमित जानवरों में एलोडोनिया और दर्द की अभिव्यक्ति अभी भी एक नया विषय 2,7 है. इन संकेतों के पीछे रोगजनन को समझने का आग्रह क्लासिक ट्रिपैनोसाइडल प्रोटोकॉल 5,6 में प्रभावी एनाल्जेसिक दवाओं को जोड़कर वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले उपचार को बेहतर बनाने और परिष्कृत करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इस परिदृश्य में, एक murine मॉडल का उपयोग कर रोग की नकल की संभावना एक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है, के रूप में चूहों आसानी से प्रयोगशाला में नियंत्रित वातावरण के तहत रखा जा सकता है और इसलिए, उपज परिणाम है कि पशुधन का उपयोग कर क्षेत्र प्रयोगों की तुलना में अधिक सुसंगत हैं.
एक यांत्रिक सीमा आमतौर परप्रयोगों 2,8,9 की एक बड़ी संख्या में एलोडोनिया के मूल्यांकन के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक वॉन फ्रे (ईवीएफ) उपकरण का उपयोग कर प्राप्त किया जाता है. इस उपकरण का उपयोग यांत्रिक उत्तेजना के लिए ऊतक संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए किया जाता है: एक बार जब उपकरण जानवर के पंजे को छूता है, तो डिवाइस से जुड़े 20-200 माइक्रोन टिप के माध्यम से, जिस बल के साथ जानवर पंजा वापस लेता है वह दर्ज किया जाता है।
कृन्तकों को आमतौर पर इन प्रयोगों में मानक जानवरों के रूप में उपयोग किया जाता है, और अधिकांश परिणाम अन्य प्रजातियों के लिए एक्सट्रपलेशन किए जाते हैं, क्योंकि अधिकांश शोध किए गए रोग अन्य प्रजातियों से आते हैं जिनमें नियंत्रित अध्ययन करना मुश्किल होगा। इसके अलावा, एलोडोनिया और दर्द घनिष्ठ रूप से संबंधित हैं। संक्रमित चूहों में दर्द का मूल्यांकन करने के लिए एक विशिष्ट चेहरे के पैमाने का उपयोग टी के पाठ्यक्रम के दौरान दर्द की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए एक पुष्टि सहायक के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है.
इस प्रोटोकॉल में, हम एलोडोनिया और चूहों में दर्द का मूल्यांकन करने के लिए एक उपन्यास मॉडल प्रदर्शित करते हैं जो प्रयोगात्मक रूप से टी इवांसी से संक्रमित है, जो चर के बीच एक उच्च सहसंबंध दिखा रहा है, इस प्रकार एक मजबूत मॉडल साबित होता है। इसके अलावा, प्रयोग के दौरान मानव हस्तक्षेप की संभावना को कम करते हुए, पूरी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए शोधकर्ताओं की एक छोटी संख्या की आवश्यकता होती है। यह अन्वेषक को एक तीव्र पाठ्यक्रम के दौरान लक्ष्य रोग को दोहराने और प्रयोगात्मक डिजाइन में कई अलग-अलग उपचार दवाओं को जोड़ने में सक्षम बनाता है, जिससे छोटी अवधि में लगातार परिणाम प्राप्त होते हैं।
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Protocol
सभी प्रयोगों 10 सप्ताह पुराने वयस्क महिला स्विस चूहों (35-55 ग्राम) का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. जानवरों को नियंत्रित तापमान (21 ± 1 डिग्री सेल्सियस), 12 घंटे प्रकाश / 12 घंटे अंधेरे चक्र, और मानक प्रयोगशाला चाउ और पानी विज्ञापन लिबिटम के साथ एक कमरे में पॉलीसल्फोन पिंजरों (पिंजरे प्रति 3-5 जानवरों) में रखा गया था। दवा उपचार के लगातार प्रभावों को प्रदर्शित करने के लिए प्रत्येक परीक्षण में प्रत्येक समूह को दस जानवरों को सौंपा गया था। प्रयोगात्मक डिजाइन प्रस्तुत और सांता कैटरीना स्टेट यूनिवर्सिटी (CEUA) (प्रोटोकॉल संख्या: 6019201123) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था. सभी पशु प्रयोगों ने ARRIVAL दिशानिर्देशों (पशु अनुसंधान: विवो प्रयोगों में रिपोर्टिंग) का अनुपालन किया और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद गाइड के अनुसार किए गए।
1. ट्रिपैनोसोमा इवांसी तैयारी और टीकाकरण
चेतावनी: एक डिस्पोजेबल लैब कोट पहनें, दस्ताने, मुखौटा, और आंखों की सुरक्षा जब संक्रमित रक्त के नमूनों, अभिकर्मकों, और अन्य रासायनिक यौगिकों से निपटने.
