Summary
यहां, हम अरबिडोप्सिस थालियाना में जीवाणु आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं के प्रत्यक्ष अवलोकन और स्वचालित माप के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि एक पोर्टेबल स्टोमेटा इमेजिंग डिवाइस का लाभ उठाती है, साथ में डिवाइस द्वारा कैप्चर की गई पत्ती छवियों के लिए डिज़ाइन की गई छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ।
Abstract
स्टोमेटा सूक्ष्म छिद्र होते हैं जो पौधे की पत्ती एपिडर्मिस में पाए जाते हैं। स्टोमेटा एपर्चर का विनियमन न केवल प्रकाश संश्लेषण और वाष्पोत्सर्जन पानी के नुकसान के लिए कार्बन डाइऑक्साइड तेज को संतुलित करने के लिए बल्कि बैक्टीरिया के आक्रमण को प्रतिबंधित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। जबकि पौधे रोगाणुओं की पहचान पर रंध्र को बंद कर देते हैं, रोगजनक बैक्टीरिया, जैसे कि स्यूडोमोनास सिरिंज पीवी। टमाटर DC3000 (Pto), पत्ती के इंटीरियर में पहुंच प्राप्त करने के लिए बंद रंध्र को फिर से खोलें। बैक्टीरियल आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए पारंपरिक assays में, पत्ती एपिडर्मल peels, पत्ती डिस्क, या अलग पत्तियों बैक्टीरियल निलंबन पर तैरता रहे हैं, और फिर रंध्र एक खुर्दबीन के नीचे stomatal एपर्चर के मैनुअल माप के बाद मनाया जाता है. हालांकि, ये परख बोझिल हैं और पौधे से जुड़ी पत्ती में प्राकृतिक जीवाणु आक्रमण के लिए स्टोमेटा प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। हाल ही में, एक पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस विकसित किया गया था जो पौधे से अलग किए बिना एक पत्ती को पिंच करके रंध्र का निरीक्षण कर सकता है, साथ में एक गहरी सीखने-आधारित छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ डिवाइस द्वारा कैप्चर की गई पत्ती छवियों से स्टोमेटा एपर्चर को स्वचालित रूप से मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यहां, इन तकनीकी प्रगति पर निर्माण, अरबिडोप्सिस थालियाना में बैक्टीरिया के आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक नई विधि पेश की गई है। इस विधि में तीन सरल चरण होते हैं: प्राकृतिक संक्रमण प्रक्रियाओं की नकल करने वाले पीटीओ का स्प्रे इनोक्यूलेशन, पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करके पीटीओ-इनोक्यूलेटेड प्लांट के एक पत्ते पर रंध्र का प्रत्यक्ष अवलोकन, और छवि विश्लेषण पाइपलाइन द्वारा स्टोमेटा एपर्चर का स्वचालित माप। इस पद्धति का उपयोग सफलतापूर्वक प्राकृतिक पौधे-बैक्टीरिया बातचीत की बारीकी से नकल करने वाली परिस्थितियों में पीटीओ आक्रमण के दौरान स्टोमेटाल बंद करने और फिर से खोलने के लिए किया गया था।
Introduction
स्टोमेटा सूक्ष्म छिद्र होते हैं जो पत्तियों की सतह और पौधों के अन्य हवाई भागों पर गार्ड कोशिकाओं की एक जोड़ी से घिरे होते हैं। कभी-बदलते परिवेश के तहत, वाष्पोत्सर्जन के माध्यम से पानी के नुकसान की कीमत पर प्रकाश संश्लेषण के लिए आवश्यक कार्बन डाइऑक्साइड तेज को नियंत्रित करने के लिए पौधों के लिए स्टोमेटाल एपर्चर का विनियमन केंद्रीय है। इस प्रकार, स्टोमेटा एपर्चर का परिमाणीकरण पौधे के पर्यावरण अनुकूलन को समझने के लिए महत्वपूर्ण रहा है। हालांकि, स्टोमेटा एपर्चर की मात्रा निर्धारित करना स्वाभाविक रूप से