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Biology

Entwicklung von Multiplex-Real-Time-RT-qPCR-Assays zum Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A/B und MERS-CoV

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Wir präsentieren zwei sondenbasierte, einstufige RT-qPCR-Kits für gängige Atemwegsviren. Der erste Test ist für SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 und H3N2) und Influenza B. Die zweite ist für SARS-Cov-2 (N) und MERS (UpE und ORF1a). Diese Assays können in jedem spezialisierten Labor erfolgreich implementiert werden.

Abstract

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), das die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) verursacht, stellt eine ernsthafte Bedrohung für die Gesundheit der Bevölkerung dar. Während der Grippesaison kann die Ausbreitung von SARS-CoV-2 und anderen Atemwegsviren zu einer bevölkerungsweiten Belastung durch Atemwegserkrankungen führen, die schwer zu bewältigen ist. Dazu müssen die Atemwegsviren SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und das Middle East Respiratory Syndrome (MERS-CoV) in der kommenden Herbst- und Wintersaison sorgfältig überwacht werden, insbesondere im Fall von SARS-CoV-2, Influenza A und Influenza B, die ähnliche epidemiologische Faktoren wie anfällige Bevölkerungsgruppen, Übertragungswege und klinische Syndrome aufweisen. Ohne zielspezifische Assays kann es aufgrund ihrer Ähnlichkeiten schwierig sein, zwischen Fällen dieser Viren zu unterscheiden. Dementsprechend wird ein sensitiver und zielgerichteter Multiplex-Assay, der diese viralen Ziele leicht unterscheiden kann, für Ärzte nützlich sein. In dieser Studie haben wir einen Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR-basierten Assay entwickelt, der ein intern entwickeltes einstufiges R3T-RT-qPCR-Kit für den gleichzeitigen Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2, MERS-CoV, verwendet. Mit nur 10 Kopien ihrer synthetischen RNAs können wir SARS-CoV-2-, Influenza-A-, Influenza-B- und MERS-CoV-Ziele gleichzeitig mit 100%iger Spezifität identifizieren. Dieser Assay erweist sich als genau, zuverlässig, einfach, empfindlich und spezifisch. Die entwickelte Methode kann als optimierter SARS-CoV-2-, Influenza-A-, Influenza-B- und SARS-CoV-2-, MERS-CoV-Diagnosetest in Krankenhäusern, medizinischen Zentren und diagnostischen Laboren sowie zu Forschungszwecken eingesetzt werden.

Introduction

Die Pandemie der anhaltenden Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) wird durch das neuartige Coronavirus verursacht, das als schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1 bekannt ist. Aufgrund der starken Ansteckungsfähigkeit und der Fähigkeit von SAR-CoV-2 zur schnellen Übertragung entstand die COVID-19-Pandemie in der Stadt Wuhan, China, und breitete sich schnell auf der ganzen Welt aus. Dies führte schließlich zum Auftreten von Atemnotsymptomen und sogar zum Tod 2,3,4. COVID-19 wurde in mehr als 213 Ländern zur Pandemie erklärt, wobei ein steiler Anstieg der Zahl der bestätigten Fälle erwartet wird, wie aus den in verschiedenen Forschungsstudien veröffentlichten Studien hervorgeht 3,5. COVID-19 wird hauptsächlich durch kleine Tröpfchen übertragen, die infizierte Personen in die Umwelt abgeben und dann durch Einatmen oder engen Kontakt mit kontaminierten Oberflächen gefährdeten Personen ausgesetzt werden. Wenn diese Tröpfchen mit der Schleimhaut von Augen, Mund oder Nase in Kontakt kommen, kann sich eine Person infizieren6. Statistiken der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zeigen, dass es weltweit mehr als 76 Millionen bestätigte Fälle der Pandemie gibt, mit erschütternden 7 Millionen Todesfällen7. So stuften die Vereinten Nationen die durch die COVID-19-Krankheit verursachte Pandemie als Katastrophe ein, da sie sich direkt auf das Leben von Milliarden von Menschen auf der ganzen Welt auswirkt und weitreichende wirtschaftliche, ökologische und soziale Auswirkungen hat.

Initiativen im Bereich der öffentlichen Gesundheit, einschließlich gründlicher Tests, Früherkennung, Kontaktverfolgung und Fallisolierung, haben sich als entscheidend erwiesen, um diese Pandemie unter Kontrolle zu halten 8,9,10,11. In den Wintermonaten wird die Zirkulation anderer Atemwegsviren wie Influenza A und B mit COVID-19-ähnlichen Symptomen zunehmen, was es schwierig macht, COVID-19-Fälle frühzeitig zu identifizieren, aufzuspüren und zu isolieren. Jedes Jahr beginnt der Ausbruch der Influenza A und B im Spätherbst oder Anfang Januar mit einer vorhersehbaren Saisonalität12. SARS-CoV-2 und Influenzaviren haben zahlreiche epidemiologische Merkmale gemeinsam. Außerdem gibt es Ähnlichkeiten in den anfälligen Bevölkerungsgruppen, zu denen Kinder, ältere Menschen, immungeschwächte Menschen und Personen mit chronischen Komorbiditäten wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, Herz- und Nierenversagen oder Diabetes gehören12,13. Diese Viren teilen nicht nur gefährdete Bevölkerungsgruppen, sondern auch Übertragungswege und Atemtröpfchen14. Es wird erwartet, dass sich Patienten mit mehr als einem dieser Atemwegsviren infizieren können, wenn sich die Grippesaison dem14. nähert. Dazu muss das Screening auf SARS-CoV-2 und die Influenzaviren bei symptomatischen Patienten durchgeführt werden, bevor sie isoliert werden. Getrennte Tests für die drei Viren (SARS-CoV-2, Influenza A und Influenza B) sind aufgrund des weltweiten Mangels an Ressourcen für die Nukleinsäureextraktion und -diagnostik nicht möglich. Um sie alle in einer Reaktion zu screenen, muss eine Methode oder ein Test entwickelt werden.

