Учебное пособие по вычислительному анализу химерных малых некодирующих РНК: библиотеки секвенирования целевых РНК
Summary
Здесь мы представляем протокол, демонстрирующий установку и использование биоинформатического конвейера для анализа данных секвенирования химерной РНК, используемых при изучении взаимодействий РНК:РНК in vivo .
Abstract
Понимание регуляторных взаимодействий генов in vivo малых некодирующих РНК (sncRNAs), таких как микроРНК (miRNAs), с их РНК-мишенями было продвинуто в последние годы благодаря биохимическим подходам, которые используют кросс-линкинг с последующим лигированием для захвата взаимодействий sncRNA:целевая РНК путем образования химерных РНК и последующих библиотек секвенирования. В то время как наборы данных, полученные при секвенировании химерной РНК, предоставляют полногеномные и значительно менее неоднозначные входные данные, чем программное обеспечение для прогнозирования микроРНК, преобразование этих данных в значимую и полезную информацию требует дополнительного анализа и может отпугнуть исследователей, не имеющих вычислительной подготовки. Этот отчет представляет собой учебное пособие для специалистов по вычислительной биологии начального уровня в установке и применении новейшего программного инструмента с открытым исходным кодом: Small Chimeric RNA Analysis Pipeline (SCRAP). Приведены требования к платформе, обновления, а также объяснение этапов конвейера и манипуляций с ключевыми переменными, вводимыми пользователем. Снижение барьера для биологов в получении информации от химерных подходов к секвенированию РНК может дать толчок к исследованиям регуляторных взаимодействий sncRNA:РНК-мишени в различных биологических контекстах, основанных на открытиях.
Introduction
Малые некодирующие РНК хорошо изучены на предмет их посттранскрипционной роли в координации экспрессии наборов генов в различных процессах, таких как дифференцировка и развитие, обработка сигналов и заболевания 1,2,3. Способность точно определять целевые транскрипты геннорегуляторных малых некодирующих РНК (sncRNAs), включая микроРНК (miRNAs), имеет важное значение для изучения биологии РНК как на базовом, так и на трансляционном уровнях. Биоинформатические алгоритмы, использующие ожидаемую комплементарность между семенной последовательностью микроРНК и ее потенциальными мишенями, часто используются для прогнозирования взаимодействий микроРНК с целевой РНК. Несмотря на то, что эти биоинформатические алгоритмы оказались успешными, они также могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты, как было рассмотрено в других статьях 4,5,6. В последнее время было разработано и внедрено несколько биохимических подходов, которые позволяют однозначно и полуколичественно определять взаимодействия sncRNA:РНК-мишень in vivo путем сшивания in vivo и последующего включения этапа лигирования для физического присоединения sncRNA к мишени с образованием единой химерной РНК 4,5,7,8,9,10 . Последующая подготовка секвенирующих библиотек из химерных РНК позволяет оценить взаимодействия sncRNA:РНК-мишень путем компьютерной обработки данных секвенирования. В этом видео представлено учебное пособие по установке и использованию вычислительного конвейера, называемого малым конвейером анализа химерной РНК (SCRAP), который предназначен для обеспечения надежного и воспроизводимого анализа взаимодействий sncRNA:целевая РНК из библиотек секвенирования химерной РНК6.
Цель данного учебного пособия состоит в том, чтобы помочь исследователям избежать чрезмерной зависимости от чисто прогностических биоинформатических алгоритмов путем снижения барьеров для анализа данных, полученных с помощью биохимических подходов, обеспечивая химерные молекулярные считывания взаимодействий sncRNA:целевая РНК. В этом учебном пособии содержатся практические шаги и советы, которые помогут начинающим специалистам по вычислительной технике использовать конвейер SCRAP, разработанный для анализа данных секвенирования химерной РНК, которые могут быть получены с помощью нескольких существующих биохимических протоколов, включая сшивание, лигирование и секвенирование гибридов (CLASH) и ковалентное лигирование эндогенных аргонавт-связанных РНК – сшивание и иммунопреципитацию (CLEAR-CLIP)7,9.
Использование SCRAP дает ряд преимуществ для анализа данных секвенирования химерной РНК по сравнению с другими вычислительными конвейерами6. Одним из существенных преимуществ является обширное аннотирование и включение выносок в хорошо поддерживаемые и регулярно обновляемые биоинформатические сценарии в конвейере по сравнению с альтернативными конвейерами, которые часто полагаются на пользовательские и/или неподдерживаемые сценарии для этапов конвейера. Эта функция обеспечивает стабильность SCRAP, что делает более полезным для исследователей ознакомиться с конвейером и включить его использование в свой рабочий процесс. Также было продемонстрировано, что SCRAP превосходит альтернативные конвейеры в вызове пиков взаимодействий sncRNA:целевая РНК и обладает кроссплатформенной функциональностью, как подробно описано в предыдущей публикации6.