समय लेने वाली और बोझिल है क्योंकि माइक्रोस्कोप द्वारा कैप्चर की गई पत्ती की छवि में स्टोमेटा छिद्रों को स्पॉट करने और मापने के लिए मानव श्रम की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, Arabidopsis Thaaliana में stomatal एपर्चर की मात्रा का ठहराव की सुविधा के लिए विभिन्न तरीकों का विकास किया गया है, एक मॉडल संयंत्र बड़े पैमाने पर stomatal जीव विज्ञान 1,2,3,4,5,6 का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया. उदाहरण के लिए, एक पोरोमीटर का उपयोग वाष्पोत्सर्जन दर को मापने के लिए स्टोमेटा चालकता के मीट्रिक के रूप में किया जा सकता है। हालांकि, यह विधि स्टोमेटा संख्या और एपर्चर पर प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान नहीं करती है जो स्टोमेटा चालकता निर्धारित करती है। कुछ अध्ययनों ने फ्लोरोसेंट एक्टिन मार्कर, एक फ्लोरोसेंट डाई, या सेल दीवार ऑटोफ्लोरेसेंस 1,2,3,4,5का उपयोग करके स्टोमेटाल छिद्रों को उजागर करने वाली कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग किया है। जबकि ये दृष्टिकोण रंध्र का पता लगाने की सुविधा प्रदान करते हैं, दोनों की लागत एक फोकल माइक्रोस्कोपी सुविधा के संचालन और माइक्रोस्कोपी नमूने तैयार करने के लिए नियमित आवेदन के लिए एक बाधा हो सकती है। साई एट अल द्वारा एक जमीन तोड़ने काम में, एक गहरी तंत्रिका नेटवर्क मॉडल स्वचालित रूप से ए thaliana एपिडर्मल peels6 के उज्ज्वल क्षेत्र सूक्ष्म छवियों से stomatal एपर्चर को मापने के लिए विकसित किया गया था. फिर भी, यह नवाचार शोधकर्ताओं को सूक्ष्म अवलोकन के लिए एपिडर्मल छील तैयार करने के कार्य से छूट नहीं देता है। हाल ही में, इस बाधा को एक पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस विकसित करके दूर किया गया था जो ए थालियाना के एक पत्ते को चुटकी बजाकर रंध्र का निरीक्षण कर सकता है, साथ में एक गहरी सीखने-आधारित छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ जो डिवाइस7 द्वारा कैप्चर की गई पत्ती छवियों से स्टोमेटा एपर्चर को स्वचालित रूप से मापता है।
रंध्र जीवाणु रोगजनकों के खिलाफ पौधे की जन्मजात प्रतिरक्षा में योगदान करते हैं। इस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की कुंजी स्टोमेटाल क्लोजर है जो पत्ती के इंटीरियर में सूक्ष्म छिद्र के माध्यम से बैक्टीरिया के प्रवेश को प्रतिबंधित करता है, जहां जीवाणु रोगजनकों का प्रसार होता है और बीमारियों का कारणबनता है। स्टोमेटाल क्लोजर माइक्रोब से जुड़े आणविक पैटर्न (एमएएमपी), इम्युनोजेनिक अणुओं की मान्यता पर प्रेरित होता है जो अक्सर प्लाज्मा झिल्ली-स्थानीयकृत पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआर)9द्वारा रोगाणुओं के एक वर्ग के लिए आम होते हैं। बैक्टीरियल फ्लैगेलिन का एक 22 एमिनो एसिड एपिटोप जिसे flg22 के रूप में जाना जाता है, एक विशिष्ट एमएएमपी है जो पीआरआर एफएलएस 210 द्वारा इसकी मान्यता के माध्यम से स्टोमेटाल क्लोजर को प्रेरित करता है। एक प्रतिवाद के रूप में, जीवाणु रोगजनकों जैसे स्यूडोमोनास सिरिंज पीवी। टमाटर DC3000 (Pto) और Xanthomonas campestris pv। वेसिकाटोरिया ने रंध्र 9,11,12 को फिर से खोलने के लिए विषाणु तंत्र विकसित किया है। बैक्टीरियल रोगजनकों के लिए इन रंध्र प्रतिक्रियाओं का पारंपरिक रूप से परख में विश्लेषण किया गया है जिसमें या तो पत्ती एपिडर्मल छिलके, पत्ती डिस्क, या अलग पत्तियों को बैक्टीरिया निलंबन पर तैराया जाता है, और फिर स्टोमेटा को माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है, जिसके बाद स्टोमेटा एपर्चर का मैनुअल माप होता है। हालांकि, ये परख बोझिल हैं और पौधे से जुड़ी पत्ती में होने वाले प्राकृतिक जीवाणु आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं।