- पानी के स्नान उपकरण चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर समायोजित करें।
- अल्ट्राफ्रीज़र (-80 डिग्री सेल्सियस) से संरक्षित रक्त के नमूने युक्त एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब लें। इसे पानी के स्नान में तब तक रखें जब तक कि रक्त पिघल न जाए।
नोट: एक ही अलग रक्त मार्ग की एक समान संख्या को बनाए रखने के लिए विभिन्न प्रयोगों के हर समूह में सभी चूहों को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. - फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस, 0.1 एम) का उपयोग करें जिसमें 60% डी- (+) ग्लूकोज (पीएच 7.4) होता है ताकि धारावाहिक कमजोर पड़ने (10: 1 वी वी) किया जा सके जब तक कि 1 × 104 ट्रिपैनोसोम प्रति 0.1 एमएल प्राप्त नहीं किया जाता है। एक 100x उद्देश्य लेंस2 के साथ एक खुर्दबीन पर एक न्यूबॉयर कक्ष का उपयोग कर मैनुअल सेल गिनती द्वारा परजीवी कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें।
- पतला रक्त समाधान (संक्रमित समूह) के 0.1 एमएल, या 0.9% खारा वाहन (नियंत्रण समूह) में एक ही मात्रा, इंट्रापेरिटोनली, एक इंसुलिन सिरिंज के साथ युग्मित 26 जी 1/2 "सुई का उपयोग करके।
2. इलेक्ट्रॉनिक वॉन फ्रे उपकरण सेटअप और संचालन
नोट: कैसे प्राप्त डेटा दर्ज कर रहे हैं के बारे में सावधान रहें. कुछ ईवीएफ उपकरणों में उपकरण से प्राप्त डेटा को अन्य इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों, जैसे कंप्यूटर, टैबलेट या स्मार्टफोन में स्थानांतरित करने के लिए विशिष्ट कार्यक्रम होते हैं।
- EvF उपकरण चालू करें। सुनिश्चित करें कि प्रयोग शुरू करने से पहले उपकरण अच्छी तरह से चार्ज हो गया है, उपकरण स्क्रीन पर प्रदर्शित बैटरी स्तर को देखते हुए और यदि आवश्यक हो तो इसे चार्ज करें।
- प्राप्त डेटा को स्थानांतरित करने और सहेजने के लिए ईवीएफ उपकरण को वाई-फाई के माध्यम से चुने हुए इलेक्ट्रॉनिक उपकरण से कनेक्ट करें।
- EvF तंत्र शंकु में एक 10 माइक्रोन पॉलीप्रोपाइलीन टिप डालें और एक पंजा प्रतीक के साथ बटन दबाकर शून्य (0.00 ग्राम) के लिए रीडआउट सेट करें।
- निरीक्षण करें कि एक बार मूल्यांकन किए गए ऊतक की जांच की जाती है; अधिकतम लागू दबाव EvF उपकरण प्रदर्शन पर दिखाया गया है। उसके बाद, सुरक्षित रिकॉर्डिंग के लिए एंटीना प्रतीक के साथ बटन दबाकर इसे चुने हुए इलेक्ट्रॉनिक डिवाइस में स्थानांतरित करें।
- रीडआउट को शून्य पर रीसेट करें और फिर से पंजा प्रतीक के साथ बटन दबाकर एक नया माप लेने के लिए तैयार हो जाएं।
3. यांत्रिक दहलीज आकलन के लिए सामान्य विचार
- 21 डिग्री सेल्सियस और 12 घंटे प्रकाश / 12 घंटे अंधेरे चक्र पर नियंत्रित तापमान के साथ एक शांत कमरे में सभी प्रयोग करें, और दिन2 के एक ही समय में सभी मूल्यांकन करके माउस सर्कैडियन चक्र का सम्मान करना सुनिश्चित करें।
- क्या एक ही व्यक्ति पूर्वाग्रह को कम करने और माप स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए आधारभूत और प्रयोगात्मक यांत्रिक दहलीज आकलन दोनों करता है; सुनिश्चित करें कि प्रयोग अंधे हैं।
- प्रत्येक माउस को पॉलीमेथिल मेथैक्रिलेट (पीएमएमए) से बने एक व्यक्तिगत कक्ष के अंदर धीरे से रखें, जिसमें 5 मिमी² मेष फर्श स्टैंड 2,8 पर छिद्रित शीर्ष रखा गया हो।
- चूहों को आधारभूत और प्रयोगात्मक यांत्रिक थ्रेसहोल्ड 2 दोनों का आकलन करने से पहले पीएमएमए कक्षों में 30 मिनट के लिएअनुकूल होने की अनुमति दें।
- मेष फर्श स्टैंड को एक आरामदायक ऊंचाई (एक स्थिर सतह पर) पर रखें ताकि जानवर सभी तरफ से सुलभ हों। सुनिश्चित करें कि पेट और चूहों के सभी चार पंजे जाल फर्श के उद्घाटन के माध्यम से आसानी से सुलभ हैं.
