Quantificazione della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente in un modello di sferoide tumorale: applicazione per la scoperta di farmaci
Summary
Qui, presentiamo un metodo per identificare i composti che modulano il meccanismo ADCC, un importante meccanismo di uccisione delle cellule tumorali degli anticorpi antitumorali. L’effetto citotossico delle cellule NK è misurato negli sferoidi delle cellule del cancro al seno in presenza di Trastuzumab. L’analisi delle immagini identifica le cellule killer vive e morte e le cellule bersaglio negli sferoidi.
Abstract
L’immunoterapia basata su anticorpi monoclonali che ha come bersaglio gli antigeni tumorali è ora un pilastro del trattamento del cancro. Uno dei meccanismi d’azione clinicamente rilevanti degli anticorpi è la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC), in cui l’anticorpo si lega alle cellule tumorali e impegna la componente cellulare del sistema immunitario, ad esempio le cellule natural killer (NK), per uccidere le cellule tumorali. L’efficacia di queste terapie potrebbe essere migliorata identificando composti adiuvanti che aumentano la sensibilità delle cellule tumorali o la potenza delle cellule immunitarie. Inoltre, interazioni farmacologiche non scoperte in pazienti oncologici co-medicati per condizioni pregresse o sintomi associati al cancro possono determinare il successo della terapia anticorpale; Pertanto, tali interazioni farmacologiche indesiderate devono essere eliminate. Con questi obiettivi in mente, abbiamo creato un modello di ADCC per il cancro e descriviamo qui un semplice protocollo per trovare farmaci modulanti l’ADCC. Poiché i modelli 3D come gli sferoidi delle cellule tumorali sono superiori alle colture 2D nel predire le risposte in vivo dei tumori alle terapie antitumorali, le co-colture sferoidi di cellule di carcinoma mammario HER2+ JIMT-1 che esprimono EGFP e NK92. Le linee cellulari CD16 sono state create e indotte con Trastuzumab, un anticorpo monoclonale clinicamente approvato contro il carcinoma mammario HER2-positivo. Gli sferoidi JIMT-1 sono stati lasciati formare in piastre a 96 pozzetti con fondo a U repellenti per le cellule. Il giorno 3 sono state aggiunte cellule NK e Trastuzumab. Gli sferoidi sono stati poi colorati con Annexin V-Alexa 647 per misurare la morte cellulare apoptotica, che è stata quantificata nella zona periferica degli sferoidi con un microscopio automatizzato. L’applicabilità del nostro test per identificare le molecole modulanti l’ADCC è dimostrata dimostrando che Sunitinib, un inibitore della tirosin-chinasi approvato dalla FDA contro il cancro metastatico, abolisce quasi completamente l’ADCC. La generazione degli sferoidi e le pipeline di acquisizione e analisi delle immagini sono compatibili con lo screening ad alto rendimento per i composti modulanti ADCC negli sferoidi delle cellule tumorali.
Introduction
Gli sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) sono modelli tridimensionali (3D) ampiamente utilizzati che si formano a causa della tendenza delle cellule aderenti ad aggregarsi e rappresentano uno strumento importante per ottenere informazioni meccanicistiche sulla biologia delle cellule tumorali. Possono essere generati da un’ampia gamma di tipi di cellule mediante numerose tecniche, come le colture 3D a base liquida e basata su scaffold1. Il loro principale vantaggio rispetto ai modelli 2D monostrato è che ricapitolano le caratteristiche principali dei tumori in vivo , vale a dire l’organizzazione strutturale e l’ipossia, imitando il comportamento biologico delle cellule tumorali, in particolare i meccanismi che portano alla fuga terapeutica e alla resistenza ai farmaci2. Pertanto, poiché gli MCTS possono migliorare la prevedibilità della tossicità e della sensibilità ai farmaci, sono ampiamente utilizzati per studiare i tumori in 3D e potrebbero migliorare lo sviluppo di farmaci efficaci per diversi tipi di cancro3.