यहां, पीटीओ आक्रमण के दौरान स्टोमेटाल बंद होने और फिर से खोलने की जांच करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत की जाती है, जो प्राकृतिक पौधे-बैक्टीरिया की बातचीत की बारीकी से नकल करती है। यह विधि पीटीओ के साथ टीका लगाए गए पौधे से जुड़ी पत्ती पर ए. थालियाना रंध्र के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस का लाभ उठाती है, साथ में स्टोमेटा एपर्चर के स्वचालित माप के लिए छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ।
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Protocol
1. बढ़ते पौधे
- सुप्तावस्था को तोड़ने के लिए, विआयनीकृत पानी में ए. थालियाना (कर्नल -0) बीजों को फिर से निलंबित करें और उन्हें अंधेरे में 4 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनसेते हैं।
- मिट्टी पर बीज बोएं और सफेद फ्लोरोसेंट प्रकाश से सुसज्जित कक्ष में बढ़ें। निम्नलिखित विकास स्थितियों को बनाए रखें: 22 डिग्री सेल्सियस का तापमान, 10 घंटे के लिए 6,000 लक्स (सीए 100 μmol/m2/s) की हल्की तीव्रता, और 60% की सापेक्ष आर्द्रता।
- जब आवश्यक हो, एक तरल उर्वरक के साथ पौधों को पानी दें। टीकाकरण से 1 सप्ताह से 2 दिन पहले और टीकाकरण से 1 दिन पहले अच्छी तरह से पानी देने से बचें।
2. बैक्टीरियल इनोकुलम तैयार करना
- ठोस राजा बी (केबी) मध्यम (ट्रिप्टोन के 20 ग्राम, के2एचपीओ 4 के 1.5 ग्राम, और 1 एल के लिए ग्लिसरॉल के 15 ग्राम, 1.5% अगर) पर ग्लिसरॉल स्टॉक से स्ट्रीक पीटीओ 50 माइक्रोग्राम/एमएल रिफैम्पिसिन के साथ और 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें 2 दिनों के लिए।
- 50 माइक्रोग्राम/एमएल रिफैम्पिसिन के साथ केबी तरल माध्यम के 5 एमएल के लिए एक एकल कॉलोनी टीका लगाना और देर से लघुगणकीय विकास चरण तक 200 आरपीएम पर झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- 2 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर संस्कृति अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और बाँझ पानी के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। इस चरण को एक बार फिर से दोहराएं।
- सतह पर तैरनेवाला निकालें, रंध्र खोलने बफर (25 मिमी एमईएस-केओएच पीएच 6.15, 10 मिमी केसीएल) के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें, और आयुध डिपो600 को मापें।
- निलंबन को OD600 0.2 में पतला करें, जिसमें स्टोमेटा ओपनिंग बफर जिसमें 0.04% सिलिकॉन सर्फेक्टेंट हो।
3. बैक्टीरिया का स्प्रे इनोक्यूलेशन
- प्रयोग के अंत तक टीकाकरण से 1 दिन पहले, पौधों को लगभग 10,000 लक्स (सीए 170 माइक्रोमोल/एम2/एस) की हल्की तीव्रता तक उजागर करें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि अधिकांश रंध्र खुले हैं, पौधों को स्प्रे टीकाकरण से पहले कम से कम 3 घंटे के लिए प्रकाश के नीचे पारदर्शी ढक्कन से ढकी ट्रे पर रखें।