- अवशोषित या संभोग और शौच इकट्ठा करने के लिए शोषक सामग्री के साथ कक्षों आवंटित करने के लिए इस्तेमाल किया स्थिर सतह को कवर. सुनिश्चित करें कि अन्वेषक की बाहें ईवीएफ तंत्र का संचालन करते समय कक्षों के नीचे स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ सकती हैं।
4. बेसलाइन यांत्रिक दहलीज मूल्यांकन और उत्तेजनाओं के लिए माउस प्रतिक्रिया
- पेट के माप के लिए, पेट को तीन आभासी भागों (कपाल, मध्यम और दुम के क्षेत्रों) में विभाजित करें। आंत एलोडोनिया यांत्रिक दहलीज मूल्यांकन के लिए मानक लक्ष्य ऊतक के रूप में कपाल क्षेत्र (शारीरिक रूप से जिगर युक्त) चुनें। पंजा माप के लिए, मानकीकरण के लिए सही हिंद पंजा चुनें।
- संक्रमण से पहले प्रत्येक माउस 48 घंटे से एक आधारभूत माप ले लो. ऐसा करने के लिए, युक्त कक्षों में चूहों जगह, EvF तंत्र तैयार, और धीरे धीरे जांच बढ़ाने के लिए लक्षित ऊतक को उत्तेजित करने के लिए दोनों हाथों का उपयोग करें.
- धीरे-धीरे ऊतक पर दबाव बढ़ाएं जब तक कि माउस एक nociceptive व्यवहार व्यक्त न करे। सही हिंद पंजा मूल्यांकन के लिए, पंजा वापसी, पंजा चाट, या चार पंजा कूद 2,8,9 के लिए देखो. आंत के मूल्यांकन के लिए, पेट की एक तेज वापसी, तत्काल चाट या जांच साइट की खरोंच, या चार पंजाकूद 2,11 के लिए देखो.
- विशिष्ट ईवीएफ प्रोग्राम वाले चुने हुए इलेक्ट्रॉनिक डिवाइस में डेटा स्थानांतरित करके या ग्रेड बुक में लिखकर प्राप्त मूल्य को बचाएं। प्रदर्शन को शून्य पर रीसेट करें और पांच माप प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया को चार बार दोहराएं8.
नोट: माध्य मान2 का अनुमान लगाने के लिए केवल तीन समान मापों पर विचार करें - आसन्न कक्ष में मौजूद माउस की यांत्रिक दहलीज को मापें जब तक कि प्रत्येक माउस की पांच बार जांच नहीं की जाती है और प्रत्येक जानवर के लिए एक औसत मूल्य प्राप्त होता है।
- आधारभूत माप 24 घंटे बाद दोहराएं और 3.00 ग्राम से नीचे या 2.00ग्राम 2,8 से अधिक बेसल माप के बीच अंतर के साथ औसत मूल्यों के साथ चूहों को बाहर करें।
नोट: केवल एक लक्ष्य ऊतक हर प्रयोग में प्रत्येक माउस के लिए चुना जाना चाहिए ताकि जानवरों की जांच करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा रहा है, के रूप में मूल्यांकन की संख्या एक छोटी अवधि में काफी अधिक हो जाएगा.