Per studiare qualsiasi malattia, c’è un bisogno critico di modelli pertinenti e convenienti. La creazione di modelli per gli studi di immunologia del cancro è impegnativa perché il sistema immunitario è costituito da più tipi di cellule. Ogni tipo di cellula ha diversi sottotipi e un ampio spettro di stati di attivazione. Questi diversi tipi di cellule immunitarie interagiscono con le cellule tumorali e altri componenti tumorali, influenzando in ultima analisi l’esito della malattia. I metodi di coltura cellulare in vitro 2D non riescono a ricapitolare queste complesse interazioni cellulari, in quanto mancano di traducibilità e non sono in grado di prevedere l’azione di un farmaco a livello di sistema (ad esempio, nei tessuti)4,5. Inoltre, i modelli murini hanno anche gravi limitazioni a causa delle differenze fondamentali tra il sistema immunitario umano e quello murino. I sistemi di coltura 3D possono, quindi, colmare le attuali lacune nei modelli disponibili, fornendo un metodo alternativo e migliorando la nostra comprensione dell’immunologia del cancro6. In particolare, i modelli sferoidi potrebbero essere utilizzati per testare le immunoterapie, principalmente per valutare l’efficienza dello screening farmacologico e degli anticorpi terapeutici per migliorare l’infiltrazione delle cellule immunitarie e gli effetti antitumorali contro i bersagli sferoidi7. Inoltre, è stato ampiamente dimostrato il potenziale degli MCTS composti da cellule in diversi stati metabolici e proliferativi per studiare le interazioni tra cellule dello stroma (ad esempio, linfociti, macrofagi, fibroblasti) e cellule tumorali e per lo sviluppo di nuove strategie antitumorali8. Quindi, c’è una necessità vitale di corroborare piattaforme predittive e accurate al fine di potenziare il processo di test farmacologico, tenendo conto della fisiopatologia del microambiente tumorale.
Il carcinoma mammario (BC) è il tumore più frequente diagnosticato in tutto il mondo nelle donne. La classificazione clinica di questa malattia eterogenea si basa sulla presenza di recettori transmembrana, ad esempio i recettori degli estrogeni (ER) e del progesterone (PR) (collettivamente chiamati recettori ormonali, HR), insieme alla sovraespressione o all’amplificazione della proteina/oncogene del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2). Sulla base dell’espressione immunoistochimica di questi recettori, sono comunemente riconosciuti quattro sottotipi: carcinoma mammario luminale A (HR+/HER2-), luminale B (HR+/HER2+), HER2-positivo (HR-/HER2+) e carcinoma mammario triplo negativo (HR-/HER2-). Il gruppo HER2+ costituisce il 10-15% dei casi di BC ed è caratterizzato da un’elevata espressione di HER2 con assenza di ER e PR, ha una prognosi peggiore rispetto ai tumori luminali e richiede farmaci specifici diretti contro la proteina HER2/neu9.
Lo sviluppo del BC è un processo in più fasi e una diagnosi precoce è essenziale per un trattamento efficace della malattia10. Tuttavia, nonostante siano emerse di recente opzioni di trattamento personalizzate per la BC (ad esempio, terapie endocrine e anticorpali anti-HER2), la BC continua a rappresentare una sfida per gli oncologi. Proprio come la chirurgia, la chemioterapia e la radioterapia, anche queste terapie personalizzate possono avere gravi effetti avversi e i pazienti possono sviluppare resistenza a questi agenti, rendendo difficile determinare la strategia migliore a lungo termine11,12. Pertanto, una migliore comprensione dell’interazione tra il tumore e il suo microambiente è essenziale e dovrebbe fornire nuove direzioni per lo sviluppo di nuovi trattamenti che tengano conto delle specificità dei diversi sottotipi di BC13. Una nuova ondata di immunoterapie, come i coniugati farmaco-anticorpale, le terapie adottive con cellule T, i vaccini e i nuovi anticorpi monoclonali diretti a HER2 (mAb) sono in fase di studio in un’ampia popolazione di pazienti con tumori che esprimono HER214.