- ढक्कन निकालें और एक ही बर्तन पर प्रति तीन पौधों में 2.5 एमएल बैक्टीरियल निलंबन के साथ पत्तियों के अबाक्सियल पक्ष को स्प्रे करने के लिए एक एयरब्रश का उपयोग करें।
- लगभग 85% की सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखने के लिए एक पारदर्शी ढक्कन से ढकी ट्रे पर टीका लगाए गए पौधों को इनक्यूबेट करें।
- धारा 4 में वर्णित विधि का उपयोग करके स्प्रे टीकाकरण के बाद 1 घंटे और 3 घंटे में रंध्र की छवियां प्राप्त करें।
4. पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करके रंध्र का प्रत्यक्ष अवलोकन
नोट: पोर्टेबल स्टोमेटा इमेजिंग डिवाइस एक एलईडी लाइट और एक कैमरा मॉड्यूल से लैस है और लगभग 0.5 माइक्रोन / पिक्सेल के रिज़ॉल्यूशन के साथ 2,592 × 1,944 (ऊंचाई × चौड़ाई; पिक्सेल) छवियों को प्राप्त कर सकता है।
- पोर्टेबल स्टोमेटा इमेजिंग डिवाइस को छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से लैस एक व्यक्तिगत कंप्यूटर (पीसी) से कनेक्ट करें।
- धीरे से लेकिन पूरी तरह से कागज के एक टुकड़े के साथ टीका पत्तियों से पानी की बूंदों को हटा दें।
- डिवाइस का शीर्ष कवर खोलें, पत्ती को मंच पर रखें, और शीर्ष कवर को बंद करें (चित्र 1)।
- समायोजक स्क्रू में हेरफेर करके छवि के फ़ोकस को समायोजित करें, फिर क्लिक करें छवि सहेजें पीसी स्क्रीन पर बटन। छवि तुरंत प्राप्त की जाएगी। आमतौर पर, एक केंद्रित छवि में लगभग 10 विश्लेषण योग्य रंध्र होते हैं। मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए, तीन अलग-अलग पौधों की छह पत्तियों (प्रति पौधे दो पत्ते) से स्टोमेटा छवियां प्राप्त करें।
5. स्टोमेटा एपर्चर का मैनुअल माप
नोट: ImageJ सॉफ्टवेयर https://imagej.nih.gov/ij/download.html पर डाउनलोड किया जा सकता है
- ImageJ में एक छवि फ़ाइल खोलें।
- > उपकरण का विश्लेषण करें > ROI प्रबंधक का चयन करके ROI प्रबंधक खोलें।
- एक रंध्र (चित्रा 2) की चौड़ाई के अनुरूप एक रेखा खींचने के लिए सीधी रेखा चयन उपकरण का उपयोग करें और आरओआई प्रबंधक में जोड़ें पर क्लिक करके आरओआई पंजीकृत करें।
- एक ही रंध्र (चित्रा 2 ए) की लंबाई के अनुरूप एक रेखा खींचें और आरओआई को चरण 5.3 में वर्णित के रूप में पंजीकृत करें।
- चौड़ाई और लंबाई मापने के लिए ROI प्रबंधक में माप पर क्लिक करें।
- स्टोमेटा एपर्चर (अनुपात) प्राप्त करने के लिए लंबाई से चौड़ाई को विभाजित करें। मजबूत मात्रा का ठहराव के लिए, प्रत्येक उपचार और समय बिंदु के लिए 60 या अधिक रंध्र का उपयोग करें। विश्लेषण के लिए समय से पहले या अस्पष्ट रंध्र का चयन न करें (चित्र 2बी, सी)।
6. स्टोमेटा एपर्चर का स्वचालित माप
नोट: छवि विश्लेषण पाइपलाइन Google Colaboratory, एक क्लाउड पायथन प्रोग्रामिंग भाषा निष्पादन योग्य वातावरण में चलती है। उपयोगकर्ताओं के पास एक कार्यशील Google ड्राइव, Google Chrome ब्राउज़र और एक शर्त के रूप में एक स्थिर इंटरनेट कनेक्शन के साथ एक वैध Google खाता होना चाहिए।
- ज़ेनोडो (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) से Google Colaboratory नोटबुक डाउनलोड करें, और नोटबुक खोलें।
- फ़ाइल > डिस्क में कॉपी सहेजें का चयन करके Google डिस्क पर नोटबुक की स्थानीय कॉपी बनाएं. कोई नया टैब प्रकट होने के बाद, मूल नोटबुक के टैब को सुरक्षित रूप से बंद करें.