Das Middle East Respiratory Syndrome (MERS)-CoV ist ein Familienmitglied des humanen Coronavirus (CoV). Die ersten MERS-CoV-Virusisolate stammten von einem Krankenhauspatienten in Saudi-Arabien, der im September 2012 an akuten Atemwegserkrankungen gestorben war15. Es gibt Hinweise, die darauf hindeuten, dass ein prominenter Reservoirwirt für MERS-CoV das Dromedar ist. Es ist erwiesen, dass Viren von infizierten Dromedaren zoonotisch sind und somit den Menschen infizieren können16,17. Menschen, die mit diesem Virus infiziert sind, können es durch engen Kontakt auf andere übertragen18. Bis zum 26. Januar 2018 gab es weltweit 2143 laborbestätigte Fälle von MERS-CoV-Infektionen, darunter 750 Todesfälle. Die typischsten MERS-CoV-Symptome sind Husten, Fieber und Kurzatmigkeit. Es wurde auch berichtet, dass MERS-CoV-Infektionen Lungenentzündung, Durchfall und gastrointestinale Krankheitssymptome aufweisen20. Derzeit gibt es keinen kommerziellen Impfstoff oder eine spezifische Behandlung für MERS-CoV. Daher ist eine schnelle und präzise Diagnose unerlässlich, um die weit verbreiteten MERS-CoV-Ausbrüche zu verhindern und MERS-CoV von der SARS-CoV-2-Erkrankung zu unterscheiden.

Bisher wurden viele Ansätze zum Nachweis dieser Viren vorgeschlagen, wie z. B. Multiplex-RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 und CRISPR/Cas329, Lateral-Flow-Immunoassay30, papierbasierte biomolekulare Sensoren31, SHERLOCK-Tests in einem Topf32, DNA-Aptamer33, schleifenvermittelte isotherme Verstärkung (LAMPE)19,34 usw. Jede der oben genannten Methoden hat einzigartige Vor- und Nachteile in Bezug auf Sensitivität und Spezifität. Unter diesen Methoden ist der auf Nukleinsäureamplifikation basierende Test: Multiplex-qRT-PCR, die gebräuchlichste und gilt als Goldstandard für die Diagnose von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und MERS-CoV.

In dieser Studie haben wir verschiedene Primer-Kombinationen und Sonden für den effektiven, genauen und gleichzeitigen Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2, MERS-CoV unter Verwendung von synthetischen Standard-Twist-Virus-RNAs entwickelt und bewertet. Die Multiplex-Assays, die entweder für MERS-CoV- oder SARS-CoV-2-Zielgene entwickelt wurden, werden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) empfohlen. Diese Gene kodieren im Allgemeinen für Proteine und Komplexe, die zur Bildung eines Replikations-/Transkriptionskomplexes (RTC)35 beitragen, wie z. B. die Region innerhalb des offenen Leserahmens 1a (ORF1a), die für den MERS-CoV-Assay verwendet wird. Darüber hinaus werden Strukturproteine von den Genen kodiert, die in diagnostischen Assays verwendet werden, wie z. B. die Upstream-Region des Hüllgens (upE) und das Nukleokapsid-Gen (N), die für MERS-CoV- bzw. SARS-Cov-2-Assays verwendet werden35,36. Wir verwendeten das hauseigene einstufige RT-qPCR-Kit R3T, um die RT-qPCR für den Nachweis von Viren zu etablieren37. Der Virusnachweis, die Sensitivität, die Spezifität und der dynamische Bereich unseres einstufigen RT-qPCR-Kits und der Primer-Sets R3T wurden mit 10-fachen seriellen Verdünnungen der synthetischen Standard-Twist-RNAs getestet und bewertet. Die niedrigste praktische Nachweisgrenze lag bei etwa 10 Transkriptkopien pro Reaktion. Dadurch können das hauseigene einstufige RT-qPCR-Kit R3T und die Primer/Sonden-Sets erfolgreich für die routinemäßige gleichzeitige Diagnose von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2, MERS-CoV, eingesetzt und implementiert werden.

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Protocol

1. Taq-Polymerase-Expression und -Reinigung

  1. Konstruieren Sie ein Plasmid mit einem spaltbaren Hexa-Histidin-Tag am C-Terminus des Enzyms.
  2. Transformieren Sie 50 ng des Expressionsvektors in den Stamm E. coli BL21-(DE3) gemäß dem Standardprotokoll38.
  3. Die transformierten Zellen werden in vier 6-l-Kolben mit je 2 l 2YT-Medienbrühe bei 37 °C unter Schütteln bei 170 U/min inokuliert, bis der OD 600 von 0,8 oder die Zellnummer 6,4 x 108 erreicht ist.
  4. Die Taq-Polymerase-Expression wird mit 0,5 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und bei 16 °C für 18 h unter Schütteln inkubiert.
  5. Ernten Sie die Zellen, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 4 °C bei 7808 x g herunterschleudern. Resuspendieren Sie die Pellets in 200 ml eines eiskalten Taq-Polymerase-Lysepuffers (Tabelle 1) in 5 ml/g Zellpellet.
  6. Die Zellen werden 45 min lang mit Lysozym (2 mg/ml Lysepuffer) und Proteaseinhibitoren inkubiert und dann das Lysat bei 30 kpsi durch einen Zelldisruptor geleitet und bei 22.040 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu trennen.
  7. Den Überstand 15 min bei 85 °C erhitzen. Schleudern bei 95.834 x g für 1 h bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand und filtern Sie ihn auf Eis mit einem 0,45-μm-Filter.
  8. Führen Sie eine Proteinreinigung mit Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) durch, indem Sie die Probe zunächst durch eine Ni-NTA HP 5 mL-Säule mit einer Flussrate von 4 ml/min unter Verwendung von Taq-Polymerase-Puffer A führen (Tabelle 2; Abbildung 1A).
  9. Waschen Sie mit 10 Säulenvolumina (CV) Taq-Polymerase-Puffer A und 4% Taq-Polymerase-Puffer B (Tabelle 2). Das gebundene Protein wird mit einem linearen Gradienten unter Verwendung von Taq-Polymerase-Puffer B über 20 CV in einer 100-ml-Flasche eluiert.
  10. Der Eluent in der 100-ml-Flasche wird durch eine 5-ml-Kationenaustauschsäule mit 4 ml/min unter Verwendung von Taq-Polymerase-Puffer C geleitet (Tabelle 2; Abbildung 1A).
  11. Mit 20 CV 100 % Taq-Polymerase-Puffer C und 5 % Taq-Polymerase-Puffer D waschen (Tabelle 2).
  12. Elute mit einem linearen Gradienten unter Verwendung des Taq-Polymerase-Puffers D (Tabelle 2) von 5 % bis 100 %.
  13. Überprüfen Sie die eluierten Fraktionen, indem Sie eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese 39 durchführen, gefolgt von einer Gelfärbung 40 , wie zuvor beschrieben. Kurz gesagt, nehmen Sie 10 μl von jeder Fraktion und fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x SDS-Ladefarbstoff hinzu. Die Probe wird 10 Minuten lang bei 90°C denaturiert. Laden Sie die Proben auf 10% SDS-PAGE Gel und lassen Sie das Gel 25 Minuten lang bei 200 V laufen. Färben Sie das Gel mit Coomassie Brilliant Blue und entfärben Sie es anschließend.
  14. Alle Fraktionen, die gereinigte Taq-Polymerase enthalten, werden gesammelt und bei 4 °C gegen den Taq-Polymerase-Speicherpuffer (Tabelle 3) dialysiert. Bereiten Sie kurz 2 l des Speicherpuffers vor und tauchen Sie die Dialysekassette 2 Minuten lang in den Puffer, um sie zu hydratisieren. Die gesammelten Fraktionen werden mit einer Nadel in die Dialysekassette injiziert und über Nacht im Dialysepuffer bei 200 U/min am Rührer belassen.
  15. Nach der Dialyse wird die Proteinkonzentration mit einem Spektralphotometer gemessen, 10 μl Aliquots hergestellt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.
    HINWEIS: Filtern Sie alle Puffer für die Aufreinigung mit einem 0,45-μm-Filter, bevor Sie sie in das FPLC-System laden.

