キメラ低分子ノンコーディングRNAの計算解析チュートリアル:ターゲットRNAシーケンシングライブラリ
Summary
ここでは、 in vivo RNA:RNA相互作用の研究に使用されるキメラRNAシーケンシングデータを分析するためのバイオインフォマティクスパイプラインのインストールと使用を実証するプロトコルを紹介します。
Abstract
近年、マイクロRNA(miRNA)などの低分子ノンコーディングRNA(sncRNA)と標的RNAとのin vivo 遺伝子制御相互作用の理解が、キメラRNAの形成とその後のシーケンシングライブラリーを通じて、架橋とそれに続くライゲーションを使用してsncRNA:標的RNAの相互作用を捕捉する生化学的アプローチによって進められています。キメラRNAシーケンシングのデータセットは、miRNA予測ソフトウェアよりもゲノムワイドで曖昧さの少ないインプットを提供しますが、このデータを意味のある実用的な情報に抽出するには、追加の分析が必要であり、計算のバックグラウンドを持たない研究者を思いとどまらせる可能性があります。このレポートでは、エントリーレベルの計算生物学者が最新のオープンソースソフトウェアツールであるSmall Chimeric RNA Analysis Pipeline(SCRAP)をインストールして適用するためのチュートリアルを提供します。プラットフォームの要件、更新、およびパイプラインの手順と主要なユーザー入力変数の操作について説明します。生物学者がキメラRNAシーケンシングアプローチから洞察を得るための障壁を減らすことは、複数の生物学的状況における制御性sncRNAと標的RNAの相互作用の発見に基づく研究の出発点となる可能性があります。
Introduction
低分子ノンコーディングRNAは、分化や発生、シグナルプロセシング、疾患などの多様なプロセスにおいて、一連の遺伝子からの発現を調整する転写後の役割について高度に研究されています1,2,3。マイクロRNA(miRNA)を含む遺伝子制御低分子ノンコーディングRNA(sncRNA)の標的転写産物を正確に決定する能力は、基礎レベルと翻訳レベルの両方でRNA生物学の研究にとって重要です。miRNAシード配列とその潜在的な標的との間に予想される相補性を利用するバイオインフォマティクスアルゴリズムは、miRNA:標的RNA相互作用の予測に頻繁に使用されています。これらのバイオインフォマティクスアルゴリズムは成功していますが、他の場所でレビューされているように、偽陽性と偽陰性の両方の結果を隠す可能性もあります4,5,6。最近、いくつかの生化学的アプローチが設計され、実装されており、in vivo架橋とそれに続くライゲーションステップの組み込みにより、in vivoでのsncRNA:標的RNA相互作用の明確かつ半定量的な決定が可能になり、sncRNAを標的に物理的に結合させて単一のキメラRNA 4,5,7,8,9,10を形成します.その後、キメラRNAからシーケンシングライブラリを調製することで、シーケンシングデータの計算処理により、sncRNA:標的RNAの相互作用を評価することができます。このビデオでは、キメラRNAシーケンシングライブラリ6からsncRNA:target RNA相互作用の頑健で再現性のある解析を可能にするように設計された、small chimeric RNA analysis pipeline(SCRAP)と呼ばれる計算パイプラインをインストールして使用するためのチュートリアルを提供します。
このチュートリアルの目的は、sncRNA:標的RNA相互作用のキメラ分子読み出しを提供する生化学的アプローチによって生成されたデータの分析に対する障壁を下げることにより、研究者が純粋に予測的なバイオインフォマティクスアルゴリズムへの過度の依存を回避するのを支援することです。このチュートリアルでは、ハイブリッドの架橋、ライゲーション、シーケンシング(CLASH)や内因性アルゴノート結合RNAの共有結合ライゲーション(CLEAR-CLIP)7,9など、いくつかの既存の生化学プロトコルによって生成できるキメラRNAシーケンシングデータを解析するために開発されたパイプラインSCRAPを使用して、エントリーレベルの計算科学者をガイドするための実践的な手順とヒントを提供します。
SCRAPの使用は、他の計算パイプラインと比較して、キメラRNAシーケンシングデータの解析にいくつかの利点を提供します6。顕著な利点の 1 つは、パイプライン内のステップでカスタムおよび/またはサポートされていないスクリプトに依存することが多い代替パイプラインと比較して、パイプライン内の広範な注釈と、十分にサポートされ、定期的に更新されるバイオインフォマティクス スクリプトへのコールアウトの組み込みです。この機能により、SCRAPは安定性が高まり、研究者がパイプラインに慣れ親しみ、その使用をワークフローに組み込むことがより価値のあるものになります。また、SCRAPは、sncRNA:target RNA相互作用のピークの呼び出しにおいて、他のパイプラインよりも優れた性能を発揮し、クロスプラットフォーム機能を持つことが実証されています(以前の出版物6で詳述)。
このチュートリアルを修了すると、ユーザーは (i) SCRAP のプラットフォーム要件を把握して SCRAP パイプラインをインストールし、(ii) リファレンスゲノムをインストールし、SCRAP のコマンドラインパラメータを設定し、(iii) ピーク呼び出し基準を理解し、ピーク呼び出しとピークアノテーションを実行できるようになります。
このビデオでは、RNA生物学を研究する研究者が、シーケンシャルライブラリ調製に対する生化学的アプローチの1つを通じて得られたキメラRNAシーケンシングデータにおいて、メッセンジャーRNAなどの標的RNAとのsncRNA相互作用を解析するために、計算パイプラインSCRAPをインストールし、最適に使用する方法を実践的に詳細に説明します。
SCRAPはコマンドラインユーティリティです。一般的に、以下のガイドに従って、ユーザーは(i)SCRAPをダウンロードしてインストールし(https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP)、(ii)リファレンスゲノムをインストールしてSCRAPを実行し、(iii)ピークコールとアノテーションを実行する必要があります。
この手順の計算手順の詳細については、https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP を参照してください。この記事では、エントリーレベルの計算スキルを持つ研究者がキメラRNAシーケンシングライブラリデータセットにSCRAPをインストール、最適化、および使用できるようにするためのセットアップと背景情報を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
sncRNA:標的RNA相互作用の分析のためのSCRAPパイプラインの使用に関するこのプロトコルは、計算分析に入ろうとしている研究者を支援するように設計されています。チュートリアルの完了は、このパイプラインのインストールと使用、およびキメラRNAシーケンシングライブラリから得られたデータを分析するためのそのアプリケーションに必要な手順を通じて、エントリーレベル以上の計算経?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
BH Powell氏やWT Mills IV氏など、有益な議論をしてくれたMeffert研究所のメンバーに、パイプラインの設置と実施に関する重要なフィードバックをいただいたことに感謝します。この研究は、Braude Foundation賞、Maryland Stem Cell Research Fund Launch Program、Blaustein Endowment for Pain Research and Education賞、NINDS RO1NS103974およびNIMH RO1MH129292 to M.K.M.の支援を受けました。
Materials
| Genomes | UCSC Genome browser | N/A | https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ |
| Linux | Linux | Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended | |
| Mac | Apple | Mac OSX (>11) | |
| Platform setup | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] |
| SCRAP pipeline | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP |
| Unix shell | Unix operating system | bash >=5.0 | |
| Unix shell | Unix operating system | zsh (5.9 recommended) | |
| Windows | Windows | WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS |
Riferimenti
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