Summary
We bieden een protocol voor een experimenteel endotoxemisch shockmodel bij varkens door infusie van lipopolysaccharide.
Abstract
Sepsis en septische shock komen vaak voor bij patiënten die op de intensive care (ICU's) worden behandeld en behoren tot de belangrijkste doodsoorzaken bij deze patiënten. Het wordt veroorzaakt door een ontregelde immuunrespons op een infectie. Zelfs met een geoptimaliseerde behandeling blijven de sterftecijfers hoog, waardoor verdere inzichten in de pathofysiologie en nieuwe behandelingsopties noodzakelijk zijn. Lipopolysaccharide (LPS) is een bestanddeel van het celmembraan van gramnegatieve bacteriën, die vaak verantwoordelijk zijn voor infecties die sepsis en septische shock veroorzaken.
De ernst en hoge mortaliteit van sepsis en septische shock maken gestandaardiseerde experimentele studies bij mensen onmogelijk. Er is dus een diermodel nodig voor verdere studies. Het varken is bijzonder geschikt voor dit doel omdat het qua anatomie, fysiologie en grootte sterk op mensen lijkt.
Dit protocol biedt een experimenteel model voor endotoxemische shock bij varkens door LPS-infusie. We waren in staat om op betrouwbare wijze veranderingen te induceren die vaak worden waargenomen bij patiënten met septische shock, waaronder hemodynamische instabiliteit, respiratoire insufficiëntie en acidose. Dit zal onderzoekers in staat stellen om waardevol inzicht te krijgen in deze zeer relevante aandoening en nieuwe therapeutische benaderingen in een experimentele setting te evalueren.
Introduction
Sepsis en septische shock behoren tot de belangrijkste doodsoorzaken bij patiënten die een intensive care-behandeling ondergaan 1,2,3. Sepsis ontstaat wanneer een infectie een ontregelde immuunrespons veroorzaakt, wat resulteert in multi-orgaanfalen. Het wordt gekenmerkt door levensbedreigende symptomen, waaronder hemodynamische instabiliteit, ademnood, lever- en nierfalen, evenals cognitieve stoornissen 4,5. Septische shock vertegenwoordigt een subset van sepsis met bijzonder ernstige symptomen die de mortaliteit aanzienlijk verhogen. Deze symptomen zijn onder meer aanhoudende hypotensie waarvoor vasopressortherapie nodig is en een serumlactaatspiegel van meer dan 2 mmol∙L-1 4,5. De sterftecijfers bij patiënten met septische shock zijn geschat op 40%, zelfs met ziekenhuisbehandeling 1,3,5.
Gramnegatieve bacteriën, zoals Pseudomonas en Escherichia coli, veroorzaken vaak infecties die deze ontregelde immuunresponsveroorzaken4. De onderliggende pathofysiologische mechanismen zijn complex en nog niet volledig begrepen. Een goed beschreven aspect betreft de activering van Toll-achtige receptoren op immuuncellen door pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's), wat leidt tot het vrijkomen van cytokines zoals tumornecrosefactor-alfa (TNFα) of Interleukine 1 (IL 1)4. Een van deze PAMP's is lipopolysaccharide (LPS), dat een onderdeel vormt van het celmembraan in gramnegatieve bacteriën6. LPS is in diermodellen gebruikt om endotoxemie en endotoxemische shock te induceren 7,8.
Diermodellen bieden een gecontroleerde en gestandaardiseerde setting om nieuwe behandelingsstrategieën te ontwikkelen en te onderzoeken. Vanwege de vergelijkbare anatomie, immunologische fysiologie en vergelijkbare hemodynamische parameters is het varkensmodel bijzonder geschikt voor het bestuderen van de effecten van endotoxemische shock 9,10. Bovendien kan standaard medische apparatuur die vaak bij menselijke patiënten wordt gebruikt, gemakkelijk bij varkens worden toegepast vanwege de vergelijkbare grootte van hun luchtwegen en bloedvaten, waardoor instrumentatie en hemodynamische monitoring worden vergemakkelijkt.