5. प्रायोगिक सही हिंद पंजा और आंत allodynia यांत्रिक दहलीज मूल्यांकन
- दिन 0 मूल्यांकन के लिए संक्रमण के बाद सही हिंद पंजा या आंत एलोडोनिया यांत्रिक दहलीज 1 घंटे का आकलन करें।
- संक्रमण के बाद 5 दिनों में हर 24 घंटे में प्रक्रिया दोहराएं।
नोट: यदि प्रशासित होने के लिए कोई उपचार है, तो प्रयोगात्मक डिजाइन के भीतर एक उपयुक्त समय बिंदु चुनें। - माप पूरा होने के बाद मानक लैब चाउ और पानी विज्ञापन लिबिटम तक पहुंच के साथ, जानवरों को एक-दूसरे से लड़ने से रोकने के लिए चूहों को उनके मूल पिंजरों में लौटाएं।
- डेटा के सामान्य वितरण और एकत्रित डेटा के आगे उपयुक्त सांख्यिकीय विश्लेषण की जांच करने के लिए एक सामान्यता परीक्षण करें।
6. माउस ग्रिमेस स्केल मूल्यांकन
- सुनिश्चित करें कि प्रत्येक माउस आसानी से देखा जाता है, जबकि युक्त कक्ष के अंदर और प्रयोग से पहले प्रत्येक माउस की जांच सुनिश्चित करने के लिए वहाँ अंगों, पेट, या चेहरे और कोई कोट परिवर्तन पर कोई घाव नहीं कर रहे हैं.
- माउस कक्षीय क्षेत्र का निरीक्षण करें। दर्द (स्कोर 0) की अनुपस्थिति के रूप में खुली आंखों को वर्गीकृत करें, जबकि एक स्पष्ट दर्द का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है जब माउस अपनी आंखें बंद कर देता है (स्कोर 2)।
- चूहे की नाक का निरीक्षण करें। एक सामान्य नाक को दर्द की अनुपस्थिति के रूप में वर्गीकृत करें जबकि नाक के पुल पर एक उभार की उपस्थिति स्पष्ट दर्द का प्रतिनिधित्व करती है।
- चूहे के गालों का निरीक्षण करें। सामान्य गालों को दर्द की अनुपस्थिति के रूप में वर्गीकृत करें जबकि दोनों गालों पर एक उभार की उपस्थिति स्पष्ट दर्द का प्रतिनिधित्व करती है।
- चूहे के कानों की स्थिति का प्रेक्षण कीजिए। गोल कानों को दर्द की अनुपस्थिति के रूप में वर्गीकृत करें, जबकि कान बाहर या पीछे की ओर घूमते हैं, चेहरे से दूर, एक नुकीले आकार में, स्पष्ट दर्द का प्रतिनिधित्व करते हैं। दर्द स्कोर के साथ कानों के बीच की जगह बढ़ जाती है।
- माउस की मूंछों का निरीक्षण करें। दर्द की अनुपस्थिति के रूप में अपने प्राकृतिक नीचे की ओर वक्र के साथ मूंछों को वर्गीकृत करें, जबकि मूंछें जो या तो गाल के खिलाफ वापस खींची जाती हैं या आगे खींची जाती हैं, स्पष्ट दर्द का प्रतिनिधित्व करती हैं।
- जन्मजात व्यवहार के रूप में, जैसे कि आत्म-संवारना, चेहरे की अभिव्यक्ति में हस्तक्षेप कर सकता है, इन्हें दर्द से संबंधित व्यवहार न मानें8. प्रत्येक क्रिया इकाई मूल्यांकन से पहले इस व्यवहार को रोकने के लिए माउस की प्रतीक्षा करें।
- डेटा के सामान्य वितरण और एकत्रित डेटा के आगे उपयुक्त सांख्यिकीय विश्लेषण की जांच करने के लिए एक सामान्यता परीक्षण करें।
नोट: सभी प्रयोगों के अंत में, चूहों को केटामाइन (90 मिलीग्राम/किग्रा) और xylazine (7.5 मिलीग्राम/किग्रा) का उपयोग करके मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दी गई थी, जिसे इंट्रापेरिटोनली इंजेक्ट किया गया था। एक पुष्टि की गहरी संज्ञाहरण योजना तक पहुंचने के बाद, उन्हें गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के लिए प्रस्तुत किया गया था।
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Representative Results
के कारण यांत्रिक दहलीज में कमी टी. इवांसी संक्रमण के रूप में दोनों सही हिंद पंजा और आंत के ऊतकों पर इलेक्ट्रॉनिक वॉन फ्रे तंत्र द्वारा मूल्यांकन किया
