Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a nocicepção em camundongos infectados com Trypanosoma evansi, utilizando o aparelho eletrônico de von Frey como ferramenta, medindo limiares mecânicos da pata traseira e vísceras.
Abstract
A patogênese das doenças infecciosas ainda é um campo complexo de estudar. O curso de vários sinais clínicos, como alodinia e dor, pode ser observado em animais domésticos. No entanto, o conhecimento de suas vias e o tratamento correto necessitam de experimentos controlados, muitos deles utilizando animais de laboratório. A medição de alterações nos limiares mecânicos da pata traseira e das vísceras é uma técnica útil para observar mudanças na percepção da dor em roedores. A resposta de abstinência pode ser medida primeiro em testes de linha de base, o que cria um melhor controle dos grupos experimentais. Testes subsequentes podem ser realizados após a indução da infecção e adição de medicamentos ao protocolo. O uso de um aparelho eletrônico de von Frey associado ao uso de uma escala facial para observar alterações semelhantes à dor permite uma avaliação simples, precisa e consistente para avaliar a alodinia e a dor em camundongos. Assim, experimentos utilizando a presente metodologia para infecção por Trypanosoma evansi representam um método útil para avaliar alodinia e dor em animais infectados em laboratório, que pode ser aplicado ao tratamento convencional para animais de criação.
Introduction
O Trypanosoma evansi é o agente etiológico da doença denominada "surra" ou "mal-das-cadeiras" na América do Sul 1,2. Comumente acomete equinos e bovinos, mas também a fauna silvestre, sendo transmitida por morcegos hematófagos, tabanídeos e picadas de moscas estomoxas 1,3. A surra é uma doença importante em animais domésticos, que pode ser fatal na ausência do tratamento correto, exibindo sinais clínicos inespecíficos, como anemia, perda de apetite e peso, fraqueza muscular e aborto, que podem variar de acordo com o hospedeiro e a região geográfica 2,4,5,6.
A expressão de alodinia e dor em animais infectados durante o curso da doença ainda é um tópico novo 2,7. O desejo de entender a patogênese por trás desses sinais é um passo importante para melhorar e refinar o tratamento atualmente utilizado, adicionando drogas analgésicas eficazes ao protocolo tripanocidaclássico 5,6. Nesse cenário, a possibilidade de replicar a doença usando um modelo murino representa uma vantagem, pois os camundongos podem ser facilmente mantidos em ambientes controlados em laboratório e, portanto, produzir resultados mais consistentes do que experimentos de campo usando gado.
Um limiar mecânico é comumente obtido usando um aparelho eletrônico de von Frey (EvF) para a avaliação da alodinia em um grande número de experimentos 2,8,9. Este dispositivo é usado para avaliar a sensibilidade do tecido à estimulação mecânica: uma vez que o aparelho toca a pata do animal, através de uma ponta de 20-200 μL acoplada ao dispositivo, a força com que o animal retira a pata é registrada.
Os roedores são geralmente usados como animais padrão nesses experimentos, e a maioria dos resultados é extrapolada para outras espécies, já que a maioria das doenças pesquisadas vem de outras espécies nas quais seria difícil realizar um estudo controlado. Além disso, alodinia e dor estão intimamente relacionadas. O uso de uma escala facial específica para avaliar a dor em camundongos infectados desempenha um papel importante como adjuvante confirmador para afirmar a presença de dor durante o curso da infecção por T. evansi 2,10.
Neste protocolo, demonstramos um novo modelo para avaliar alodinia e dor em camundongos experimentalmente infectados com T. evansi, mostrando uma alta correlação entre as variáveis, mostrando-se assim um modelo forte. Além disso, requer um pequeno número de pesquisadores para realizar todo o procedimento, diminuindo a chance de interferência humana durante o experimento. Também permite ao investigador replicar a doença-alvo durante um curso agudo e adicionar vários medicamentos de tratamento diferentes no desenho experimental, obtendo assim resultados consistentes em um curto período.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados com camundongos Swiss fêmeas adultas de 10 semanas de idade (35-55 g). Os animais foram alojados em gaiolas de polissulfona (3-5 animais por gaiola) em uma sala com temperatura controlada (21 ± 1 °C), ciclo de 12 h de luz/12 h de escuridão e ração de laboratório padrão e água ad libitum. Dez animais foram designados para cada grupo em cada teste para demonstrar os efeitos consistentes dos tratamentos medicamentosos. O delineamento experimental foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade do Estado de Santa Catarina (CEUA) (número do protocolo: 6019201123). Todos os experimentos com animais obedeceram às diretrizes ARRIVE (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) e foram realizados de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Preparação e inoculação de Trypanosoma evansi
CUIDADO: Use jaleco descartável, luvas, máscara e proteção para os olhos ao manusear amostras de sangue infectadas, reagentes e outros compostos químicos.
