נדן תירס מנותק להדמיית תאים חיים של זיהום על ידי פתוגנים פטרייתיים של תירס פוליארי
Summary
כתב יד זה מפרט פרוטוקול חיסון אופטימלי המשתמש בנדן עלי תירס מנותק למחקרים ציטולוגיים, פיזיולוגיים ומולקולריים הניתנים לשחזור של אינטראקציות תירס עם פתוגנים צמחיים פטרייתיים. מעטה העלים מאפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות בין הצמח החי לפטרייה ברקמות לא מקובעות.
Abstract
ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול לחיסון נדן עלי תירס עם פטריות פתוגניות המיביוטרופיות ונקרוטרופיות. השיטה שונה משיטה שיושמה במקור על נדן עלי אורז ומאפשרת תצפית מיקרוסקופית ישירה על גדילה והתפתחות פטרייתיות בתאי צמחים חיים. נדני עלים שנאספו משתילי תירס עם שני צווארוני עלים מלאים מחוסנים בטיפות של 20 μL של 5 x 105 נבגים/מ”ל תרחיפים של נבגים פטרייתיים ומודגרים בתאי לחות ב -23 מעלות צלזיוס תחת אור פלואורסצנטי רציף. לאחר 24-72 שעות, רקמה עודפת מוסרת עם סכין גילוח כדי להשאיר שכבה אחת של תאי אפידרמיס, דגימה שקופה אופטית שניתן לצלם ישירות ללא צורך בקיבוע כימי או ניקוי. תאי צמחים ופטריות נשארים בחיים למשך הניסוי וניתן לדמיין אינטראקציות בזמן אמת. נדן יכול להיות מוכתם או נתון פלסמוליזה כדי לחקור את הציטולוגיה ההתפתחותית ואת הכדאיות של תאים מארח פתוגן במהלך זיהום וקולוניזציה. זנים פטרייתיים שעברו טרנספורמציה כדי לבטא חלבונים פלואורסצנטיים יכולים להיות מחוסנים או מחוסנים במשותף על הנדן לקבלת רזולוציה מוגברת וכדי להקל על הערכת אינטראקציות תחרותיות או סינרגטיות. זנים פטרייתיים המבטאים חלבוני היתוך פלואורסצנטיים יכולים לשמש למעקב וכימות הייצור והמיקוד של חלבונים בודדים אלה בצמח. ניתן לחלץ רקמות מעטפת מחוסנות כדי לאפיין חומצות גרעין, חלבונים או מטבוליטים. השימוש בבדיקות נדן אלה קידם מאוד את המחקרים המפורטים של מנגנוני הפתוגנניות הפטרייתית בתירס וגם של חלבונים פטרייתיים ומטבוליטים משניים התורמים לפתוגנים.
Introduction
ניתוחים מרחביים וזמניים ברמה התאית הם קריטיים להבנת הפיזיולוגיה והציטולוגיה של אינטראקציות פטרייתיות-צמחיות. רקמות פוליאריות שקובעו כימית 1,2,3 או נוקו ומוכתמות4, כמו גם קרומים מלאכותיים 5, שימשו בעבר לחקר הציטולוגיה של התפתחות פתוגן עלווה ואינטראקציות צמחיות-פטרייתיות. עם זאת, חקירת אירועי זיהום ברקמות מארחות חיות בזמן אמת ללא קיבוע או ניקוי היא מאתגרת בשל בעיות טכניות הקשורות להכנת דגימות שקופות אופטית להדמיה.
פרוטוקול חיסון נגד נדן עלים מנותק פותח בסוף שנות ה-40 של המאה ה-20 לצורך חקירה מיקרוסקופית בשדה בהיר של עמידות תאי אפידרמיס אורז חיים לפטריית פיצוץ האורז Magnaporthe oryza6. לאחרונה, תצפיות מולקולריות, פיזיולוגיות וציטולוגיות מפורטות של התיישבות פונדקאי על ידי מיני Colletotrichum ו– Magnaporthe הקלו מאוד על ידי שילוב גרסאות מותאמות של שיטת נדן עלים זו עם טרנספורמנטים פטרייתיים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים, ופרוטוקולי הדמיה של תאים חיים בעלי ביצועים גבוהים, כולל אפיפלואורסצנטיות ומיקרוסקופ קונפוקלי 7,8,9,10,11,12,13.