प्रयोग 5 दिनों में आयोजित किया गया था, उपलब्ध टी से संबंधित पिछले आंकड़ों के अनुसार. संक्रमित चूहों ने दिन 3 पोस्ट संक्रमण में दाहिने हिंद पंजे पर यांत्रिक दहलीज में एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाना शुरू कर दिया और असंक्रमित चूहों की तुलना में अगले 2 दिनों के बाद संक्रमण (चित्रा 1ए)के दौरान नियंत्रण समूह की तुलना में काफी कम रहा। पेट स्पर्श संवेदनशीलता के लिए इसी तरह के परिणाम संक्रमित चूहों में आंत एलोडोनिया को दिन 3 पोस्ट संक्रमण से शुरू करते हैं और अगले 2 दिनों के बाद संक्रमण (चित्रा 1बी) के दौरान नियंत्रण समूह की तुलना में काफी कम रहते हैं।
चित्रा 1: ट्रिपैनोसोमा इवांसी द्वारा प्रयोगात्मक रूप से संक्रमित चूहों का एलोडोनिया मूल्यांकन। (ए) दाएं हिंद पंजा एलोडोनिया और (बी) आंत एलोडोनिया। डेटा प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए दस जानवरों के एसडी ± मतलब के रूप में व्यक्त. सांख्यिकीय विश्लेषण: छात्र का टी-परीक्षण, प्रति समय बिंदु एक अयुग्मित विश्लेषण। तारांकन एक ही विश्लेषण समय बिंदु (पी < 0.05) पर विचार प्रयोगात्मक समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
टी. इवांसी संक्रमण द्वारा माउस दर्द से संबंधित चेहरे की विशेषताओं का प्रेरण और माउस ग्रिमेस स्केल दर्द मूल्यांकन द्वारा संख्यात्मक व्याख्या
संक्रमित चूहों ने संक्रमण के बाद 3 दिन दर्द से संबंधित चेहरे की विशेषताओं के महत्वपूर्ण लक्षण प्रकट करना शुरू कर दिया, जो संदर्भित समय बिंदु पर 0.4 [0-1] का औसत स्कोर दिखा रहा था। प्रयोग के दौरान एक ही प्रवृत्ति देखी गई, जिसमें संक्रमित समूह ने नियंत्रण समूह की तुलना में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया, क्रमशः 0.6 [0-1] और 1.3 [0-2] के औसत स्कोर 4 और 5 पोस्ट संक्रमण के लिए पेश किया। नियंत्रण समूह ने माउस ग्रिमेस स्केल पर स्कोर नहीं किया, जैसा कि अपेक्षित था। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था, प्रति समय बिंदु एक अयुग्मित विश्लेषण, पी < 0.05 के महत्वपूर्ण मूल्य के रूप में माना जाता है। इसके अलावा, पियर्सन सहसंबंध गुणांक (आर) ने माउस ग्रिमेस स्केल दर्द मूल्यांकन और दाएं हिंद पंजा एलोडोनिया के बीच या एक ही पैमाने और आंत के एलोडोनिया के बीच बातचीत पैटर्न की पहचान की, जो मान क्रमशः -96.35% और -84.08% थे। इसके अलावा, माउस ग्रिमेस स्केल दर्द मूल्यांकन और दाएं हिंद पंजा एलोडोनिया या आंत के एलोडोनिया के लिए निर्धारण के गुणांक (आर2) क्रमशः 0.9283 और 0.7070 थे।
वर्तमान अध्ययन पिछले डेटा, जो टी इवांसी संक्रमण 2,3,7,12 के पाठ्यक्रम के माध्यम से सूजन और दर्द की उपस्थिति की पुष्टि की के साथ सहमत हैं. इसके अलावा, वर्णित विधि चूहों में एलोडोनिया और दर्द की पहचान करने और मापने के लिए एक सटीक पद्धति प्रदान करती है। इसके अलावा, संक्रमित चूहों में माउस ग्रिमेस स्केल दर्द मूल्यांकन के उपयोग नेसंबंधित जानवरों के आंत एलोडोनिया मूल्यांकन के लिए दाएं हिंद पंजा एलोडोनिया मूल्यांकन और उच्च नकारात्मक आर (70 से 89%) द्वारा व्यक्त परिणामों की तुलना में बहुत अधिक नकारात्मक आर (90 से 100%) का संकेत दिया। इसी तरह, संक्रमित चूहों में माउस ग्रिमेस स्केल दर्द मूल्यांकन के उपयोग ने एक बहुत मजबूत आर2 (0.90 से 1.00) का संकेत दिया, जब सही हिंद पंजा एलोडोनिया मूल्यांकन और मजबूत आर2 (0.70 से 0.89) द्वारा व्यक्त परिणामों की तुलना में एक ही जानवरों के आंत एलोडोनिया मूल्यांकन के लिए14.