- Ligue o equipamento de banho-maria e ajuste-o a uma temperatura constante de 37 °C.
- Retirar do ultracongelador um tubo de microcentrífuga contendo a amostra de sangue conservada. Coloque-o no banho-maria até o sangue descongelar.
NOTA: O mesmo isolado deve ser usado para infectar todos os camundongos em todos os grupos de experimentos diferentes para manter um número igual de passagens de sangue. - Use solução salina tamponada com fosfato (PBS, 0,1 M) contendo 60% de D-(+)-glicose (pH 7,4) para realizar diluição seriada (10:1 v v) até que 1 × 104 tripanossomas por 0,1 mL sejam alcançados. Determine o número de células parasitas por contagem manual de células usando uma câmara de Neubauer em um microscópio com uma lente objetiva de 100x2.
- Inocular 0,1 mL da solução sanguínea diluída (grupo infectado), ou o mesmo volume em veículo salino a 0,9% (grupo controle), por via intraperitoneal, utilizando uma agulha de 26 G 1/2" acoplada a uma seringa de insulina.
2. Configuração e operação do aparelho eletrônico de von Frey
NOTA: Tenha cuidado com a forma como os dados obtidos são registrados. Alguns equipamentos EvF possuem programas específicos para transferir os dados obtidos do aparelho para outros dispositivos eletrônicos, como computadores, tablets ou smartphones.
- Ligue o aparelho EvF. Certifique-se de que o equipamento esteja bem carregado antes de iniciar o experimento, observando o nível da bateria exibido na tela do equipamento e carregando-o se necessário.
- Conecte o aparelho EvF ao dispositivo eletrônico escolhido via Wi-Fi para transferir e salvar os dados obtidos.
- Insira uma ponta de polipropileno de 10 μL no cone do aparelho EvF e ajuste a leitura para zero (0.00 g) pressionando o botão com o símbolo da pata.
- Observe que, uma vez que o tecido avaliado é sondado; a pressão máxima aplicada é mostrada no visor do aparelho EvF. Depois disso, transfira-o para o dispositivo eletrônico escolhido pressionando o botão com um símbolo de antena para gravação segura.
- Redefina a leitura para zero e prepare-se para fazer uma nova medição simplesmente pressionando o botão com o símbolo da pata novamente.
3. Considerações gerais para a avaliação dos limiares mecânicos
- Realize todos os experimentos em uma sala silenciosa com temperatura controlada a 21 ° C e um ciclo de 12 h de luz / 12 h de escuridão, e certifique-se de respeitar o ciclo circadiano do camundongo realizando todas as avaliações ao mesmo tempo do dia2.
- Peça à mesma pessoa que realize avaliações de limiar mecânico experimental e de linha de base para reduzir o viés e garantir a consistência da medição; Certifique-se de que os experimentos sejam cegos.
- Coloque cada camundongo suavemente dentro de uma câmara individual feita de polimetilmetacrilato (PMMA) com um topo perfurado colocado em um suporte de piso de malha de 5 mm² 2,8.
- Permita que os camundongos se aclimatem por 30 minutos nas câmaras de PMMA antes de avaliar os limiares mecânicos basais e experimentais2.
- Coloque o suporte de piso de malha a uma altura confortável (sobre uma superfície estável) para que os animais sejam acessíveis por todos os lados. Certifique-se de que o abdômen e todas as quatro patas dos ratos sejam facilmente acessíveis através das aberturas do piso de malha.
- Cubra a superfície estável usada para alocar as câmaras com material absorvente para absorver ou coletar micção e defecação. Certifique-se de que os braços do investigador possam se mover livremente abaixo das câmaras enquanto opera o aparelho EvF.
4. Avaliação do limiar mecânico basal e resposta do camundongo a estímulos
- Para medições do abdômen, divida o abdômen em três partes virtuais (áreas craniana, média e caudal). Escolha a área craniana (anatomicamente contendo o fígado) como o tecido-alvo padrão para avaliação do limiar mecânico da alodinia visceral. Para medições de patas, escolha a pata traseira direita para padronização.
- Faça uma medição inicial de cada camundongo 48 h antes da infecção. Para fazer isso, coloque os camundongos nas câmaras de contenção, prepare o aparelho EvF e use as duas mãos para levantar a sonda lentamente para estimular o tecido alvo.