2. MMLV-RT-Expression im Insektenzellexpressionssystem und Aufreinigung

  1. Generierung und Isolierung von Bacmid-DNA
    1. Klonen Sie die Sequenz von MMLV-RT mit einem C-terminus-spaltbaren TEV-8xHis-Streptokokken-Tag, wie zuvor beschrieben41.
    2. Mischen Sie 100 ng des Expressionsvektors in 50 μl DH10Bac-Zellen und mischen Sie vorsichtig durch Klopfen auf das Röhrchen.
    3. Die Zellen 15 Minuten lang auf Eis inkubieren. Die Zellen werden 1 min lang bei 42 °C einem Hitzeschock unterzogen.
    4. Sofort auf Eis umfüllen und 400 μl S.O.C.-Medium hinzufügen. Bei 37 °C unter Schütteln 4 h inkubieren.
    5. Platte 10 μl und 15 μl der Mischung auf LB-Agar-Platten, die drei Antibiotika enthalten; 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyclin und 7 μg/ml Gentamicin zusammen mit 40 μg/ml IPTG und 100 μg/ml X-Gal für die blau-weiße Selektion.
    6. Die Platten 48 h bei 37 °C inkubieren. Wählen Sie mehrere weiße Kolonien und eine blaue Kolonie als Kontrolle aus und streifen Sie sie erneut auf frische LB-Agarplatten, die die oben genannten Antibiotika enthalten. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
    7. Nachdem Sie den weißen Phänotyp bestätigt haben, wählen Sie ein paar Kolonien aus und inokulieren Sie sie in 10 ml LB-Medien mit 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyclin und 7 μg/ml Gentamicin in 50-ml-Röhrchen.
    8. Die Kultur wird über Nacht bei 37 °C unter Schütteln bei 170 U/min inkubiert. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 22.040 x g herunterdrehen.
    9. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 250 μl Resuspensionslösung aus dem Miniprep-Kit (diese Lösung muss gemäß den Anweisungen des Herstellers gehandhabt werden), dann überführen Sie die Lösung in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    10. 250 μl Lyselösung hinzufügen, vorsichtig mischen und 3 Minuten lang inkubieren. 350 μl Neutralisationslösung zugeben, 2x-3x invertieren und bei 22.040 x g 10 min zentrifugieren.
    11. Den Überstand in ein frisches Röhrchen überführen und ein gleiches Volumen eiskaltes Isopropanol zugeben und 30 min bei -20 °C inkubieren.
    12. Die gefällte DNA wird durch Schleudern bei 22.040 x g für 10 Minuten pelletiert. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet 2x mit 700 μl 70% eiskaltem Ethanol.
    13. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, ohne das Pellet zu berühren. Lassen Sie das Pellet 5-10 Minuten lang in der Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen oder bis keine Flüssigkeit mehr im Rohr zu sehen ist. Lösen Sie das Pellet in 100 μl EB-Puffer auf.
  2. Bacmid-Transfektion und Virus-Amplifikation
    1. Vorbereitung des P1-Virus
      1. In einer 6-Well-Gewebekulturplatte ~ 9 x 105 Zellen/Well in 2 ml Insektenzellkulturmedium aussäen.
      2. Inkubieren Sie die Platte ~30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich die Zellen anheften können.
      3. Bereiten Sie die Bacmid/Fugene-Mischung wie folgt zu: Mischen Sie 1 μg Bacmid-DNA und 300 μl Insektenzellmedien in einem Röhrchen. Mischen Sie in einem anderen Röhrchen 8 μl Transfektionsreagenz und 300 μl Insektenzellmedien. Mischen Sie beide Mischungen durch vorsichtiges Pipettieren und lassen Sie sie ~30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, damit sich der Bacmid/Transfektionsreagenz-Komplex bilden kann.
      4. Geben Sie die Bacmid-Komplexmischung (~210 μl) tropfenweise in jede Vertiefung und verschließen Sie die Platte mit einer transparenten Folie.
      5. Die Platte bei 27 °C für 3-4 Tage inkubieren.
      6. Man nehme das Medium, das das Virus enthält, füge FBS (Endkonzentration 2 %) hinzu, filtere mit einem 0,45-μm-Filter und lagere es bei 4 °C im Dunkeln als P1-Virusbrühe.
    2. Vorbereitung des P2-Virus
      1. Transfektieren Sie 50 ml Insektenzellen bei 2 x 106 Zellen/ml mit 3 ml P1-Virus in einem Nährkolben.
      2. Bei 27 °C mit Schütteln bei 100 U/min für 4-6 Tage inkubieren, bis der Prozentsatz der abgestorbenen Zellen 25%-30% erreicht.
      3. Bei 300 x g 10 min zentrifugieren und den virushaltigen Überstand auffangen.
      4. FBS bis zu einer Endkonzentration von 2 % zugeben, durch 0,45 μm Filter filtrieren und jeweils 1 mL aliquotieren und bei -80 °C als P2-Virusbrühe lagern.
    3. Vorbereitung des P3-Virus
      1. 100 ml Insektenzellen bei 2 x 106 Zellen/ml mit den 2 ml P2-Virus in einem Nährkolben transfektiert.
      2. Bei 27 °C unter Schütteln bei 100 U/min für 3-4 Tage inkubieren, bis der Prozentsatz der abgestorbenen Zellen 15%-20% erreicht.
      3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 Minuten und sammeln Sie den Überstand, der das Virus enthält.
      4. FBS bis zu einer Endkonzentration von 2 % zugeben. Filtern Sie durch einen 0,45-μm-Filter. Es kann im Dunkeln bei 4 °C 1 Monat gelagert werden.
  3. Expression und Aufreinigung von MMLV-RT in Insektenzellen
    1. 5 ml P3-Virus werden frischen Insektenzellen mit einer Dichte von 2 x 106 Zellen/ml (700 ml/2-l-Kolben) in insgesamt 6 Kolben gegeben.
    2. Ernten Sie die Zellen nach 55-60 Stunden nach der Transfektion, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 7808 x g schleudern.
    3. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 ml MMLV-RT-Lysepuffer (Tabelle 4). Das Lysat wird bei 15 kpsi durch einen Zelldisruptor geleitet und bei 22.040 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
    4. Den Überstand in neue Röhrchen überführen und bei 95.834 x g bei 4 °C für 1 h wieder herunterschleudern. Sammeln Sie den Überstand und filtern Sie ihn mit einem 0,45-μm-Filter auf Eis.
    5. Beginnen Sie mit der Proteinaufreinigung mit FPLC, indem Sie die Probe zunächst durch die Ni-NTA Excel 5-ml-Säule (Abbildung 1B) mit einer Flussrate von 4 ml/min unter Verwendung von MMLV-RT-Puffer A führen (Tabelle 5).
    6. Waschen Sie die Säule mit 10 CV MMLV-RT-Puffer A und 4 % MMLV-RT-Puffer B (Tabelle 5) und eluieren Sie das Protein mit dem linearen Gradienten von MMLV-RT-Puffer B über 20 CV in einer 100-ml-Flasche.
    7. Führen Sie die eluierte Probe durch die Streptokokken-5-ml-Säule (Abbildung 1B), die mit dem MMLV-RT-Puffer C äquilibriert ist (Tabelle 5).
    8. Waschen Sie die Säule mit 10 CV 100% MMLV-RT Puffer C und eluieren Sie das Protein mit einem linearen Gradienten mit 20 CV Puffer D (Tabelle 5).
    9. Überprüfen Sie die eluierten Fraktionen, indem Sie SDS-PAGE wie in den Schritten 1.13.-1.14 durchgeführt werden. und sammeln Sie die Fraktionen, die gereinigtes MMLV-RT enthalten, das bei 4 °C gegen den MMLV-RT-Speicherpuffer (Tabelle 6) dialysiert werden soll.
    10. Messen Sie die Proteinkonzentration mit Nanodrop, aliquot, schockfrosten Sie es in flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei -80 °C.
      HINWEIS: Filtern Sie alle Puffer für die Aufreinigung mit einem 0,45-μm-Filter, bevor Sie sie in das FPLC-System laden.