Met dit protocol bieden we een experimenteel model voor endotoxemische shock bij varkens door intraveneus toedienen van LPS afgeleid van E. coli. Om de effecten te monitoren, hebben we hemodynamische en pulmonale parameters gemeten, waaronder arteriële bloeddruk, hartslag, perifere zuurstofverzadiging, pulmonale arteriële druk en luchtwegdruk. Om de invloed van endotoxemie op de cerebrale zuurstoftoevoer te evalueren, gebruikten we nabij-infraroodspectrometrie (NIRS). Met deze methode kan de cerebrale zuurstofverzadiging worden geëvalueerd via een zelfklevende elektrode die op het voorhoofd wordt aangebracht11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten in dit protocol zijn goedgekeurd door het Staats- en Institutioneel Comité voor Dierenverzorging (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Duitsland, TVA G21-1-080). De experimenten zijn uitgevoerd volgens de ARRIVE-richtlijnen. Voor dit onderzoek werden zes gezonde mannelijke Duitse landrasvarkens van 2-3 maanden oud en met een gewicht van 30-35 kg gebruikt. De tijdlijn van het experiment is samengevat in figuur 1. De details met betrekking tot alle materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
Figuur 1: Experimentele tijdlijn. Baseline gezondheidsmetingen werden uitgevoerd na de voorbereiding van het dier en een stabilisatieperiode van 30 minuten. Endotoxemie werd geïnduceerd door LPS-injectie gedurende 30 minuten en metingen van 0 uur werden uitgevoerd na nog eens 30 minuten; Daarna werden de uurlijkse metingen gedurende 4 uur voortgezet. Afkortingen: BLH = baseline gezond; LPS = lipopolysaccharide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Voorbereiding van dieren
- Houd de dieren zo lang mogelijk in hun gebruikelijke omgeving om stress tot een minimum te beperken. Houd voedsel achter gedurende 6 uur voorafgaand aan de toediening van anesthesie, terwijl u vrije toegang tot water toestaat.
- Verdoof de dieren met een intramusculaire injectie van azaperon (3 mg∙kg-1) en midazolam (0,5 mg kg-1) terwijl ze nog in hun normale omgeving zijn.
- Zodra de sedatie in werking treedt, wat meestal binnen ongeveer 15-20 minuten na toediening gebeurt, transporteert u de varkens naar het laboratorium.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat continue sedatie tijdens de overdracht wordt gehandhaafd; Afhankelijk van de regionale wetgever kan dit het permanente toezicht van een dierenarts vereisen. - Let goed op het handhaven van de normale lichaamstemperatuur van de varkens (~38 °C) tijdens het transport. Denk bijvoorbeeld aan het afdekken van het dier met een deken om onderkoeling te voorkomen.
OPMERKING: Het is belangrijk om de transporttijd te beperken tot het niet overschrijden van de duur van de sedatie, die gewoonlijk varieert van 30 minuten tot 60 minuten. - Breng na desinfectie een intraveneuze toegang tot stand door een katheter van 22 G in de oorader in te brengen. Voordat u verder gaat met een verdere beweging van het varken of het inleiden van anesthesie, moet u ervoor zorgen dat de katheter stevig is bevestigd om ontwrichting door plotselinge bewegingen te voorkomen.
- Bewaak continu de perifere zuurstofverzadiging met behulp van een sensor die aan de staart of het oor is geklemd.
2. Anesthesie en mechanische beademing
- Dien intraveneuze fentanyl (4 μg kg-1) en propofol (3 mg kg-1) toe om anesthesie te induceren.
- Leg het varken in rugligging.
- Dien atracurium (0,5 mg kg-1) toe als spierverslapper en start onmiddellijk niet-invasieve beademing met behulp van een hondenbeademingsmasker. Plaats het masker over de snuit en oefen stevige druk uit met de duimen terwijl u de onderkaak naar voren trekt met de middel-/ringvinger. Stel het beademingsapparaat in op de volgende parameters: inspiratoire zuurstoffractie (FiO2 ) = 100%, teugvolume = 6-8 ml kg-1, Positive End Expiratoire Druk (PEEP) = 5 mbar, piek inademingsdruk ≤ 20 mbar, ademhalingsfrequentie = 18-20 min-1.
- Handhaaf de anesthesie door een continue infusie te starten van een uitgebalanceerde elektrolytoplossing (5 ml kg-1 h-1), fentanyl (10 μg kg-1 h-1) en propofol (6 mg kg-1 h-1).
- Voer endotracheale intubatie uit met behulp van een standaard endotracheale tube (ID 6-7 mm), een voerdraad en een laryngoscoop uitgerust met een Macintosh-mes (maat 4).
- Laat een assistent de mond openen en de tong aan de linkerkant houden.
- Plaats het Macintosh-mes totdat de epiglottis zichtbaar is. Til vervolgens de laryngoscoop omhoog om de epiglottis ventraal te bewegen en de stembanden te visualiseren. Af en toe kan de epiglottis aan het zachte gehemelte blijven kleven; Mobiliseer het in dit geval door zachtjes zijwaarts te vegen met de buis of een bougie.