- आवश्यक लाइब्रेरीज़ आयात करने के लिए सेल ब्लॉक्स को खोले बिना नोटबुक में पर्यावरण सेटअप अनुभाग के नीचे एक बार निष्पादित करें बटन दबाएं।
- Google ड्राइव में विश्लेषण (जैसे, example_result, inference_results और मॉडल) के लिए उपयोग किए जाने वाले तीन फ़ोल्डर बनाने के लिए निर्देशिका सेटिंग अनुभाग निष्पादित करें।
नोट:: इस स्थिति में, example_result, inference_results और मॉडल नाम फ़ोल्डर, अनुमान परिणाम और प्रशिक्षित मॉडल, क्रमशः parents निर्देशिका के रूप में उपयोग किया जाता है। यह नोटबुक प्रतिनिधि प्रक्रिया के रूप में निर्देशिका निर्माण का एक उदाहरण दिखाती है। नाम बदलने के लिए, pardir, infdir, या modeldir पथ को फिर से लिखें। - छवियों की तैयारी अनुभाग के अनुसार, अंतिम ग्राफ पीढ़ी के लिए उपचार या नमूना (जैसे, mock_1h_XXXXXX.jpg) द्वारा छवि शीर्षकों में समूहीकृत, example_result के लिए अधिग्रहीत छवियों को स्थानांतरित करें। नमूना छवियों Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) से उपलब्ध हैं.
- ज़ेनोडो (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) से प्रशिक्षित मॉडलों की ओएनएनएक्स फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए प्रशिक्षित मॉडल डाउनलोड करें भाग करें और उन्हें मॉडल निर्देशिका के अंतर्गत रखें।
- अलग-अलग छवियों से स्टोमेटाल एपर्चर की मात्रा निर्धारित करने के लिए स्टोमेटाल एपर्चर भाग का अनुमान और मापन चलाएं। ओवरलेड अनुमान के साथ परिणाम छवियां और example_result.csv नाम की csv फ़ाइल inference_results निर्देशिका में निर्यात की जाएगी।
- स्टोमेटा एपर्चर अनुपात के बारे में एक ग्राफ बनाने के लिए ग्राफ जनरेशन सेक्शन निष्पादित करें, जिसे inference_results निर्देशिका में निर्यात किया गया है।
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Representative Results
पीटीओ के स्प्रे टीकाकरण के बाद, टीका लगाए गए पौधों से जुड़ी पत्तियों पर रंध्र सीधे पोर्टेबल स्टोमेटा इमेजिंग डिवाइस द्वारा देखे गए थे। मैनुअल और स्वचालित माप का उपयोग करते हुए, लगभग 60 रंध्रों की लंबाई के अनुपात को लेकर स्टोमेटा एपर्चर की गणना करने के लिए एक ही पत्ती छवियों का उपयोग किया गया था। मैनुअल और स्वचालित माप ने लगातार 1 घंटे के पोस्ट इनोक्यूलेशन (एचपीआई)(चित्रा 3ए,बी)पर मॉक-इनोक्यूलेटेड पौधों की तुलना में पीटीओ-इनोक्यूलेटेड पौधों में स्टोमेटा एपर्चर में कमी का संकेत दिया, यह दर्शाता है कि पीटीओ आक्रमण के जवाब में एक थालियाना पौधे स्टोमेटा को बंद कर देते हैं। 3 एचपीआई पर, पीटीओ-टीका पौधों और नकली टीका पौधों में रंध्र एपर्चर लगभग एक ही थे (चित्रा 3सी, डी), पीटीओ द्वारा रंध्र फिर से खोलने की याद ताजा करती है। उल्लेखनीय रूप से, स्टोमेटा एपर्चर के स्वचालित माप ने एक छवि(तालिका 1)को संसाधित करने के लिए केवल लगभग 5 एस लिया, मैनुअल माप की तुलना में माप समय को 95% से अधिक कम कर दिया। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल बैक्टीरिया रोगज़नक़ के लिए ए थालियाना की गतिशील रंध्र प्रतिक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए एक परिचालन सरल और श्रम-बचत साधन प्रदान करता है।