Trastuzumab, ad esempio, rappresenta una modalità di trattamento efficiente per HER2+ BC. Come parte del suo meccanismo d’azione, Trastuzumab media le attività dipendenti dal recettore gamma cristallizzabile (FcγR) del frammento. I FčγR si distinguono per la loro affinità per il frammento Fc e per la risposta immunitaria che avviano. L’attivazione di FcγRIIIa (CD16A) sulle cellule natural killer (NK) è fondamentale per mediare la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC), mentre l’attivazione di FcγRIIa (CD32A) e FcγRIIIa sui macrofagi induce la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente (ADCP)15. Studi su modelli animali hanno mostrato che i topi privi dei recettori FcγRI (CD64) e FcγRIII (CD16) non erano in grado di avviare risposte immunitarie protettive contro antigeni tumore-specifici, rivelando che l’ADCC è probabilmente un importante meccanismo d’azione per l’anticorpo monoclonale Trastuzumab16.
Poiché le cellule NK ricorrono agli Abs legati alle cellule tumorali per l’uccisione delle cellule tumorali da parte dell’ADCC, l’espressione dei recettori Fc è fondamentale per un trattamento efficace con Trastuzumab17 (Figura 1). Inoltre, la loro azione è efficacemente bilanciata da una stimolazione di recettori attivanti e inibitori, ad esempio i recettori Killer-cell immunoglobulin-like (KIR)18.
Figura 1. Meccanismo dell’ADCC nel contesto di una risposta antitumorale. Il recettore Fcγ di una cellula natural killer (NK) riconosce la regione Fc di un anticorpo, che in precedenza si era legato a un antigene di superficie su una cellula tumorale. Questa sinapsi immunologica porta alla degranulazione della cellula NK che rilascia mediatori citotossici come i granzimi e la perforina. Queste molecole contribuiscono alla formazione dei pori nella membrana cellulare e attivano le vie apoptotiche causando la morte cellulare programmata della cellula bersaglio (immagine creata con Biorender.com). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Lo sviluppo dell’immunoterapia per HER2+ BC rappresenta un campo in evoluzione. In questo caso, si dovrebbero considerare le interazioni tra i vari componenti del sistema immunitario. Inoltre, pubblicazioni precedenti hanno ampiamente testato terapie combinate che coinvolgono tutti i tipi di terapie tradizionali, immunitarie o cellulari per identificare combinazioni sinergiche19.
Diversi modelli 3D di HER2+ BC sono stati precedentemente utilizzati per la scoperta di farmaci. Ad esempio, Balalaeva et al. hanno utilizzato sferoidi SKBR-3 che sovraesprimono HER2 per valutare la citotossicità dell’immunotossina mirata a HER2 4D5scFv-PE4020. In un altro studio, è stato creato un sistema di coltura HER2+ BC basato su Matrigel 3D per misurare la crescita cellulare in risposta a Trastuzumab e agenti endocrini21. Questi studi evidenziano l’importanza dei modelli di sferoidi tumorali di cellule tumorali sovraesprimenti HER2 nel rappresentare una strategia efficace per migliorare clinicamente le risposte terapeutiche22.
Il nostro gruppo ha precedentemente identificato Sunitinib, un inibitore multitarget della tirosin-chinasi, come inibitore dell’ADCC dipendente da trastuzumab nelle cellule JIMT-1 HER2+ BC in un test di coltura 2D. Lo studio ha rivelato che Sunitinib induce l’autofagia e compromette la funzione di uccisione delle cellule NK, riducendo l’espressione di HER2 e migliorando l’adesione superficiale delle cellule JIMT-117.
Qui abbiamo stabilito un nuovo modello 3D di ADCC sferoidi (cellule tumorali NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP) da utilizzare per applicazioni di screening ad alto rendimento e, al fine di convalidare i risultati sopra menzionati, Sunitinib è stato utilizzato come composto modello. In primo luogo, abbiamo generato cellule JIMT-1 esprimenti EGFP17 e abbiamo fatto crescere sferoidi da queste cellule. L’ADCC è stato indotto da cellule NK insieme a Trastuzumab e gli sferoidi sono stati mantenuti in coltura in presenza o assenza di composti in esame per 24 ore (Figura 2). La quantificazione dell’ADCC si basa sulla rilevazione della morte delle cellule tumorali apoptotiche (colorazione con annessina V) utilizzando un sistema di analisi ad alto contenuto.