- Steek de endotracheale tube voorzichtig door de stembanden en verwijder de inductor. Als u problemen ondervindt, probeer dan de buis te draaien zonder overmatige kracht uit te oefenen. Gebruik indien nodig een kleinere buis. Zodra de slang op zijn plaats zit, blaast u de manchet op met 10 ml lucht.
- Sluit de endotracheale tube aan op de beademingsmachine en start de beademing. Bevestig de juiste positionering van de buis door eind-expiratoire CO2 te detecteren en bilaterale auscultatie uit te voeren. Gebruik de volgende ventilatie-instellingen: FiO2 = 40%, teugvolume = 6-8 ml kg-1, PEEP = 5 mbar, inademings-uitademingsverhouding = 1:2, ademhalingsfrequentie = aangepast om een CO2-niveau aan het einde van het getij van <45 mmHg te bereiken, meestal 30-40 min-1 .
NOTITIE: Als de buis verkeerd in de slokdarm is geplaatst, blaast de lucht de maag op, waardoor een zichtbare uitstulping ontstaat. Verwijder in dergelijke gevallen onmiddellijk de buis, dien niet-invasieve beademing toe gedurende 1-2 minuten en plaats de buis op de juiste manier terug. - Breng een maagsonde in om reflux of braken te voorkomen. Als het inbrengen een uitdaging is, gebruik dan de laryngoscoop om een beter zicht op de slokdarmingang te krijgen.
3. Instrumentatie
- Plaats een arteriële en een centrale veneuze lijn in respectievelijk de dijbeenslagader en ader voor hemodynamische monitoring en intraveneuze volumetherapie.
- Gebruik verband om de achterpoten in te trekken en vast te zetten, zodat u beter bij de dijbeenvaten kunt.
- Bereid alle benodigde materialen voor voorafgaand aan de instrumentatie. Vul alle katheters met een zoutoplossing en zorg voor gemakkelijke toegang tot draden en katheters om de noodzaak van meerdere katheterisatiepogingen en onnodig bloedverlies tot een minimum te beperken.
- Breng een alcoholisch ontsmettingsmiddel aan op de liesstreek en veeg het af met een steriel wattenstaafje. Herhaal dit proces twee keer. Breng het ontsmettingsmiddel opnieuw aan zonder af te vegen en wacht 3 minuten. Plaats een steriel geraamd laken over de liesstreek.
- Gebruik echografie om de femurbloedvaten te identificeren. Gebruik een in-plane echogeleide Seldinger-techniek voor katheterisatie om weefselbeschadiging en bloedverlies tot een minimum te beperken.
- Visualiseer de dijbeenslagader in de lengterichting. Prik in de slagader met een spuit die aan de naald is bevestigd voor continue aspiratie. Helderrood, pulserend bloed bevestigt arteriële punctie. Verwijder de spuit en plaats de voorbereide draad. Verwijder de naald terwijl u de draad op zijn plaats laat.
- Herhaal dezelfde procedure voor de dijbeenader . Veneuze punctie wordt bevestigd door langzaam stromend, donkerrood bloed.
- Bevestig de juiste positionering van beide draden door beide femurvaten te visualiseren met behulp van echografie.
- Gebruik de techniek van Seldinger om eerst de arteriële introducerschede in te brengen, gevolgd door de veneuze inbrengschede. Bevestig de juiste positionering door middel van bloedgasanalyse van bloedmonsters die uit de twee lijnen zijn genomen.
- Zorg ervoor dat bloed uit alle lijnen kan worden opgezogen. Spoel alle leidingen door met een zoutoplossing om stolselvorming te voorkomen.
- Bevestig de lijnen stevig aan de huid met chirurgische hechtingen om ontwrichting te voorkomen.
- Sluit de arteriële en centrale veneuze lijnen aan op transducers voor het meten van hemodynamische parameters.
- Steek een PiCCO-katheter (Pulse Contour Cardiac Output) in de arteriële inbrenghuls en sluit deze aan op de arteriële druktransducer en de temperatuurinterfacekabel van de PiCCO-monitor.
- Sluit een Swan-Ganz-katheter aan op een transducer.
- Terwijl u continu de druk meet, brengt u de katheter in de centraal veneuze inbrenghuls. Blaas de ballon op na ongeveer 30 cm, wanneer een centraal veneuze drukcurve zichtbaar wordt.
- Beweeg de katheter langzaam naar voren terwijl u de drukcurve in de gaten houdt. Als de katheter de rechterhartkamer binnengaat, zoek dan naar een polscurve met een hoge systolische en lage diastolische waarde. Verdere doorstroming van de katheter zal resulteren in een consistente systolische waarde en een verhoogde diastolische waarde, wat wijst op plaatsing in de longslagader.