- Aumente gradualmente a pressão no tecido até que o camundongo expresse um comportamento nociceptivo. Para avaliação da pata traseira direita, procure retração da pata, lambida da pata ou salto de quatro patas 2,8,9. Para avaliação visceral, procure uma retração acentuada do abdome, lambedura ou coçadura imediata do local sondado ou salto com quatro patas 2,11.
- Salve o valor obtido transferindo os dados para o dispositivo eletrônico escolhido contendo o programa EvF específico ou escrevendo-o em um livro de notas. Redefina o display para zero e repita o processo quatro vezes para obter cinco medições8.
NOTA: Considere apenas três medições semelhantes para estimar o valor médio2 - Medir o limiar mecânico do ratinho presente na câmara adjacente até que cada ratinho seja sondado cinco vezes e se obtenha um valor médio para cada animal.
- Repetir as medições basais 24 h mais tarde e excluir os ratinhos com valores médios inferiores a 3,00 g ou com diferenças entre as medições basais superiores a 2,00 g 2,8.
NOTA: Apenas um tecido-alvo deve ser escolhido para cada camundongo em cada experimento para que os animais não se acostumem a serem sondados, pois o número de avaliações seria consideravelmente maior em um curto período.
5. Avaliação experimental do limiar mecânico da pata traseira direita e da alodinia visceral
- Avalie o limiar mecânico da pata traseira direita ou da alodinia visceral 1 h após a infecção para avaliação do dia 0.
- Repita o procedimento a cada 24 h durante 5 dias após a infecção.
NOTA: se houver um tratamento a ser administrado, escolha um ponto de tempo apropriado dentro do desenho experimental. - Retorne os camundongos às suas gaiolas originais para evitar que os animais lutem entre si, com acesso a ração de laboratório padrão e água ad libitum após a conclusão das medições.
- Realizar um teste de normalidade para verificar a distribuição normal dos dados e posterior análise estatística apropriada dos dados coletados.
6. Avaliação da escala de caretas do rato
- Certifique-se de que cada camundongo seja visto facilmente enquanto estiver dentro da câmara de contenção e examine cada camundongo antes do experimento para garantir que não haja lesões nos membros, abdômen ou rosto e nenhuma alteração na pelagem.
- Observe a área orbital do mouse. Classifique os olhos abertos como ausência de dor (pontuação 0), enquanto uma dor óbvia pode ser representada quando o mouse fecha os olhos (pontuação 2).
- Observe o nariz do rato. Classifique um nariz normal como a ausência de dor, enquanto a presença de uma protuberância na ponte do nariz representa dor óbvia.
- Observe as bochechas do rato. Classifique as bochechas normais como a ausência de dor, enquanto a presença de uma protuberância em ambas as bochechas representa dor óbvia.
- Observe a posição das orelhas do mouse. Classifique as orelhas arredondadas como a ausência de dor, enquanto as orelhas girando para fora ou para trás, longe do rosto, em forma pontiaguda, representam dor óbvia. O espaço entre as orelhas aumenta com o escore de dor.
- Observe os bigodes do rato. Classifique os bigodes com sua curva descendente natural como ausência de dor, enquanto os bigodes que são puxados para trás contra a bochecha ou puxados para frente representam dor óbvia.
- Como comportamentos inatos, como a autolimpeza, podem interferir na expressão facial, não considere esses comportamentos relacionados à dor8. Aguarde até que o mouse pare esse comportamento antes de cada avaliação da unidade de ação.
- Realizar um teste de normalidade para verificar a distribuição normal dos dados e posterior análise estatística apropriada dos dados coletados.
NOTA: Ao final de todos os experimentos, os camundongos foram sacrificados humanamente usando cetamina (90 mg/kg) e xilazina (7,5 mg/kg), injetadas por via intraperitoneal. Após atingirem um plano anestésico profundo confirmado, foram submetidos à luxação cervical.
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Representative Results
Diminuição do limiar mecânico devido à infecção por T. evansi avaliada pelo aparelho eletrônico de von Frey tanto na pata traseira direita quanto nos tecidos viscerais
O experimento foi conduzido ao longo de 5 dias, de acordo com dados prévios relacionados à amostra disponível de T. evansi 2. Os camundongos infectados começaram a mostrar uma diferença significativa no limiar mecânico na pata traseira direita no dia 3 após a infecção e permaneceram significativamente mais baixos do que o grupo controle durante os próximos 2 dias após a infecção (Figura 1A) em comparação com os camundongos não infectados. Resultados semelhantes para sensibilidade tátil abdominal mostraram alodinia visceral em camundongos infectados começando no dia 3 após a infecção e permanecendo significativamente mais baixos do que o grupo controle durante os próximos 2 dias após a infecção (Figura 1B).