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Discussion
संक्रमित जानवरों से जुड़े प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण कदम परजीवी के स्तर का नियंत्रण है। टी इवांसी के विभिन्न उपभेदों चूहों में अलग अलग तरीके से व्यवहार कर सकते हैं, तीव्र से पुराने संक्रमण 2,4,5,6 के लिए अग्रणी. इसके अलावा, संक्रमण की खुराक में परिवर्तन चूहों के जीवित रहने के समय को कम या बढ़ा सकता है। इसलिए, प्रयोगों से पहले एक जीवित वक्र प्राप्त प्रयोग की सही अवधि निर्धारित करने और अप्रत्याशित माउस मौतघटनाओं 15,16 के साथ निराशा को रोकने के लिए सिफारिश की है. इसके अतिरिक्त, यह डेटा प्रयोग के लिए मानवीय समापन बिंदु निर्धारित कर सकता है, यदि लागू हो।
इसके अलावा, एक ही अलग प्रयोग में सभी चूहों को संक्रमित करने के लिए रक्त मार्ग की एक समान संख्या का सम्मान करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में बताया. उसी तरह, क्रायोप्रेज़र्व्ड या ताजा संक्रमित रक्त का उपयोग चूहों को संक्रमित करने के लिए किया जा सकता है, क्योंकि पानी के स्नान में डीफ्रॉस्टिंग के बाद कुछ क्रायोप्रेज़र्ड नमूने निष्क्रिय हो सकते हैं। हालांकि, ताजा संक्रमित रक्त तेजी से परजीवी का उत्पादन कर सकते हैं और इसलिए, पहले मौतकी घटनाओं 17,18.
प्रयोग में संशोधन, जैसे ट्रिपैनोसाइडल या एनाल्जेसिक दवाओं के अलावा, व्यवहार्य हैं। नए समूहों का मतलब अधिक जानवर हैं और यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि चुनी हुई दवाओं के लिए भी नियंत्रण समूहों को आधारभूत माप के लिए प्रस्तुत किया जाना चाहिए। हमारे अनुभव में, लगभग 20-25% चूहों को दूसरे आधारभूत माप के बाद प्रयोग से बाहर रखा गया है, जो पिछले डेटा8 के अनुरूप है। इसका मतलब यह है कि जानवरों की प्रारंभिक संख्या जानवरों की प्रयोगात्मक संख्या से अधिक होनी चाहिए, जो एक मुद्दा हो सकता है जब अधिक समूहों का मूल्यांकन किया जाता है और परिणामस्वरूप चूहों की अधिक संख्या का अनुमान लगाया जाता है।
इस मॉडल के लिए फार्माकोकाइनेटिक्स और फार्माकोडायनामिक्स को ध्यान में रखा जाना चाहिए। कुछ दवाओं उनके औषधीय कार्रवाई लागू करने के लिए विस्तारित अवधि ले, जो चूहों आमतौर पर 4 से 5 दिन 2,6 के एक औसत में मर जाते हैं, जहां एक मॉडल के प्रयोगात्मक डिजाइन को प्रभावित कर सकते हैं. इसके अलावा, यदि जानवर चुने हुए उपचार के लिए उपवास कर रहे हैं, तो अनुकूलन अवधि पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है, क्योंकि यह दवा की गतिशीलता और प्रयोगात्मक अनुसूची और प्रक्रिया दोनों को प्रभावित करेगा, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में बताया गया है।