- Bevestig de katheter in deze positie (meestal tussen 50 en 70 cm). Sluit de injecteertemperatuursensor van het PiCCO-systeem aan op het proximale lumen van de Swan-Ganza-katheter.
- Scheer het voorhoofd van het varken en breng de zelfklevende sensorelektrode aan om de cerebrale regionale zuurstofverzadiging te meten.
- Laat het dier na anesthesie-inductie en instrumentatie 30 minuten stabiliseren of totdat de hemodynamische parameters zijn gestabiliseerd voordat u basismetingen uitvoert en endotoxemische shock induceert.
4. Schok inductie
NOTITIE: Draag bij het werken met LPS altijd handschoenen, een veiligheidsbril, een masker en een laboratoriumjas. Vermijd direct contact met LPS.
- Bereid een LPS-oplossing met een concentratie van 100 μg ml-1 door 5 mg LPS op te lossen in 50 ml 0,9% NaCl.
- Verkrijg hemodynamische basislijnmetingen onmiddellijk voordat de LPS-infusie wordt gestart.
- Dien een dosis LPS van 150 μg kg-1 toe gedurende 30 minuten (overeenkomend met een continue infusiesnelheid van 300 μg kg-1∙h-1 gedurende 30 minuten).
- Verlaag na 30 minuten de infusiesnelheid tot 15 μg∙kg-1∙h-1 voor de rest van het experiment.
- Bewaak continu hemodynamische parameters, waaronder arteriële en pulmonale arteriële bloeddruk, hartslag en ventilatieparameters. Houd de lichaamstemperatuur continu in de gaten om normothermie te behouden.
5. Behandeling van hemodynamische instabiliteit
- Wanneer de gemiddelde arteriële bloeddruk onder de 60 mmHg daalt, gebruik dan PiCCO om de cardiale index (CI), de Global End-Diastolic Volume Index (GEDI) en de extravasculaire longwaterindex (ELWI) te meten. Behandel de lage bloeddruk volgens de aanbevelingen in het stroomschema in figuur 2.
- Druk op de PiCCO-monitor op de thermodilutieknop (TD).
- Druk op de knop voor de ingang van de centrale veneuze druk (CVP) en voer de huidige CVP-waarde in.
- Druk op de Start-knop .
- Injecteer desgevraagd 10 ml koude zoutoplossing in de injecteertemperatuursensor die is aangesloten op de Swan-Ganz-katheter.
OPMERKING: Injecteer niets anders direct voor of tijdens de PiCCO-meting, omdat dit de meting in gevaar zou brengen.
- Na het verkrijgen van metingen voor CI, GEDI en ELWI, behandelt u hemodynamische instabiliteit volgens het stroomschema in figuur 2. Als volumelading wordt aanbevolen, laat dan snel 200 ml uitgebalanceerde elektrolytoplossing trekken. Als behandeling met catecholamine wordt aanbevolen, verhoog dan de infusiesnelheid van noradrenaline met 1 μg kg-1 h-1.
- Herhaal dit proces wanneer de gemiddelde arteriële bloeddruk onder de 60 mmHg daalt. Kies in geval van ernstige hemodynamische instabiliteit voor een snelle escalatie van de therapie.
Figuur 2: PiCCO-geleide therapie van hemodynamische instabiliteit. Na het verkrijgen van metingen voor CI, GEDI en ELWI, past u de behandeling toe volgens de tabel. Dit cijfer is overgenomen uit de PiCCO-gebruikershandleiding12. Afkortingen: PiCCO = pulse contour cardiac output; V+ = volume laden; kat = catecholamine-therapie; V- = volumevermindering; CI = cardiale index; GEDI = globale einddiastolische volume-index; ELWI = extravasculaire longwaterindex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Einde experiment en euthanasie
- Injecteer 0,5 mg fentanyl intraveneus. Wacht 5 min. Injecteer 200 mg propofol.