Figura 2. ADCC in un sistema di co-coltura di sferoidi 3D. Le nostre impostazioni sperimentali si basano su un sistema di sferoidi 3D in grado di modellare in modo più accurato il microambiente in vivo rispetto ai modelli 2D. Le cellule di carcinoma mammario JIMT-1 EGFP sono state seminate su un fondo concavo repellente per formare un ammasso cellulare di forma rotonda, chiamato sferoide. L’ADCC è stato quindi avviato con l’aggiunta di NK92. Cellule natural killer CD16 (rapporto E:T = 20:1) e un anticorpo monoclonale anti-HER2, Trastuzumab. Il modello sperimentale si è dimostrato efficiente e facilmente applicabile per l’identificazione di composti modificanti ADCC (immagine creata con Biorender.com). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Abbiamo dimostrato che l’acquisizione di dati in questo modo può essere effettuata in tempo reale ed è statisticamente robusta per l’uso nello screening ad alto contenuto nella scoperta di farmaci antitumorali. È importante sottolineare che questo modello consente una convalida estesa di un insieme più ampio di composti e può essere applicato a diversi saggi di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante i significativi miglioramenti nel trattamento della BC negli ultimi decenni, i pazienti sviluppano ancora regolarmente resistenza ai farmaci o sperimentano effetti collaterali negativi24. L’elevata morbilità e mortalità legate alla BC richiede una continua indagine sui meccanismi molecolari sottostanti, così come robuste piattaforme di screening per identificare nuove molecole utilizzabili per lo sviluppo terapeutico25. Queste strategie richiedono saggi traduz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LV ha ricevuto finanziamenti dall’Ufficio nazionale per la ricerca, lo sviluppo e l’innovazione sovvenzioni GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS”, GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 e K147482. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dalla rete di ricerca ungherese HUN-REN. Le cellule CD16.176V.NK-92 sono state ottenute dal Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philadelphia, PA, per conto di Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), sono protetti da brevetti in tutto il mondo e sono stati concessi in licenza da Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Gli autori sono grati a György Vereb e Árpád Szöőr per il loro aiuto con l’uso della linea cellulare NK-92 e del TR-F(ab’)2, e per la consulenza tecnica.
Materials
| 96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | LLC 6055302 | for spheroids measurements |
| 96-well tissue culture plates | TPP | 92096 | for cell seeding |
| α-MEM medium | Sigma | M8042 | in NK medium |
| Agarose | Sigma | A9539 | for spheroids seeding |
| Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate | Invitrogen-ThermoFisher Scientific | A23204 | for apoptosis measurement with HCS |
| CD16.176 V.NK-92 cells | Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA) | ATCC CRL-2407 | for cell culture |
| Cell Tracker Blue | Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) | C2110 | for staining of NK cells |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT1-EGFP medium |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | for statistical analysis | |
| Harmony software | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | for HCA | |
| IL-2 | Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary | PHC0026 | in NK medium |
| Insulin (Humulin R) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1-EGFP medium |
| JIMT-1 breast cancer cells | for cell culture | ||
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | HH14001000 | for HCA |
| PBS (Posphate buffered saline) | Lonza | BE17-517Q | for washing the cells |
| Penicillin-Streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP | Invitrogen, (Prof. József T zsér, University of Debrecen) |
for JIMT-1-EGFP cell line | |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Sunitinib malate | SigmaAldrich | PZ0012 | for treatments |
| Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody) | Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary | NDC-63459-303-43 | for treatments |
| Trastuzumab-F(ab')2 | Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször |
Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen | for treatments |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Biosera | LM-T1706 | for cells detachment |
Riferimenti
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