चित्रा 1: पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस। पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस को मंच (बाएं) पर एक पत्ती सेट के साथ और शीर्ष कवर बंद (दाएं) के साथ चित्रित करने वाले चित्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: स्टोमेटा एपर्चर माप का योजनाबद्ध आरेख। (ए) स्टोमेटाल एपर्चर एक रंध्र की लंबाई के लिए चौड़ाई के अनुपात की गणना करके निर्धारित किया जाता है, जैसा कि सफेद तीर द्वारा इंगित किया गया है। (बी) समय से पहले और (सी) अस्पष्ट रंध्र को माप से बाहर रखा जाना चाहिए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: एक बरकरार पूरे संयंत्र में पीटीओ के लिए रंध्र प्रतिक्रियाएं। ए. थालियाना पौधों को मॉक या पीटीओ के साथ स्प्रे-टीका लगाया गया था, और टीका लगाए गए पौधों से जुड़ी पत्तियों पर रंध्र सीधे पोर्टेबल स्टोमेटा इमेजिंग डिवाइस द्वारा (ए, बी) 1 एचपीआई और (सी, डी) 3 एचपीआई पर देखे गए थे। स्टोमेटल एपर्चर (अनुपात) की गणना (ए, सी) मैनुअल और (बी, डी) स्वचालित माप द्वारा की गई थी। पी-मानों की गणना दो-पूंछ वाले टी-परीक्षण द्वारा की गई थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| प्रसंस्करण समय | ||
| विधि | औसत | एसडी |
| परिचालन-निर्देशपुस्तिका | 130.1 | 48.8 |
| स्वचालित | 4.7 | 0.8 |
तालिका 1: छवि प्रति स्टोमेटा एपर्चर के मैनुअल और स्वचालित माप के लिए प्रसंस्करण समय। प्रसंस्करण समय के साधन और मानक विचलन (एसडी) की गणना नौ प्रतिनिधि छवियों के माप से की गई थी।
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Discussion
पिछले अध्ययनों में एपिडर्मल छिलके, पत्ती डिस्क, या अलग पत्तियों का इस्तेमाल बैक्टीरिया के आक्रमणों 9,11,12 के लिए रंध्र प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए किया गया था। इसके विपरीत, इस अध्ययन में प्रस्तावित विधि पोर्टेबल स्टोमेटा इमेजिंग डिवाइस का लाभ उठाती है ताकि पीटीओ के स्प्रे टीकाकरण के बाद पौधे से जुड़ी पत्ती पर सीधे रंध्र का निरीक्षण किया जा सके, जो बैक्टीरिया के आक्रमण की प्राकृतिक स्थितियों की नकल करता है। इसके अलावा, क्योंकि इस विधि में पत्ती टुकड़ी, पत्ती डिस्क छांटना, और एपिडर्मल छीलने, घायल और इन नमूना तैयार करने की प्रक्रियाओं से जुड़े पानी के नुकसान जैसे विनाशकारी नमूना तैयार करने की प्रक्रियाओं को शामिल नहीं किया जा सकता है। इन प्रभावों को हल्के में नहीं लिया जाना चाहिए, क्योंकि घाव और पानी की हानि अनिवार्य रूप से पौधे से व्युत्पन्न संकेतों का उत्पादन करती है जैसे कि फाइटोहोर्मोन जसमॉनेट और एब्सिसिक एसिड जो स्टोमेटा आंदोलनों को प्रभावित करते हैं13,14.
पोर्टेबल स्टोमेटा इमेजिंग डिवाइस के इष्टतम उपयोग के लिए कई दिशानिर्देश हैं। सबसे पहले, इष्टतम स्पष्टता और फोकस की छवियों को प्राप्त करने के लिए पत्ती की सतहों से पानी की बूंदों को अच्छी तरह से हटाना सर्वोपरि है। दूसरे, समायोजक स्क्रू को फाइन-ट्यून फोकस में हेरफेर करके समान पत्ती क्षेत्रों से कई छवियां लेने की सिफारिश की जाती है। इस अभ्यास से प्रति पत्ती क्षेत्र में विश्लेषण योग्य रंध्रों की संख्या में वृद्धि होने की उम्मीद है, जिससे संभावित नमूना पूर्वाग्रहों को कम किया जा सकता है। अंत में, डिवाइस के साथ एक पत्ती को पिंच करते समय, पत्ती को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि घाव संकेतों है कि रंध्रबंद 14 प्रकाश में लाना में से एक है.