- Euthanaseer het varken met een snelle injectie van 40 ml 1 M kaliumchloride via de centrale veneuze lijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor deze studie werden zes gezonde mannelijke varkens van 2-3 maanden oud en met een gewicht van 30-35 kg verdoofd en kregen ze een infuus met lipopolysaccharide (LPS) om endotoxemie te induceren. Om de juiste dosering LPS te bepalen die nodig is om consequent shocksymptomen op te wekken, kregen de varkens verschillende inductiedoses LPS toegediend, variërend van 100 μg kg-1 tot 200 μg kg-1 gedurende een periode van 30 minuten, gevolgd door een onderhoudsdosis van 1/10 van de aanvangsdosis per uur voor de rest van het experiment. Alle dieren vertoonden kort na LPS-infusie tekenen van shock. Hemodynamische parameters werden bewaakt met behulp van het PiCCO-systeem. De dieren vertoonden een afname van de hartindex en een toename van de hartslag, wat wijst op hemodynamische instabiliteit tijdens de shocktoestand. De gemiddelde arteriële bloeddruk daalde na LPS-infusie, maar werd boven 60 mmHg gehouden door middel van vloeistofreanimatie of norepinefrine-infusie indien nodig (figuur 3). Longschade werd aangegeven door een afname van de PaO2 FiO 2-1 ratio en een toename van de pulmonale arteriële druk (Figuur 4). Cerebrale oxygenatie werd gemeten met behulp van nabij-infraroodspectroscopie (NIRS) en nam af na de inductie van shock (Figuur 5). De dieren vertoonden ook acidose en een verhoging van het lactaatgehalte (figuur 6). Eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen werd gebruikt om de significantie te bepalen.
Figuur 3: Ontwikkeling van hemodynamische parameters na LPS-infusie. (A) De gemiddelde arteriële bloeddruk daalde na schokinductie, maar werd boven de 60 mmHg gehouden met behulp van norepinefrine-infusie indien nodig. (B) de hartindex was verlaagd en (C) de hartslag nam toe na LPS-infusie. Gemiddelde en standaarddeviatie worden weergegeven. *P < 0,05 t.o.v. nulmetingen. Afkortingen: BLH = baseline health; LPS = lipopolysaccharide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Ontwikkeling van pulmonale parameters na LPS-infusie. (A) De PaO2 FiO2-1 ratio nam kort na LPS-infusie af. (B) De rijdruk nam toe na de inductie van de schok. (C) De pulmonale arteriële druk nam ook toe tijdens shock. Gemiddelde en standaarddeviatie worden weergegeven. *P < 0,05 t.o.v. nulmetingen. Afkortingen: BLH = baseline health; LPS = lipopolysacharide; FiO2 = inspiratoire zuurstoffractie; PaO2 = partiële zuurstofdruk in arterieel bloed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Cerebrale oxygenatie na LPS-infusie. Cerebrale oxygenatie gemeten via nabij-infraroodspectroscopie nam af na schokinductie met LPS. Gemiddelde en standaarddeviatie worden weergegeven. *P < 0,05 t.o.v. nulmetingen. Afkortingen: BLH = baseline health; LPS = lipopolysacharide; NIRS = nabij-infraroodspectroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Arteriële bloedgasanalyse tijdens LPS-geïnduceerde endotoxemie. (A) De dieren werden na verloop van tijd zuurder en (B) de lactaatspiegels namen toe na LPS-infusie. Gemiddelde en standaarddeviatie worden weergegeven. *P < 0,05 t.o.v. nulmetingen. Afkortingen: BLH = baseline health; LPS = lipopolysaccharide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een protocol voor het induceren van experimentele endotoxemie bij varkens door middel van LPS-infusie, met als doel op betrouwbare wijze veranderingen te induceren die vaak worden waargenomen bij sepsis en septische shock. In dit protocol moeten verschillende cruciale stappen worden overwogen. Adequate sedatie van varkens voorafgaand aan het transport is van cruciaal belang om door stress veroorzaakte verhoging van de catecholaminespiegels te voorkomen, wat de resultaten mogelijk in gevaar zou kunnen brengen. Intubatie van varkens kan een uitdaging vormen in vergelijking met mensen vanwege de anatomische kenmerken van hun langwerpige snuiten. Om dit aan te pakken, raden we het gebruik van een Macintosh-mes aan voor intubatie en moet de endotracheale tube worden uitgerust met een rechte inductor. Het is gebruikelijk dat de epiglottis zich hecht aan het zachte gehemelte, en af en toe kan een kleinere endotracheale tube nodig zijn vanwege de subglottische vernauwing van de luchtpijp van het dier, dus een buis die door de stembanden kan gaan, kan nog steeds te groot zijn.
Voorafgaand aan de LPS-infusie is een nauwkeurige voorbereiding van de LPS-concentratie essentieel. Het toedienen van een hogere dosis LPS kan leiden tot ernstige hemodynamische instabiliteit en zelfs de dood, terwijl een lagere dosis mogelijk niet de gewenste effecten heeft. Bovendien moet worden opgemerkt dat verschillende LPS-ladingen verschillende niveaus van werkzaamheid kunnen vertonen. We raden aan om voor elke proefperiode dezelfde LPS-kosten te gebruiken. Er kunnen dosisbepalende onderzoeken worden uitgevoerd om de juiste dosering voor elk onderzoek te bepalen. Bij het starten van LPS-infusie is continue bewaking van hemodynamische parameters cruciaal vanwege het potentieel voor snelle instabiliteit. Onmiddellijk ingrijpen kan nodig zijn om eventuele bijwerkingen te beheersen.