3. Herstellung von hauseigenen Multiplex-R3T-Einschritt-RT-qPCR-Kit-Komponenten

  1. Vorbereitung der Puffermischung
    1. Bereiten Sie den 2x-Puffer für die RT-qPCR-Reaktion vor, der die zuvor in37 gezeigten Reagenzien enthält. Bereiten Sie alle Reagenzien in DNase/RNase-freiem Wasser vor und lagern Sie die Puffermischung in einem Gefrierschrank bei -20 °C.
  2. Primer- und Sondensets und Primer Mischungsvorbereitung
    HINWEIS: Die verwendeten Sonden und Primer sind in Tabelle 7 aufgeführt. Das Influenza- und SARS-CoV-2-Multiplex-Kit enthält 3 Sonden und 4 Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Sets. Die Sonden werden an den 5′-Enden mit den Reportern 6-Carboxyfluorescein (FAM) für InfA, Texas Red-XN für SARS-CoV-2 (N-Gen) und Yakima Yellow für InfB markiert. Das MERS-CoV- und SARS-CoV-2-Multiplex-Kit enthält 3 Sonden und 3 Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Sets. Die Sonden werden auch an den 5′-Enden mit den Reportern Texas Red-XN für MERS-CoV (ORF1a-Gen), VIC für MERS-CoV (UpE-Gen) und 6-Carboxyfluorescein (FAM) SARS-CoV-2 (N-Gen) markiert.
    1. Bereiten Sie eine Primermischung mit allen in Tabelle 7 aufgeführten Primern und Sonden mit einer Endkonzentration von 6,7 μM für jeden Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 1,25 μM für jede Sonde in einem 1,5-ml-Röhrchen vor. Lagern Sie die Grundiermischung im Gefrierschrank bei -20 °C. Verwenden Sie Elutionspuffer, um das erforderliche Volumen auszugleichen.
  3. Vorbereitung der Enzymmischung
    1. Bereiten Sie die Mischung aus Taq-Polymerase (30 U/μl) und MMLV-RT (60 ng/μl) Enzym im Taq-Polymerase-Speicherpuffer vor, wie in Tabelle 3 gezeigt, um das erforderliche Volumen zu erhalten. Führen Sie diesen Schritt auf Eis durch und lagern Sie die Enzymmischung bei -20 °C.
  4. RNA-Vorlage
    1. Resuspendieren Sie synthetische RNAs von SARS-CoV-2, Influenza A H1N1, Influenza A H3N2, Influenza B und MERS-CoV separat in 100 μl 1x Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tri-Cl und 1 mM EDTA (pH 8,0), um einen Vorrat von 1 x 106 RNA-Kopien/μl herzustellen.
    2. Mischen Sie synthetische RNAs für die RT-qPCR in den folgenden Konfigurationen: 1) SARS-CoV-2, Influenza A und Influenza B durch Zugabe von 5 μl von jedem Virusstamm zu einem Volumen von 50 μl, um 1 x 105 RNA-Kopien/μl herzustellen; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV durch Zugabe von 5 μl von jedem Virusstamm zu einem Volumen von 50 μl, um 1 x 105 RNA-Kopien/μl herzustellen. 10-fache serielle Verdünnungen jeder synthetischen RNA-Mischung im Bereich von 1 x 105 RNA-Kopien/μl bis 10 RNA-Kopien/μl herstellen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie eiskaltes DNase-/RNase-freies Wasser verwenden, um die serielle Verdünnung der Vorlagen vorzubereiten.