Figura 1: Avaliação da alodinia de camundongos experimentalmente infectados por Trypanosoma evansi. (A) Alodinia da pata traseira direita e (B) alodinia visceral. Dados expressos como a média ± DP de dez animais para cada grupo experimental. Análise estatística: Teste t de Student, uma análise não pareada por momento. Os asteriscos apresentam diferenças significativas entre os grupos experimentais considerando o mesmo momento analisado (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Indução de características faciais relacionadas à dor em camundongos por infecção por T. evansi e interpretação numérica pela avaliação da dor da Escala de Caretas de Camundongos
Os camundongos infectados começaram a manifestar sinais significativos de características faciais relacionadas à dor no dia 3 após a infecção, mostrando uma pontuação média de 0,4 [0-1] no referido momento. A mesma tendência foi observada durante o experimento, no qual o grupo infectado apresentou diferenças significativas quando comparado ao grupo controle, apresentando escores médios de 0,6 [0-1] e 1,3 [0-2] para os dias 4 e 5 pós-infecção, respectivamente. O grupo controle não pontuou na Escala de Carecas de Ratos, como esperado. A análise estatística foi realizada por meio do teste t de Student, uma análise não pareada por momento, considerando como significativo um valor de p < 0,05. Além disso, o coeficiente de correlação de Pearson (r) identificou padrões de interação entre a avaliação da dor da Escala de Caretas de Camundongos e a alodinia da pata traseira direita ou entre a mesma escala e a alodinia visceral, cujos valores foram de -96,35% e -84,08%, respectivamente. Além disso, os coeficientes de determinação (R2) para a avaliação da dor da Escala de Caretas de Camundongo e alodinia da pata traseira direita ou alodinia visceral foram de 0,9283 e 0,7070, respectivamente.
O presente estudo concorda com dados anteriores, que confirmaram a presença de inflamação e dor ao longo do curso da infecção por T. evansi 2,3,7,12. Além disso, o método descrito fornece uma metodologia precisa para identificar e medir alodinia e dor em camundongos. Além disso, o uso da avaliação da dor da Escala de Caretas de Camundongo em camundongos infectados indicou um r negativo muito alto (90 a 100%) quando comparado aos resultados expressos pela avaliação da alodinia da pata traseira direita e um r negativo alto (70 a 89%) para a avaliação da alodinia visceral dos respectivos animais13. Da mesma forma, o uso da avaliação da dor da Escala de Caretas de Camundongo em camundongos infectados indicou um R2 muito forte (0,90 a 1,00) quando comparado aos resultados expressos pela avaliação da alodinia da pata traseira direita e um forte R2 (0,70 a 0,89) para a avaliação da alodinia visceral dos mesmos animais14.
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Discussion
Uma etapa crítica em experimentos envolvendo animais infectados é o controle dos níveis de parasitemia. Diferentes cepas de T. evansi podem se comportar de maneiras divergentes em camundongos, levando de infecções agudas a crônicas 2,4,5,6. Além disso, alterações na dose de infecção podem diminuir ou prolongar o tempo de sobrevivência dos camundongos. Portanto, a obtenção de uma curva de sobrevida antes dos experimentos é recomendada para determinar o período correto do experimento e evitar frustração com eventos inesperados de morte de camundongos15,16. Além disso, esses dados podem determinar desfechos humanos para o experimento, se aplicável.
Além disso, o mesmo isolado deve ser usado para infectar todos os camundongos no experimento para respeitar um número igual de passagens de sangue, conforme explicado na seção de protocolo. Da mesma forma, sangue criopreservado ou fresco infectado pode ser usado para infectar os camundongos, pois algumas amostras criopreservadas podem ser inativadas após o descongelamento em banho-maria. No entanto, o sangue fresco infectado pode produzir parasitemia mais rápida e, portanto, eventos de morte mais precoces17,18.
Modificações no experimento, como a adição de drogas tripanocidas ou analgésicas, são viáveis. Novos grupos significam mais animais e é importante lembrar que mesmo os grupos controle para os medicamentos escolhidos devem ser submetidos a medidas basais. Em nossa experiência, aproximadamente 20-25% dos camundongos são excluídos do experimento após a segunda medição inicial, o que é consistente com dados anteriores8. Isso significa que o número inicial de animais deve ser maior do que o número experimental de animais, o que pode ser um problema quando mais grupos são avaliados e, consequentemente, um número maior de camundongos é estimado.