PiCCO werd gebruikt voor geavanceerde hemodynamische metingen. Deze technologie wordt ook vaak gebruikt bij menselijke patiënten die op de IC worden behandeld. Het is ontwikkeld voor mensen en het gebruik ervan bij varkens kan enkele uitdagingen met zich meebrengen. Lichaamsoppervlak (BSA) wordt gebruikt voor de berekening van hemodynamische parameters. Dit wordt automatisch berekend wanneer de lengte en het gewicht van de patiënt worden ingevoerd. Hoewel de hier gebruikte formule (voor mensen) niet ideaal is voor het berekenen van de BSA van varkens, is er helaas geen andere manier om de BSA in te voeren. Dit probleem werd opgelost door een hoogte van 130 cm in te voeren voor de varkens omdat in onze ervaring dit de meest adequate resultaten oplevert voor BSA. Deze beperking moet echter in gedachten worden gehouden bij het interpreteren van PiCCO-resultaten.
Eerdere studies hebben het gebruik van LPS beschreven om septische shock bij varkens te simuleren. In deze onderzoeken worden veranderingen beschreven die vaak worden waargenomen bij septische patiënten, zoals hypotensie, perifere vasodilatatie, verhoogde pulmonale arteriële druk en verhoogde systemische zuurstofopname 13,14,15. Alternatieve methoden voor het induceren van experimentele sepsis en septische shock bij varkens zijn ook beschreven. Eén model omvat het induceren van peritonitis door intraperitoneale toediening van ontlasting 16,17,18,19. Een andere benadering is de directe injectie van levende bacteriën in de bloedbaan van de dieren19,20. In vergelijking met LPS-injectie bieden protocollen die peritonitis of bacteriëmie gebruiken om experimentele sepsis te induceren het voordeel van meer realisme. Deze methoden induceren een daadwerkelijke septische toestand door bacteriële infectie, terwijl LPS-injectie slechts een enkel aspect van de onderliggende pathogenetische mechanismen vertegenwoordigt.
De LPS-infusiemethode heeft echter ook zijn voordelen. In vergelijking met het peritonitismodel vereist dit protocol minder inspanning en expertise, omdat het alleen intraveneuze injectie omvat zonder dat intraperitoneale toegang nodig is. Bovendien manifesteren symptomen van shock zich sneller dan in de andere modellen, waardoor kortere observatietijden en een verminderd gebruik van hulpbronnen mogelijk zijn. Bovendien zijn de resultaten zeer reproduceerbaar, aangezien elk varken dezelfde LPS-dosering krijgt. Daarentegen kan de samenstelling van toegediende ontlasting aanzienlijk variëren en wordt de bacteriegroei beïnvloed door oncontroleerbarefactoren19.
Ondanks bepaalde beperkingen veroorzaakte dit protocol consequent endotoxemische shock, die meerdere orgaansystemen aantastte. We observeerden karakteristieke veranderingen in de longfunctie en hemodynamiek, samen met verhoogde lactaatspiegels bij alle met LPS behandelde dieren. Vanwege de continue diepe anesthesie tijdens het experiment, waren we niet in staat om de cognitieve functie te evalueren, die is opgenomen in de SOFA-score met behulp van de Glasgow Coma Scale bij mensen. We hebben echter wel een vermindering van de cerebrale oxygenatie waargenomen, wat wijst op een mogelijke impact van de LPS-geïnduceerde schok op de hersenfunctie. In de vroege stadia wordt sepsis vaak geassocieerd met een hyperdynamische fase die wordt gekenmerkt door een verhoogd hartminuutvolume. Vanwege de snelle progressie van symptomen in dit model, laten de hier gepresenteerde gegevens deze hyperdynamische fase niet adequaat zien. Als deze fase van bijzonder belang is, moeten in de vroege fase van het experiment regelmatiger metingen worden uitgevoerd. Een aanpassing van de LPS-dosis kan helpen om de ontwikkeling van de symptomen te vertragen en het gemakkelijker te maken om de hyperdynamische fase waar te nemen.