4. Hauseigener Multiplex-Test für SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2, MERS-CoV einstufiger RT-qPCR-Test

HINWEIS: Desinfizieren Sie die Oberflächen des Arbeitsplatzes und verwenden Sie eine 96-Well-Plattenschablone, um das PCR-Plattenlayout zu planen.

  1. Vorbereitung der 96-Well-Platte
    1. 2x Puffer- und Primermischung auftauen. Halten Sie die Enzymmischung auf Eis.
    2. Geben Sie in jede Vertiefung 10 μl 2x Puffermischung, 1,5 μl der Primermischung, 1 μl Enzymmischung, 6,5 μl DNase/RNase-freies Wasser und 1 μl der entsprechenden RNA-Mischung, die getestet werden muss. Das Endvolumen in jeder Vertiefung beträgt 20 μl. Bitte beachten Sie das vorbereitete Layout, um Hilfe für diesen Schritt zu erhalten.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Mastermix basierend auf der Anzahl der Reaktionen herzustellen, die alle Reagenzien mit Ausnahme der RNA-Probe enthalten, um eine Verzerrung beim Pipettieren zu vermeiden. Führen Sie die Reaktionen außerdem doppelt oder dreifach durch, um technische Fehler zu vermeiden.
    3. Versiegeln Sie die Platte mit einem selbstklebenden PCR-Plattensiegel und zentrifugieren Sie sie kurz für 1 Minute, um die gesamte Flüssigkeit am Boden der Platte aufzufangen. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung das gleiche Flüssigkeitsvolumen hat und frei von Blasen ist, bevor Sie die Proben in das qPCR-Gerät überführen.
      HINWEIS: Alle PCR-Reaktionen müssen auf Eis aufgebaut werden.
  2. PCR-Programm
    1. Öffnen Sie das Echtzeit-qPCR-Maschinenprogramm und wählen Sie die folgenden experimentellen Eigenschaften aus:
      Der Blocktyp: Schnell 96-Well (0,1 ml)
      Versuchsaufbau: Standardkurve
      Reagenzien: TaqMan-Reagenzien
      Ausführungseigenschaften: Standard.
    2. Definieren Sie alle Genziele und ihren Reporterfarbstoff, wie in Tabelle 7 dargestellt. Definieren Sie außerdem Probennamen für jede zu testende Reaktion, um die Analyse der Amplifikationskurven zu erleichtern.
    3. Weisen Sie dem Plattenlayout des Programms Ziele und Proben basierend auf der 96-Well-Platte zu.
    4. Stellen Sie das folgende Zyklusprogramm im PCR-Gerät wie folgt ein:
      55 °C für 10 min
      40 Zyklen: 94 °C für 1 min
      94 °C für 10 s
      68 °C für 10 s
      68 °C für 20 s; hier Fluoreszenz aufnehmen.
    5. Übertragen Sie die Platte auf das real-time qPCR-Gerät und legen Sie sie in die Halterung, um die richtige Ausrichtung der Platte zu gewährleisten, und starten Sie den Lauf.
    6. Wählen Sie den Speicherort der Datei aus, um die experimentellen Daten zu speichern.
  3. Datenanalyse
    1. Es ist wichtig, zunächst die Amplifikationsplots zu untersuchen, die durch das qPCR-Programm erzeugt werden. Analysieren Sie die Nachweisgrenze, um die minimale RNA-Konzentration zu bestimmen, die nachgewiesen werden kann.
    2. Tragen Sie den Logarithmus der RNA-Kopienzahl auf der x-Achse und den entsprechenden durchschnittlichen Ct-Wert auf der y-Achse auf, um die Empfindlichkeit des Assays zu beurteilen. Die Steigung und der R2 geben die Zuverlässigkeit und Effizienz der Reaktion an.

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Representative Results

In den letzten Jahren gab es erhebliche Fortschritte im diagnostischen Ansatz zum Nachweis gängiger Atemwegsviren mit PCR-Ansätzen 21,22,23,24,25. Trotz dieser Fortschritte wurde der Multiplex-Ansatz, der den Nachweis mehrerer Viren in einem einzigen Test ermöglicht, jedoch noch nicht weit verbreitet, insbesondere in der RT-qPCR-Plattform. Diese Methode wurde erfolgreich unter Verwendung synthetischer RNA-Viren und der internen Optimierung von Reaktionskomponenten implementiert37. Die Spezifität, Sensitivität und Zuverlässigkeit des diagnostischen Assays wurden durch die Verwendung einer Nachweisgrenzanalyse als hoch bewertet. Der vorgestellte Ansatz könnte die Effizienz und Genauigkeit der Diagnose von Atemwegsviren erheblich verbessern, die Notwendigkeit mehrerer Tests verringern und das Risiko von Fehldiagnosen minimieren, wie in43. Weitere Forschung ist erforderlich, um die Vorteile dieses Ansatzes anhand von Patientenproben zu untersuchen und seine Anwendung in der klinischen Praxis zu fördern.