A farmacocinética e a farmacodinâmica devem ser levadas em consideração para este modelo. Alguns fármacos levam longos períodos para exercer sua ação farmacológica, o que pode impactar o desenho experimental de um modelo em que os camundongos geralmente morrem em média de 4 a 5 dias 2,6. Além disso, se os animais estiverem em jejum para o tratamento escolhido, o período de aclimatação pode ser um fator importante a ser considerado, pois afetará tanto a dinâmica do medicamento quanto o cronograma e procedimento experimental, conforme relatado na seção de protocolo.
Uma grande melhoria no presente método é que um único pesquisador bem treinado pode realizar todo o procedimento de leitura de EvF (medições basais e experimentais) enquanto permanece cego para a infecção ou tratamentos. Outro investigador deve realizar a infecção no início do experimento. Isso não é necessário após o procedimento de infecção, pois o aparelho EvF possui um programa específico de medição de Wi-Fi de von Frey que permite que apenas uma pessoa opere totalmente o equipamento. Além disso, esse método é mais rápido que o equipamento comum de Filament von Frey e mais fácil de executar 8,19.
No entanto, a fadiga pode ser uma complicação, pois o mesmo pesquisador deve realizar todas as leituras dos animais e pode desenvolver exaustão devido ao movimento repetitivo após algum tempo8. Levando em consideração a expectativa de sobrevivência para camundongos infectados por T. evansi, um número elevado de grupos no desenho experimental não é encorajado. Em nossa experiência, uma média de 10 camundongos por vez (dependendo do desenho experimental) pode ser medida em menos de 30 min. Além disso, apenas um tecido-alvo deve ser escolhido para cada camundongo em cada experimento, para que os animais não se acostumem a serem sondados, conforme explicado na seção de protocolo, o que também diminui a chance de desenvolvimento de fadiga pelo investigador.
Além disso, as avaliações EvF (pata traseira direita e medidas viscerais) e da Escala de Carecas de Camundongos precisam de pesquisadores bem treinados. Antes de realizar os experimentos, o investigador deve passar longos períodos praticando. Para avaliar corretamente as alterações da expressão facial em camundongos, o pesquisador deve conhecer não apenas as alterações esperadas, mas também a expressão facial normal de um camundongo comum e suas variações de normalidade e comportamentos10,20. Além disso, para avaliar corretamente o limiar mecânico de camundongos usando o aparelho EvF, o pesquisador deve repetir várias medições basais até que a resposta do camundongo aos estímulos da sonda seja facilmente reconhecida e a consistência seja alcançada 2,8.
Aplicações futuras do protocolo envolvem a avaliação de alodinia e dor, bem como seu tratamento, em camundongos infectados por T. evansi. O presente modelo permite que os investigadores científicos avaliem a patogênese relacionada à dor de uma doença comumente encontrada em gado, em camundongos sob um ambiente controlado em laboratório.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Os autores agradecem especialmente à Universidade do Estado de Santa Catarina pelo apoio financeiro, ao Laboratório de Farmacologia pelos animais e pelo espaço, e ao Laboratório de Bioquímica de Hemoparasitas e Vetores pela amostra de sangue criopreservado infectado com T. evansi utilizada nesses experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 G 1/2" needle coupled to insulin syringe | TKL | 80288090100 | Used to infund solutions on laboratory animals |
| Accessories for von Frey analgesimeter | INSIGHT | EFF 303 | Containment box with support for digital analgesimeter assessment |
| D-(+)-Glucose | SIGMA-ALDRICH | G7021 | A monosaccharide which is the main source of energy in the form of ATP for living organisms |
| Digital analgesimeter | INSIGHT | von Frey Wi-Fi | The von Frey Wi-Fi is a portable device used to assess tissue sensitivity to mechanical stimuli |
| Gilson type 10 µL polypropylene tip | CRALPLAST | 18261 | Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for hind paw allodynia assessment |
| Laboratory water bath | BEING INSTRUMENT | BW-22P | Used to heat liquid and semi-solid substances contained in appropriate recipients to specific temperature |
| Phosphate buffered saline | SIGMA-ALDRICH | 806552 | A balanced salt solution buffer used for a variety of cell culture applications |
| Swiss mice (Mus musculus) from both gender | UFSC | Swiss Webster | Laboratory animals used for controlled experiments |
| Trypanosoma evansi cryiopreserved sample | UDESC | - | Sample used to infect all mice, ceded by the Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory |
| Universal type 10 µL polypropylene tip | CRALPLAST | 18171 | Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for visceral allodynia assessment |
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