वर्तमान पद्धति में एक बड़ा सुधार यह है कि एक एकल अच्छी तरह से प्रशिक्षित शोधकर्ता संक्रमण या उपचार के लिए अंधा रहते हुए संपूर्ण ईवीएफ पढ़ने की प्रक्रिया (आधारभूत और प्रयोगात्मक माप दोनों) कर सकता है। एक अन्य अन्वेषक प्रयोग की शुरुआत में संक्रमण प्रदर्शन करना चाहिए. संक्रमण प्रक्रिया के बाद यह आवश्यक नहीं है, क्योंकि ईवीएफ तंत्र में एक विशिष्ट वॉन फ्रे वाई-फाई माप कार्यक्रम है जो केवल एक व्यक्ति को उपकरण को पूरी तरह से संचालित करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह विधि साधारण फिलामेंट वॉन फ्रे उपकरण की तुलना में तेज़ है और 8,19 प्रदर्शन करना आसान है।
हालांकि, थकान एक जटिलता हो सकती है, क्योंकि एक ही शोधकर्ता को सभी जानवरों की रीडिंग करनी चाहिए और कुछ समय 8 के बाद दोहराव की गति के कारण थकावट विकसित हो सकतीहै। टी इवांसी द्वारा संक्रमित चूहों के लिए जीवित रहने की उम्मीद को ध्यान में रखते हुए, प्रयोगात्मक डिजाइन में समूहों की एक उच्च संख्या को प्रोत्साहित नहीं किया जाता है। हमारे अनुभव में, एक समय में 10 चूहों की एक औसत (प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर) कम से कम 30 मिनट में मापा जा सकता है. इसके अलावा, केवल एक लक्ष्य ऊतक हर प्रयोग में प्रत्येक माउस के लिए चुना जाना चाहिए ताकि जानवरों की जांच करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा रहा है, के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में बताया गया है, जो भी अन्वेषक द्वारा थकान के विकास की संभावना कम हो जाती है.
इसके अलावा, ईवीएफ (दाएं हिंद पंजा और आंत माप) और माउस ग्रिमेस स्केल आकलन दोनों को अच्छी तरह से प्रशिक्षित शोधकर्ताओं की आवश्यकता होती है। प्रयोगों प्रदर्शन करने से पहले, अन्वेषक अभ्यास लंबी अवधि खर्च करना चाहिए. सही ढंग से चूहों में चेहरे की अभिव्यक्ति परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए, शोधकर्ता न केवल अपेक्षित परिवर्तन लेकिन यह भी एक साधारण माउस की सामान्य चेहरे की अभिव्यक्ति और सामान्यता और व्यवहार10,20 के अपने रूपांतरों पता होना चाहिए. इसके अलावा, सही ढंग से EvF तंत्र का उपयोग कर चूहों के यांत्रिक दहलीज का मूल्यांकन करने के लिए, शोधकर्ता कई आधारभूत माप दोहराना चाहिए जब तक जांच उत्तेजनाओं के लिए माउस प्रतिक्रिया आसानी से मान्यता प्राप्त है और स्थिरता 2,8 हासिल की है.