Expression und Aufreinigung der Histidin-markierten Taq-DNA-Polymerase
Basierend auf dem etablierten Protokoll der Taq-DNA-Polymerase-Expression und -Reinigung44 wurde das N-terminale Histidin-markierte Taq-DNA-Polymerase-Plasmid unter der Kontrolle eines Kälteschock-Promotors konstruiert, um den Expressions- und Reinigungsprozess zu erleichtern, wie oben erläutert (Abbildungen 1A und Abbildung 2A). Durch einfaches Ändern der IPTG-Konzentration und -Temperatur kann das Expressionsniveau dieses neuartigen Konstrukts leicht kontrolliert werden. Die Inkubation von Zellen, die das Taq-DNA-Polymerase-Plasmid bei 16 °C mit 1 mM IPTG enthielten, zeigte eine erhöhte Expression der His-Taq-DNA-Polymerase. Darüber hinaus erforderte das früher etablierte Protokoll44 zeitaufwändige Fällungsschritte aus Polyethylenimin (PEI), die mit dem hier verwendeten Konstrukt übersprungen werden können, da die Reinheit des Endprodukts nicht beeinträchtigt wurde und mit der kommerziell erhältlichen Taq-Polymerase vergleichbar war (Abbildung 2B). Die gereinigte Taq-Polymerase migrierte langsamer als die kommerzielle, da die Linkerpeptide zwischen dem Enzym und dem Histidin-Tag am N-Terminus vorhanden waren. Die Taq-DNA-Polymerase wurde erfolgreich mit 0,98 mg/L E. coli-Kultur aus reinem Protein hergestellt.

Expression und Aufreinigung der doppelten His- und Streptokokken-markierten MMLV-Reverse-Transkriptase
Das Baculovirus-Expressionssystem wurde verwendet, um MMLV-RT mit einem C-terminalen Doppel-His und Streptokokken-Tag in Insektenzellen (Sf9) zu exprimieren, wie in Abbildung 2A beschrieben. Eine frühere Studie zeigte, dass das C-terminale markierte MMLV-RT eine höhere Aktivität aufweist, wenn sowohl das N-terminale markierte Protein als auch das C-terminale markierte Protein in Seidenraupen unter Verwendung des Seidenraupen-Baculovirus-Expressionsvektorsystems (Seidenraupen-BEVS) synthetisiert wurden41. Um ein homogenes MMLV-RT-Protein herzustellen, wurden die gleichen Strategien und das gleiche Protokoll wie in der oben genannten Studie verwendet. Als Ergebnis wurde eine verbesserte Expression und mehr als 95 % reines Protein mit einer Ausbeute von 7,5 mg/L Insektenzellkultur erreicht, wie das SDS-PAGE-Gelergebnis zeigt (Abbildung 2C).

Optimierung und Standardisierung der gemultiplexten qRT-PCR
Ein optimierter und entwickelter intern entwickelter Multiplex-RT-qPCR-Test wurde nach Runden der Puffer- und Primermischungsoptimierung erfolgreich zusammengestellt und hergestellt, um drei verschiedene gängige Atemwegsviren gleichzeitig zu detektieren (Abbildung 3)37. Das erste Kit wurde entwickelt, um auf das SARS-CoV-2-N-Gen, das Influenza-A-H1N1- und H3N2-Gen sowie das Influenza-B-Gen abzuzielen. und das zweite Kit ist für das SARS-CoV-2-N-Gen, das MERS-ORF1a- und das upE-Gen. Somit können beide Kits alle drei Ziele erfolgreich und gleichzeitig erkennen, wie der hier vorgestellte Workflow (Abbildung 3). Synthetische RNA-Proben von jedem der in diesem Protokoll verwendeten Viren wurden amplifiziert, was auf die Möglichkeit hinweist, z. B. ein Multiplex-Kit für den Nachweis gängiger Atemwegsviren zu verwenden. Die Sensitivität dieses diagnostischen Tests ist vergleichbar mit den zuvor berichteten Ergebnissen in Patientenproben. In Fällen, in denen Patienten grippeähnliche Symptome zeigen, hat die Verwendung einer gemultiplexten Echtzeit-RT-qPCR vergleichbare Ergebnisse mit dem SARS-CoV-2-, Influenza-A- und Influenza-B-Multiplex-Assay gezeigt45.