מאמר זה מפרט פרוטוקול חיסון אופטימלי באמצעות נדן עלי תירס מנותק לתצפית על תהליכי זיהום על ידי פתוגנים פטרייתיים המיביוטרופיים ונקרוטרופיים. השתמשנו בו במיוחד כדי לחקור Colletotrichum graminicola (C. graminicola), הגורם הסיבתי של כתם עלה anthracnose וריקבון גבעול, ו Stenocarpella maydis, אשר גורם לכתם עלה דיפלודיה וריקבון הגבעול. עם זאת, השיטה צריכה להיות ישימה לפתוגנים פטרייתיים אחרים hemibiotrophic ו necrotrophic. תגובות ציטולוגיות ופיזיולוגיות במהלך אירועי זיהום ונשאות בנדני עלים נכרתו אלה דומות לאלו שבלהבי עלים שלמים12,14,15. יתר על כן, התיישבות המיביוטרופית של תאי אפידרמיס מעטפת על ידי C. graminicola דומה להתיישבות של תאי פית גבעול16,17. נדן מנותק מראה סינכרוניות רבה יותר ושחזור ניסיוני של חדירה פטרייתית והתיישבות מאשר להבי עלים או רקמות פית גבעול14,16,17,18. רוב זני התירס יכולים לשמש לפרוטוקול זה. עם זאת, אינברדים או בני כלאיים עם פיגמנטים סגולים מוגזמים בנדן פחות מתאימים מכיוון שהפיגמנטים מפריעים להדמיה. תירס מתוק של יובל הזהב היה שימושי במיוחד במחקרים שלנו מכיוון שזרעים לא מטופלים זמינים מסחרית, הצמחים רגישים מאוד למחלות עלווה רבות, והם גדלים היטב בחממה. המגיפות הראשונות של ריקבון גבעול אנתרקנוז בארצות הברית גרמו לאובדן מוחלט של יבולי תירס מתוקים באינדיאנה בשנות השבעים19,20. ניתן ליישם שיטת חיסון זו של נדן עלים כדי לצפות ולכמת ישירות צמיחה והתפתחות פטרייתיות בתאי צמח חיים לעומת תאי צמח שהומתו באופן מקומי, כדי להדגים תגובות עמידות בתגובות תואמות/לא תואמות לזיהום פטרייתי, וכדי לבדוק אינטראקציות בין זנים פטרייתיים על אותו נדן בזמן אמת.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת החיסון האופטימלית של נדן העלים המתוארת כאן שונה מפרוטוקול מקורי שפותח ויושם על נדן עלי אורז 6,8,36. הוא מאפשר תצפיות ישירות ומפורטות על גדילה והתפתחות פטרייתיות בתאי צמח חיים באמצעות מיקרוסקופ רחב או קונפוקלי. הפרוטוקול מתאים לאפיון, ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למשרד החקלאות האמריקאי על תמיכתם הכספית (מספרי המענקים 2018-67013-28489 ו-2020-70410-32901). כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות בכתב יד זה הן אך ורק של המחברים ואינן משקפות בהכרח את השקפותיו של משרד החקלאות האמריקאי. אנו מודים לסטודנטית מברזיל המבקרת ב”מדע ללא גבולות”, מיארה דה סילבה, על התמונות שמופיעות באיור 6A ובאיור 7D. אנו מודים גם למחלקה לפתולוגיה של צמחים באוניברסיטת קנטקי על מתן גישה למיקרוסקופים קונפוקליים של אולימפוס.
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
Riferimenti
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O’Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O’Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. . Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O’Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O’Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