प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों में टी इवांसी द्वारा संक्रमित चूहों पर एलोडोनिया और दर्द, साथ ही इसके उपचार का मूल्यांकन शामिल है। वर्तमान मॉडल वैज्ञानिक जांचकर्ताओं को प्रयोगशाला में नियंत्रित वातावरण के तहत चूहों में आमतौर पर पशुधन में पाए जाने वाले रोग के दर्द से संबंधित रोगजनन का मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखक वित्तीय सहायता के लिए सांता कैटरीना स्टेट यूनिवर्सिटी को विशेष धन्यवाद देते हैं, जानवरों और अंतरिक्ष के लिए फार्माकोलॉजी प्रयोगशाला के लिए, और इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले टी इवांसी से संक्रमित क्रायोप्रेज़र्व्ड रक्त के नमूने के लिए हेमोपारासाइट्स और वैक्टर बायोकैमिस्ट्री प्रयोगशाला के लिए।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 G 1/2" needle coupled to insulin syringe | TKL | 80288090100 | Used to infund solutions on laboratory animals |
| Accessories for von Frey analgesimeter | INSIGHT | EFF 303 | Containment box with support for digital analgesimeter assessment |
| D-(+)-Glucose | SIGMA-ALDRICH | G7021 | A monosaccharide which is the main source of energy in the form of ATP for living organisms |
| Digital analgesimeter | INSIGHT | von Frey Wi-Fi | The von Frey Wi-Fi is a portable device used to assess tissue sensitivity to mechanical stimuli |
| Gilson type 10 µL polypropylene tip | CRALPLAST | 18261 | Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for hind paw allodynia assessment |
| Laboratory water bath | BEING INSTRUMENT | BW-22P | Used to heat liquid and semi-solid substances contained in appropriate recipients to specific temperature |
| Phosphate buffered saline | SIGMA-ALDRICH | 806552 | A balanced salt solution buffer used for a variety of cell culture applications |
| Swiss mice (Mus musculus) from both gender | UFSC | Swiss Webster | Laboratory animals used for controlled experiments |
| Trypanosoma evansi cryiopreserved sample | UDESC | - | Sample used to infect all mice, ceded by the Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory |
| Universal type 10 µL polypropylene tip | CRALPLAST | 18171 | Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for visceral allodynia assessment |
References
- Desquesnes, M., et al. Trypanosoma evansi and surra: a review and perspectives on origin, history, distribution, taxonomy, morphology, hosts, and pathogenic effects. BioMed Research International. 2013, 194176 (2013).
- Cipriani, D. S., et al. Experimental Trypanosoma evansi infection induces pain along with oxidative stress, prevented by COX-2 inhibition. Experimental Parasitology. 247, 108477 (2023).
- Paim, F. C., et al. Cytokines in rats experimentally infected with Trypanosoma evansi. Experimental Parasitology. 128 (4), 365-370 (2011).
- Gillingwater, K., et al. In vivo investigations of selected diamidine compounds against Trypanosoma evansi using a mouse model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 5074-5079 (2009).
- Dkhil, M. A., et al. Treatment of Trypanosoma evansi-infected mice with Eucalyptus camaldulensis led to a change in brain response and spleen immunomodulation. Frontiers in Microbiology. 13, 833520 (2022).
- Dkhil, M. A., et al. Murine liver response to Allium sativum treatment during infection induced-trypanosomiasis. Saudi Journal of Biological Sciences. 28 (6), 3270-3274 (2021).
- Martins de Moraes, C., et al. Infection by Trypanosoma evansi in horses from Brazil. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias. 102 (561-562), 159-163 (2007).
- Martinov, T., et al. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of Visualized Experiments. 82, e51212 (2013).
- Rodríguez-Angulo, H., et al. Role of TNF in sickness behavior and allodynia during the acute phase of Chagas' disease. Experimental Parasitology. 134 (4), 422-429 (2013).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7, 447-449 (2010).
- Eijkelkamp, N., et al. Increased visceral sensitivity to capsaicin after DSS-induced colitis in mice: spinal cord c-Fos expression and behavior. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (4), 749-757 (2007).
- Mekata, H., et al. Expression of regulatory dendritic cell-related cytokines in cattle experimentally infected with Trypanosoma evansi. Journal of Veterinary Medical Science. 77 (8), 1017-1019 (2015).
- Mukaka, M. M. Statistics corner: a guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Schober, P., et al. Correlation coefficients: appropriate use and interpretation. Anesthesia and Analgesia. 126 (5), 1763-1768 (2018).
- Kamidi, C. M., et al. Differential virulence of camel Trypanosoma evansi isolates in mice. Parasitology. 145 (9), 1235-1242 (2018).
- Mekata, H., et al. Isolation, cloning, and pathologic analysis of Trypanosoma evansi field isolates. Parasitology Research. 112, 1513-1521 (2013).
- Silva, A. S., et al. Trypanosoma evansi pathogenicity strain in rats inoculated with parasite in fresh and cryopreserved blood. Ciência Rural. 39 (6), 1842-1846 (2009).
- Silva, A. S., et al. Acetylcholinesterase activity and lipid peroxidation in the brain and spinal cord of rats infected with Trypanosoma evansi. Veterinary Parasitology. 175, 237-244 (2011).
- Diógenes, A. K. L., et al. Concurrent validity of electronic von Frey as an assessment tool for burn associated pain. Burns. 46 (6), 1328-1336 (2020).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17, 45-59 (2016).