Sensitivität und Nachweisgrenze des hauseigenen gemultiplexten RT-qPCR-Kits gegenüber gängigen Atemwegsviren
Die Wirksamkeit des hauseigenen Multiplex-Kits wurde anhand von zwei Primer-Mix-Sätzen und der entsprechenden synthetischen RNA für jedes Kit bewertet, wie im Multiplex-RT-qPCR-Workflow dargestellt (Abbildung 3). Unter Verwendung jeder Primermischung mit 10-facher serieller Verdünnung jeder synthetischen RNA-Mischung im Bereich von 10 bis 105 Kopien/μL als Template können die Sensitivität, Spezifität und Nachweisgrenze der beiden entwickelten gemultiplexten RT-qPCR mit Hilfe der Standardkurvenanalyse bestimmt werden. Dies geschieht in drei unabhängigen Wiederholungen jedes Tests, um die Wirksamkeit und Konsistenz des gemultiplexten RT-qPCR-Kits zu bestätigen. Infolgedessen können die beiden hier entwickelten Kits alle drei Zielgene gleichzeitig mit nur 10 RNA-Kopien/Reaktion erfolgreich amplifizieren, wie die Amplifikationskurve und die Nachweisgrenze (LoD) zeigen (Abbildung 4 und Abbildung 5). Die Steigung und die R2-Werte jeder Kurve wurden verwendet, um die Effizienz der einzelnen Assays zu bewerten (Abbildung 4 und Abbildung 5). Die R2-Werte lieferten eine Schätzung der Güte der linearen Anpassung an die Datenpunkte. In einem effizienten qPCR-Assay sollteR2 sehr nahe oder größer als 0,90 liegen. Die Amplifikationseffizienzen von Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2 bzw. MERS-CoV und SARS-CoV-2 Titrationen lagen bei über 99 % für alle Primer-Sets (Abbildung 4 und Abbildung 5). Darüber hinaus belegen die kleinen Fehlerbalken die Reproduzierbarkeit jedes gemultiplexten RT-qPCR-Kits. Es ist wichtig zu beachten, dass beide Multiplex-Kits keine Primer-Dimerbildung zeigten, da es keine Amplifikation mit der Negativkontrolle gibt (Daten nicht gezeigt). Somit hat das Design beider Kits alle Zielgene erfolgreich mit Zuverlässigkeit, Spezifität und Sensitivität amplifiziert.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Übersicht über die Zusammenstellung des Multiplex-RT-qPCR-Kits in einem Schritt. Die Zusammenstellung des Kits beginnt mit der Expression und Aufreinigung der benötigten Enzyme, Taq-DNA-Polymerase und MMLV-Reverse-Transkriptase. Beide Enzyme mussten durch zwei Spalten geleitet werden, wie in der Abbildung dargestellt. Zweitens folgte auf die Reinigung die Optimierung der Reaktionsbedingungen und des thermischen Zyklusprogramms, was zu optimalen Bedingungen für das Multiplex-Testkit führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Die Plasmidkonstrukte und die Aufreinigungsergebnisse von His-Taq Pol und C-His/Streptokokken MMLV-RT. (A) Schematische Darstellung der rekombinanten His-Taq Pol- und C-His/Streptokokken-MMLV-RT-Expressionsplasmide. Abkürzungen: CSPA-Promotor - Kälteschock-Protein-A-Promotor; RBS - Ribosomen-Bindungsstelle; 6x His - His-Tag mit sechs Histidinen; TEE - translationsförderndes Element; Taq ORF - Taq Pol offener Leserahmen; Polh - Polyeder-Promotor; MMLV-RT ORF - MMLV-RT offener Leserahmen; TEV - Ätzvirus-Protease-Zielstelle; 8x His - His-Tag mit acht Histidinen; Streptokokken - Streptokokken-Tag; polyA - SV40 spätes Polyadenylierungssignal. (B) SDS-PAGE-Analyse von His-Taq Pol, exprimiert in BL21(DE3) E. coli-Zellen und Taq-Polymerase. (C) SDS-PAGE-Analyse von gereinigtem C-His/Streptokokken-MMLV-RT, exprimiert in den Sf9-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung der beiden optimierten, standardisierten und entwickelten gemultiplexten einstufigen RT-qPCR-Kits zusammen mit den Reaktionskomponenten. Jede einzelne Multiplex-Reaktion besteht aus dNTPs, einer Puffermischung, einer Enzymmischung, einer gemultiplexten Primermischung und der zu testenden synthetischen RNA-Vorlage. (A) Influenza A/B, SARS-CoV-2-Kit und (B) MERS ORF1a/upE, SARS-CoV-2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Die Amplifikationskurven und die Nachweisgrenze für Influenza A/B und SARS-CoV2 Multiplex-einstufiges RT-qPCR-Kit. Die Amplifikationskurven der gemultiplexten RT-qPCR wurden unter Verwendung einer synthetischen RNA-Mischung mit 10-facher serieller Verdünnung (10 bis 105 Kopien/μL) mit allen Zielen (A) Influenza A, (C) Influenza B und (E) SARS-CoV-2 durchgeführt. Die Reaktionen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt, wobei ein Replikat als Beispiel gezeigt wurde. Die Nachweisgrenze für (B) Influenza A, (D) Influenza B und (F) SARS-CoV-2 wurde bestimmt, indem der Mittelwert von drei repliziertenCt-Werten gegen die logarithmische Kopienzahl aufgetragen wurde. Das Bestimmtheitsmaß (R2) und die Gleichung der linearen Regressionskurve wurden berechnet und in jedem Panel dargestellt. Die Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung zwischen drei Replikationen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Die Amplifikationskurven und die Nachweisgrenze für MERS ORF1a/upE und SARS-CoV2 Multiplex-einstufiges RT-qPCR-Kit. Die Amplifikationskurven der gemultiplexten RT-qPCR wurden unter Verwendung einer synthetischen RNA-Mischung mit 10-fachen seriellen Verdünnungen (10 bis 105 Kopien/μL) mit allen Zielen (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE und (E) SARS-Cov-2 durchgeführt. Die Reaktionen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt, wobei ein Replikat als Beispiel gezeigt wurde. Die Nachweisgrenze für (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE und (F) SARS-CoV-2 wurde bestimmt, indem der Mittelwert von drei replizierten Ct-Werten gegen die logarithmische Kopienzahl aufgetragen wurde. Das Bestimmtheitsmaß (R2) und die Gleichung der linearen Regressionskurve wurden berechnet und in jedem Panel dargestellt. Die Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung zwischen drei Replikationen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Die Liste der Komponenten für den Taq-Polymerase-Lysepuffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Taq-Polymerase-Reinigungspuffer. Die Liste der Pufferkomponenten, die für die Zwei-Säulen-Aufreinigung der Taq-DNA-Polymerase benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Taq-Polymerase-Speicherpuffer. Die Liste der Pufferkomponenten, die für die Dialyse der Taq-DNA-Polymerase nach der Reinigung erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Die Liste der Komponenten für den MMLV-RT-Lysepuffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: MMLV-RT-Aufreinigungspuffer. Die Liste der Pufferkomponenten, die für die Zwei-Säulen-Aufreinigung von MMLV-RT benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 6: MMLV-RT-Speicherpuffer. Die Liste der Pufferkomponenten, die für die Dialyse von MMLV-RT nach der Reinigung erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 7: Informationen zu Primern und Sonden. Die Sequenzinformationen der Primer und Sonden, die für jede gemultiplexte Primermischung benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Aufgrund der hohen Infektions- und Sterblichkeitsraten aufgrund der Ausbreitung gängiger Atemwegsviren wie SARS-CoV-2, Influenza A/B und MERS-CoV-Varianten 12,19,20 besteht weltweit eine hohe wirtschaftliche Belastung für das Gesundheitssystem. Motiviert durch das Verantwortungsbewusstsein, diese Belastung zu verringern, erkannten wir die Notwendigkeit eines schnellen, präzisen und zugänglichen diagnostischen Assays wie RT-qPCR, um zwischen diesen häufigen Viren in einem Test zu unterscheiden. Aufgrund des Multiplex-Charakters der qRT-PCR ist es möglich, SARS-CoV-2 zu diagnostizieren und von anderen Atemwegsviren wie Influenza-A/B- und MERS-CoV-Viren zu unterscheiden. Schließlich kann eine bessere und präzisere Behandlung von Patienten unter Verwendung des vorliegenden Multiplex-Assays46 erreicht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie die Realisierung eines hauseigenen einstufigen Multiplex-RT-qPCR-Tests beschreibt, der auf zwei verschiedene Kombinationen abzielen kann. Jede Kombination setzt sich aus drei verschiedenen Atemwegsviren zusammen, um die Ausbreitung solcher infektiösen Viren einzudämmen und die wirtschaftliche Belastung des Gesundheitssystems zu verringern.