К концу этого учебного пособия пользователи смогут (i) узнать требования к платформе для SCRAP и установить конвейеры SCRAP, (ii) установить эталонные геномы и настроить параметры командной строки для SCRAP, и (iii) понять критерии пиковых вызовов и выполнять пиковые вызовы и пиковые аннотации.
В этом видео будет подробно описано, как исследователи, изучающие биологию РНК, могут установить и оптимально использовать вычислительный конвейер SCRAP для анализа взаимодействий sncRNA с целевыми РНК, такими как матричные РНК, в данных химерного секвенирования РНК, полученных с помощью одного из обсуждаемых биохимических подходов к подготовке библиотеки секвенирования.
SCRAP — это утилита командной строки. Как правило, следуя приведенному ниже руководству, пользователю необходимо (i) загрузить и установить SCRAP (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP), (ii) установить референсные геномы и запустить SCRAP, и (iii) выполнить пиковый вызов и аннотацию.
Более подробную информацию о шагах вычислений в этой процедуре можно найти на https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP. В этой статье мы предоставим настройку и справочную информацию, которая позволит исследователям с вычислительными навыками начального уровня устанавливать, оптимизировать и использовать SCRAP в наборах данных библиотеки химерного секвенирования РНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол по использованию конвейера SCRAP для анализа взаимодействий sncRNA:РНК-мишени предназначен для помощи исследователям, которые приступают к вычислительному анализу. Ожидается, что по завершении учебного пособия исследователи с опытом вычислений начального уровня или выше пр?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников лаборатории Мефферта за полезные обсуждения, в том числе Б.Х. Пауэлла и У.Т. Миллса IV, за критические отзывы об описании установки и реализации трубопровода. Эта работа была поддержана премией Фонда Брауде, программой запуска Фонда исследований стволовых клеток штата Мэриленд, премией Фонда Блаустейна за исследования и образование в области боли, а также RO1MH129292 NINDS RO1NS103974 и NIMH для M.K.M.
Materials
| Genomes | UCSC Genome browser | N/A | https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ |
| Linux | Linux | Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended | |
| Mac | Apple | Mac OSX (>11) | |
| Platform setup | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] |
| SCRAP pipeline | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP |
| Unix shell | Unix operating system | bash >=5.0 | |
| Unix shell | Unix operating system | zsh (5.9 recommended) | |
| Windows | Windows | WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS |
Riferimenti
- Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
- Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury responses, and pain in the peripheral nervous system. Neurobiology of Pain (Cambridge, Mass.). 13, 100119 (2023).
- Shi, J., Zhou, T., Chen, Q. Exploring the expanding universe of small RNAs. Nature Cell Biology. 24 (4), 415-423 (2022).
- Broughton, J. P., Lovci, M. T., Huang, J. L., Yeo, G. W., Pasquinelli, A. E. Pairing beyond the seed supports microRNA targeting specificity. Molecular Cell. 64 (2), 320-333 (2016).
- Grosswendt, S., et al. Unambiguous identification of miRNA:target site interactions by different types of ligation reactions. Molecular Cell. 54 (6), 1042-1054 (2014).
- Mills, W. T., Eadara, S., Jaffe, A. E., Meffert, M. K. SCRAP: a bioinformatic pipeline for the analysis of small chimeric RNA-seq data. RNA. 29 (1), 1-17 (2023).
- Helwak, A., Kudla, G., Dudnakova, T., Tollervey, D. Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding. Cell. 153 (3), 654-665 (2013).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Moore, M. J., Zhang, C., Gantman, E. C., Mele, A., Darnell, J. C., Darnell, R. B. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Bjerke, G. A., Yi, R. Integrated analysis of directly captured microRNA targets reveals the impact of microRNAs on mammalian transcriptome. RNA. 26 (3), 306-323 (2020).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11 (1), 129 (2010).
- Moore, M. J., et al. miRNA-target chimeras reveal miRNA 3′-end pairing as a major determinant of Argonaute target specificity. Nature Communications. 6 (1), 8864 (2015).
- Travis, A. J., Moody, J., Helwak, A., Tollervey, D., Kudla, G. Hyb: a bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH (crosslinking, ligation and sequencing of hybrids) data. Methods (San Diego, Calif.). 65 (3), 263-273 (2014).