LPS en andere bacteriële endotoxinen zijn eerder gebruikt om sepsis te simuleren in kleine diermodellen8. Het gebruik van varkens in deze context brengt echter bepaalde uitdagingen met zich mee in vergelijking met kleine diermodellen zoals muizen. Het fokken en onderhouden van varkens kost aanzienlijk meer tijd en moeite en er kunnen minder dieren per proef worden ingezet. Toch geven grote diermodellen, met name varkens, een realistischer beeld van het menselijk lichaam. Varkens vertonen overeenkomsten met mensen op het gebied van anatomie, genoom, dieet en reactievermogen van het immuunsysteem 9,10. Een ander voordeel is de mogelijkheid voor herhaalde bloedmonsteranalyses. Hoewel kleine diermodellen vaak gespecialiseerde apparatuur nodig hebben, kan standaard medische apparatuur die vaak bij menselijke patiënten wordt gebruikt, worden toegepast op varkens, waardoor het lijkt op de instrumentatie en hemodynamische monitoring in een klinische IC-omgeving. Concluderend stelt dit protocol een experimenteel endotoxemiemodel vast bij varkens door middel van LPS-infusie. Het biedt een eenvoudige en gestandaardiseerde methode om consequent veranderingen te induceren die vaak worden waargenomen bij patiënten met septische shock.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Het NIRS-apparaat werd onvoorwaardelijk geleverd door Medtronic PLC, VS, voor experimentele onderzoeksdoeleinden. Alexander Ziebart ontving een collegevergoeding van Medtronic PLC. Geen van de auteurs maakt melding van financiële of andere belangenconflicten. Het manuscript is nagelezen en bewerkt door ChatGPT® (Python Software, versie: 24 mei 2023).
Acknowledgments
De auteurs willen Dagmar Dirvonskis bedanken voor haar uitstekende technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atracurium Hikma 50 mg/5mL | Hikma Pharma GmbH, Martinsried | ||
| Azaperone (Stresnil) 40 mg/mL | Lilly Deutschland GmbH, Bad Homburg, Germany | ||
| BD Discardit II Spritze 2, 5, 10, 20 mL | Becton Dickinson S.A. Carretera, Mequinenza Fraga, Spain | syringe | |
| BD Luer Connecta | Becton Dickinson Infusion Therapy, AB Helsingborg, Schweden | 3-way-stopcock | |
| Curafix i.v. classics | Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG, Rengsdorf, Germany | Cannula retention dressing | |
| Datex Ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland | hemodynamic monitor | |
| Engström Carestation | GE Heathcare, Madison USA | ventilator | |
| Fentanyl-Janssen 0.05 mg/mL | Janssen-Cilag GmbH, Neuss | fentanyl | |
| Führungsstab, Durchmesser 4.3 | Rüsch | endotracheal tube introducer | |
| Incetomat-line 150 cm | Fresenius, Kabi Deutschland, GmbH | perfusor line | |
| Intrafix Primeline | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | Infusion line | |
| Introducer sheath 5 Fr. | Terumo Healthcare | arterial introducer | |
| INVOS | Medtronic, Dublin, Ireland | near infrared spectrometry | |
| JOZA Einmal Nitril Untersuchungshandschuhe | JOZA, München, Germany | disposable gloves | |
| Laryngoscope, 45.48.50, KL 2000 | Medicon | Laryngoscope handle | |
| Littmann Classic III Stethoscope | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | stethoscope | |
| LPS (E. coli; Serotype O111:B4) | Sigma-Aldrich, Switzerland | ||
| MAC Two-Lumen Central venous access set | Arrow international inc. Reading, PA, USA | venous introducer | |
| Maimed Vlieskompresse | Maimed GmbH, Neuenkirchen, Germany | Fleece compress to fix the tongue | |
| Masimo LNCS Adtx SpO2 sensor | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | saturation clip for the tail | |
| Masimo LNCS TC-I SpO2 ear clip sensor | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | Saturation clip for the ear | |
| Masimo Radical 7 | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | periphereal oxygen saturation | |
| Midazolam 15 mg/3 mL | B.Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Midmark Canine Mask Small Plastic with Diaphragm FRSCM-0005 | Midmark Corp., Dayton, Ohio, USA | dog ventilation mask | |
| Monocryl surgical suture | Johnson & Johnson, Belgium | ||
| B.Braun Melsungen AG, Germany | saline solution | ||
| NaCl 0.9 % | Sanofi- Aventis, Seutschland GmbH | ||
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH, Nordenstedt, Germany | Alcoholic disinfectant | |
| Original Perfusor syringe 50 mL | B.Braun Melsungen AG, Germany | perfusor syringe | |
| PA-Katheter Swan Ganz 7.5 Fr 110 cm | Edwards Lifesciences LLC, Irvine CA, USA | Swan-Ganz catheter | |