Das vorliegende Multiplex-RT-qPCR-Kit kann auf zwei Kombinationen gängiger Atemwegsviren (SARS-CoV-2, Influenza A/B) und (SARS-CoV-2, MERS UpE/ORF1a) abzielen. Das beschriebene Protokoll ist einfach, unkompliziert zu befolgen und viel billiger als die kommerziell erhältlichen einstufigen RT-qPCR-Kits. Ein weiterer Vorteil waren die Multiplex-Eigenschaften des Kits, das durch die Verwendung verschiedener Sonden- und Primerkombinationen auf mehrere virale genetische Ziele abzielen kann. So ermöglichen die Vielseitigkeit und Einfachheit des Kits eine unkomplizierte Implementierung in ressourcenbegrenzten Umgebungen. Außerdem eignet sich das Kit für umfangreiche Tests, die zu einer genauen und präzisen Diagnose führen, die dazu beitragen kann, die Ausbreitung und Koinfektion mehrerer Atemwegsviren zu begrenzen.

Vorläufige Analysen wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass alle Ziele erfolgreich und mit hoher Genauigkeit amplifiziert wurden, um die Bildung unspezifischer Produkte zu begrenzen. Zunächst haben wir mehrere Optimierungsrunden für die Komponenten der Puffermischung und ihre jeweiligen Konzentrationen in der Puffermischung durchlaufen. Zweitens haben wir die Primer und ihre entsprechenden Konzentrationen sowohl in der Primermischung als auch in der PCR-Reaktion optimiert. Drittens haben wir die Zusammensetzung der Enzymmischung optimiert, um ihre Aktivität zu maximieren und die hemmende Wirkung von MMLV-RT auf die Aktivität der Taq-Polymerase47 zu minimieren. Viertens haben wir die Bedingungen für den Temperaturwechsel unter Berücksichtigung der Einschränkungen für die thermische Stabilität beider Enzyme optimiert. Unter Berücksichtigung der oben genannten Verbesserungen war die hier vorgestellte optimierte Version unseres Multiplex-RT-qPCR-Kits in der Lage, bis zu 10 RNA-Kopien/-Reaktionen mit hoher Spezifität, Sensitivität und Reproduzierbarkeit zu detektieren.

Einige Vorsichtsmaßnahmen müssen beachtet werden, um die hohe Effizienz und erfolgreiche Implementierung des Multiplex-RT-qPCR-Assays zu gewährleisten, Inhibitoren zu vermeiden und Pipettierfehler zu vermeiden. Da jede Einrichtung in ihrer Einrichtung und Instrumentierung einzigartig ist, sind hier einige Schritte, die bei der Erstellung eines solchen Kits hilfreich sein können: Erstens müssen immer Handschuhe getragen werden, um das Vorhandensein von Kontaminationen und PCR-Inhibitoren zu vermeiden. Zweitens: Stellen Sie sicher, dass Sie aerosolbeständige Filterspitzen verwenden und eine kalibrierte Pipette verwenden. Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie Wasser in PCR-Qualität verwenden. Die Verwendung einer No-Template-Kontrolle hilft bei der Überprüfung des Vorhandenseins einer Kontamination. Es ist wichtig zu beachten, dass der Mastermix für alle Replikate vorbereitet werden muss, um mögliche Kontaminationen und Pipettierabweichungen zu vermeiden. Andere Tipps zur Fehlerbehebung müssen berücksichtigt werden, um die Sondenqualität zu erhalten, wie z. B. das Aliquotieren des Rohmaterials und das Vermeiden der Verwendung von Wasser zur Verdünnung. Es ist wichtig, die Empfehlungen des Herstellers zur Lagerung und Verdünnung des verwendeten Primers und der Sonde zu befolgen. Daher werden diese einfachen Tipps dazu beitragen, den Erfolg des Multiplex-RT-qPCR-Assays aufrechtzuerhalten und seine hohe Effizienz zu gewährleisten.

Obwohl die in dieser Forschung entwickelten Multiplex-RT-qPCR-Assays gute Ergebnisse gezeigt haben, wenn sie mit den synthetischen viralen RNAs getestet wurden, muss ihre Wirksamkeit in einem realen klinischen Umfeld noch evaluiert und validiert werden. Leider ist es aufgrund der Knappheit klinischer Proben schwierig, die Spezifität und Empfindlichkeit des Assays für die in dieser Untersuchung enthaltenen Viren zu bestimmen. Es ist jedoch erwähnenswert, dass die LOD (Limit of Detection), die die Mindestanzahl von Kopien angibt, die in 100% der Proben nachgewiesen werden können, durch eine statistisch nachgewiesene lineare Regression ermittelt wurde. Dies bietet Potenzial für die klinische Diagnose und ist eine wichtige Erkenntnis der Forschung.

Ein hauseigener Multiplex-einstufiger RT-qPCR-Assay, der sondenbasiert ist, wurde in dieser Studie erfolgreich entwickelt und mit hoher Wirksamkeit validiert. SARS-CoV-2 kann, wie oben erläutert, mit hoher Effizienz und Zuverlässigkeit in nur einem Reagenzglas leicht nachgewiesen und von anderen gängigen Atemwegsviren unterschieden werden. Daher wird die Abhängigkeit von dieser Multiplex-Funktion dazu beitragen, den Durchsatz der Diagnose zu erhöhen und Zeit, Kosten und Proben im Vergleich zu anderen Testansätzen und der Singleplex-PCR zu sparen. Alles in allem ist die Wahrscheinlichkeit, dass Atemwegsviren zusammen zirkulieren, hoch und diese Multiplex-Ein-Schritt-RT-qPCR wird sehr vorteilhaft sein.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der King Abdullah University of Science and Technology durch eine Grundfinanzierung und die National Term Grand Challenge (NTGC) an S.M.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690

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References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2023).
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

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Diesen Monat in JoVE Ausgabe 201 Taq-Polymerase MMLV-RT Proteinexpression COVID-19 SARS-CoV-2 Influenza A/B MERS-CoV Multiplex RT-qPCR
Entwicklung von Multiplex-Real-Time-RT-qPCR-Assays zum Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A/B und MERS-CoV
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Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy,… More

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).

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