Losse maïsomhulsels voor levende beeldvorming van infectie door schimmelpathogenen van bladmaïs
Summary
Dit manuscript beschrijft een geoptimaliseerd inoculatieprotocol dat gebruik maakt van losse maïsbladomhulsels voor reproduceerbare cytologische, fysiologische en moleculaire studies van maïsinteracties met schimmelpathogenen van planten. De bladomhulsels vergemakkelijken real-time observatie van cellulaire interacties tussen de levende plant en de schimmel in niet-gefixeerde weefsels.
Abstract
We hebben een protocol geoptimaliseerd om maïsbladscheden te inoculeren met hemibiotrofe en necrotrofe bladpathogene schimmels. De methode is aangepast ten opzichte van een methode die oorspronkelijk werd toegepast op rijstbladomhulsels en maakt directe microscopische observatie van schimmelgroei en -ontwikkeling in levende plantencellen mogelijk. Bladomhulsels die worden verzameld uit maïszaailingen met twee volledig uitgekomen bladkragen worden geënt met druppels van 20 μl van 5 x 105 sporen/ml schimmelsporensuspensies en geïncubeerd in vochtigheidskamers bij 23 °C onder continu fluorescerend licht. Na 24-72 uur wordt overtollig weefsel verwijderd met een scheermesje om een enkele laag epidermale cellen achter te laten, een optisch helder monster dat direct kan worden afgebeeld zonder de noodzaak van chemische fixatie of opruiming. Planten- en schimmelcellen blijven in leven voor de duur van het experiment en interacties kunnen in realtime worden gevisualiseerd. Omhulsels kunnen worden gekleurd of onderworpen aan plasmolyse om de ontwikkelingscytologie en levensvatbaarheid van gastheer- en pathogene cellen tijdens infectie en kolonisatie te bestuderen. Schimmelstammen die zijn getransformeerd om fluorescerende eiwitten tot expressie te brengen, kunnen op de omhulsels worden geënt of gecoöculeerd voor een betere resolutie en om de evaluatie van competitieve of synergetische interacties te vergemakkelijken. Schimmelstammen die fluorescerende fusie-eiwitten tot expressie brengen, kunnen worden gebruikt om de productie en targeting van deze individuele eiwitten in planta te volgen en te kwantificeren. Geënte schedeweefsels kunnen worden geëxtraheerd om nucleïnezuren, eiwitten of metabolieten te karakteriseren. Het gebruik van deze schedetesten heeft de gedetailleerde studies van de mechanismen van schimmelpathogeniteit in maïs en ook van schimmeleiwiteffectoren en secundaire metabolieten die bijdragen aan pathogeniteit aanzienlijk verbeterd.
Introduction
Ruimtelijke en temporele analyses op cellulair niveau zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de fysiologie en cytologie van schimmel-plantinteracties. Bladweefsels die chemisch zijn gefixeerd 1,2,3 of zijn opgeruimd en gekleurd4, evenals kunstmatige membranen 5, zijn in het verleden gebruikt om de cytologie van de ontwikkeling van bladpathogenen en plant-schimmelinteracties te onderzoeken. Onderzoek naar infectiegebeurtenissen in levende gastheerweefsels in real-time zonder fixatie of opruiming is echter een uitdaging vanwege technische problemen met betrekking tot de voorbereiding van optisch transparante monsters voor beeldvorming.
Aan het eind van de jaren 1940 werd een losstaand inoculatieprotocol voor bladschede ontwikkeld voor microscopisch onderzoek naar de resistentie van levende epidermale rijstcellen tegen de rijstblastschimmel Magnaporthe oryza6. Meer recentelijk zijn gedetailleerde moleculaire, fysiologische en cytologische waarnemingen van gastheerkolonisatie door Colletotrichum– en Magnaporte-soorten aanzienlijk vergemakkelijkt door gemodificeerde versies van deze bladschedemethode te combineren met schimmeltransformaties die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, en hoogwaardige beeldvormingsprotocollen voor levende cellen, waaronder epifluorescentie en confocale microscopie 7,8,9,10,11,12,13.
Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerd inoculatieprotocol met behulp van losse maïsbladomhulsels voor observatie van infectieprocessen door hemibiotrofe en necrotrofe bladschimmelpathogenen. We hebben het specifiek gebruikt om Colletotrichum graminicola (C. graminicola) te bestuderen, de veroorzaker van anthracnose-bladziekte en stengelrot, en Stenocarpella maydis, die Diplodia-bladziekte en stengelrot veroorzaakt. De methode moet echter wel toepasbaar zijn op andere hemibiotrofe en necrotrofe bladschimmelpathogenen. Cytologische en fysiologische reacties tijdens infectie en kolonisatie in deze uitgesneden bladscheden zijn vergelijkbaar met die in hele bladbladen12,14,15. Bovendien is hemibiotrofe kolonisatie van schede-epidermale cellen door C. graminicola vergelijkbaar met kolonisatie van stengelmerg16,17. Losse omhulsels vertonen een grotere synchroniciteit en experimentele reproduceerbaarheid van schimmelpenetratie en kolonisatie dan bladbladen of stengelmerg weefsels14,16,17,18. De meeste maïsrassen kunnen voor dit protocol worden gebruikt. Inteelt of hybriden met overmatige paarse pigmenten in de omhulsels zijn echter minder geschikt omdat de pigmenten de beeldvorming verstoren. Golden Jubilee-suikermaïs is bijzonder nuttig geweest voor onze studies omdat onbehandelde zaden in de handel verkrijgbaar zijn, de planten zeer vatbaar zijn voor veel bladziekten en ze goed groeien in de kas. De eerste epidemieën van anthracnosestengelrot in de Verenigde Staten resulteerden in het totale verlies van suikermaïsoogsten in Indiana in de jaren1970 19,20. Deze inoculatiemethode voor bladschede kan worden toegepast om schimmelgroei en -ontwikkeling in levende versus lokaal gedode plantencellen direct te observeren en te kwantificeren, om resistentiereacties aan te tonen in compatibele/onverenigbare reacties op schimmelinfecties, en om interacties tussen schimmelstammen op dezelfde schede in realtime te testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De geoptimaliseerde inoculatiemethode voor bladschede die hier wordt beschreven, is aangepast van een origineel protocol dat is ontwikkeld voor en is toegepast op rijstbladomhulsels 6,8,36. Het maakt directe, gedetailleerde observaties mogelijk van schimmelgroei en -ontwikkeling in levende plantencellen met breedveld- of confocale microscopie. Het protocol is geschikt voor karakterisering, vergelijking en kwantificering van een …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken USDA-NIFA voor hun financiële steun (subsidienummers 2018-67013-28489 en 2020-70410-32901). Alle meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen in dit manuscript zijn uitsluitend die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van het Amerikaanse ministerie van landbouw. We danken Science Without Borders-gaststudent uit Brazilië, Mayara de Silva, voor de beelden die in figuur 6A en in figuur 7D te zien zijn. We erkennen ook de afdeling Plantenpathologie van de Universiteit van Kentucky voor het verlenen van toegang tot de confocale microscopen van Olympus.
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
Riferimenti
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O’Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O’Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. . Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O’Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O’Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