| Perfusor FM Braun | B.Braun Melsungen AG, Germany | syringe pump | |
| PiCCO catheter | PULSION Medical Systems SE, Feldkirchen, DE | ||
| Potassium chloride 1 M | Fresenius, Kabi Germany GmbH | ||
| Propofol 2% 20 mg/mL (50 mL flasks) | Fresenius, Kabi Deutschland, GmbH | ||
| Pulse-contour continous cardiac output System PiCCO2 | PULSION Medical Systems SE, Feldkirchen, DE | ||
| Rüschelit Super Safety Clear >ID 6/6.5 /7.0 mm | Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia | endotracheal tube | |
| Sonosite Micromaxx Ultrasoundsystem | Sonosite Bothell, WA, USA | ultrasound | |
| Stainless Macintosh Größe 4 | Welch Allyn69604 | blade for laryngoscope | |
| Sterofundin | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | Balanced electrolyte solution | |
| Vasco OP sensitive | B.Braun Melsungen AG, Germany | sterile gloves | |
| Vasofix Safety 22 G-16 G | B.Braun Melsungen AG, Germany | venous catheter | |
| VBM Cuff Manometer | VBM Medizintechnik GmbH, Sulz a.N., Germany | cuff pressure gauge |
References
- Vincent, J. -L., Jones, G., David, S., Olariu, E., Cadwell, K. K. Frequency and mortality of septic shock in Europe and North America: a systematic review and meta-analysis. Critical Care. 23 (1), 196 (2019).
- Reinhart, K., et al. Recognizing sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution. New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Cecconi, M., Evans, L., Levy, M., Rhodes, A.
- Font, M. D., Thyagarajan, B., Khanna, A. K. Sepsis and septic shock - basics of diagnosis, pathophysiology and clinical decision making. Medical Clinics of North America. 104 (4), 573-585 (2020).
- Singer, M., et al. The Third International Consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801 (2016).
- Jerala, R.
- Copeland, S., Warren, H. S., Lowry, S. F., Calvano, S. E., Remick, D. Inflammation and the host response to injury investigators acute inflammatory response to endotoxin in mice and humans. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 60-67 (2005).
- Dickson, K., Lehmann, C. Inflammatory response to different toxins in experimental sepsis models. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4341 (2019).
- Bassols, A., Costa, C., Eckersall, P. D., Osada, J., Sabrià, J., Tibau, J. The pig as an animal model for human pathologies: A proteomics perspective. PROTEOMICS - Clinical Applications. 8 (9-10), 715-731 (2014).
- Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., Gerdts, V. The pig: a model for human infectious diseases. Trends in Microbiology. 20 (1), 50-57 (2012).
- Ali, J., Cody, J., Maldonado, Y., Ramakrishna, H. Near-infrared spectroscopy (NIRS) for cerebral and tissue oximetry: analysis of evolving applications. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 36, 2758-2766 (2022).
- Getinge Deutschland GmbH PiCCO Technologie Erweitertes hämodynamisches Monitoring auf höchstem Niveau. , Available from: https://www.getinge.com/dam/hospital/documents/german/picco_haemodynamisches_monitoring_broschuere-de-non_us.pdf (2023).
- Breslow, M. J., Miller, C. F., Parker, S. D., Walman, A. T., Traystman, R. J. Effect of vasopressors on organ blood flow during endotoxin shock in pigs. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 252 (2), H291-H300 (1987).
- Fink, M. P., et al. Systemic and mesenteric O2 metabolism in endotoxic pigs: effect of ibuprofen and meclofenamate. Journal of Applied Physiology. 67 (5), Bethesda, Md. 1950-1957 (1989).
- Lado-Abeal, J., et al. Lipopolysaccharide (LPS)-induced septic shock causes profound changes in myocardial energy metabolites in pigs. Metabolomics. 14 (10), 131 (2018).
- Park, I., et al. Characterization of fecal peritonitis-induced sepsis in a porcine model. The Journal of Surgical Research. 244, 492-501 (2019).
- Jarkovska, D., et al. Heart rate variability in porcine progressive peritonitis-induced sepsis. Frontiers in Physiology. 6, 412 (2015).
- Kohoutova, M., et al. Vagus nerve stimulation attenuates multiple organ dysfunction in resuscitated porcine progressive sepsis. Critical Care Medicine. 47 (6), e461-e469 (2019).
- Vintrych, P., et al. Modeling sepsis, with a special focus on large animal models of porcine peritonitis and bacteremia. Frontiers in Physiology. 13, 1094199 (2022).
- Stengl, M., et al. Reduced L-type calcium current in ventricular myocytes from pigs with hyperdynamic septic shock. Critical Care Medicine. 38 (2), 579-587 (2010).