स्टोमेटाल एपर्चर मैनुअल माप (चित्रा 3) की तुलना में स्वचालित माप में अधिक परिवर्तनशील था। इसके कई संभावित कारण हैं। यह पहले बताया गया था कि छवि विश्लेषण पाइपलाइन द्वारा अनुमानित स्टोमेटा छिद्रों में अक्सर सेल की दीवारें और / या स्टोमेटा छिद्र7 के आसपास गार्ड कोशिकाओं की छाया शामिल होती है, जो मानव आंखों द्वारा मैनुअल माप में मामला नहीं है। असामान्य आकार के साथ रंध्र भी मैनुअल और स्वचालित माप के बीच भिन्नता को प्रभावित कर सकते हैं, हालांकि रंध्र का पता लगाने मॉडल विश्लेषण7 से इस तरह के रंध्र को बाहर करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था. कुछ रंध्रों को स्वचालित माप में स्टोमेटा एपर्चर के लिए शून्य मान दिए गए थे, लेकिन अज्ञात कारणों से मैनुअल माप में कोई भी नहीं। इन मुद्दों को हल करने के लिए मॉडल के भविष्य के अपडेट आवश्यक हो सकते हैं। फिर भी, जैसा कि स्वचालित स्टोमेटाल एपर्चर माप अनिवार्य रूप से मैनुअल माप से मेल खाता है, छवि विश्लेषण पाइपलाइन का वर्तमान संस्करण व्यावहारिक उपयोग का है।
इस अध्ययन में वर्णित ए. थालियाना में स्टोमेटाल एपर्चर का प्रत्यक्ष अवलोकन और स्वचालित माप पौधे के पर्यावरण अनुकूलन में रंध्रों की भूमिका को स्पष्ट करने की दिशा में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए वादा करता है। उदाहरण के लिए, प्रस्तुत विधि मोटे तौर पर एमएएमपी और माइक्रोबियल रोगजनकों के साथ-साथ सूखे जैसे अजैविक तनाव जैसे जैविक तनावों के संपर्क में आने के बाद एक अक्षुण्ण पूरे संयंत्र प्रणाली में स्टोमेटाल एपर्चर की मात्रा निर्धारित करने के लिए व्यापक रूप से लागू होनी चाहिए। इस के समर्थन में, एक पिछले अध्ययन सफलतापूर्वक सही ढंग से फंगल विष fusicoccin कि stomatal खोलने लाती है या तनाव हार्मोन abscisic एसिड है कि पेट बंद7 लाती है के साथ इलाज "पत्ती डिस्क" के stomatal एपर्चर मात्रा निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण पाइपलाइन लागू किया. इसके अलावा, सिद्धांत रूप में, पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस पौधे से जुड़े एकल समान पत्ती पर स्टोमेटा एपर्चर के दीर्घकालिक समय-पाठ्यक्रम विश्लेषण की अनुमति देता है। यह संयंत्र सूक्ष्म जीव बातचीत के नए पहलुओं पर प्रकाश डाला जा सकता है क्योंकि सबसे अध्ययनबातचीत 9,10,11 के पहले कई घंटों के लिए बैक्टीरियल रोगजनकों के लिए रंध्र प्रतिक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित किया है. विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में बैक्टीरियल आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए प्रस्तुत विधि को नियोजित और संशोधित करना भी दिलचस्प होगा। यह तापमान, आर्द्रता, और मिट्टी के पानी की उपलब्धता है कि बैक्टीरियल रोगजनकों 8,15 द्वारा रंध्र आंदोलनों और रोग के विकास को प्रभावित के रूप में पर्यावरणीयकारकों के प्रभावों को समझने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है. अंत में, प्रस्तुत विधि में और अब तक अप्राप्य प्रयोगात्मक सेटिंग्स के तहत संयंत्र सूक्ष्म जीव बातचीत से परे stomatal कार्यों पर अनुसंधान में तेजी लाने के लिए कल्पना की जाएगी.
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम अनुसंधान परियोजना के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं, 'प्लांट-माइक्रोब होलोबियंट की असेंबली के माध्यम से पौधे अनुकूली लक्षणों का सह-निर्माण', फलदायी चर्चाओं के लिए। इस काम को ट्रांसफॉर्मेटिव रिसर्च एरिया (21H05151 और 21H05149 से A.M. और 21H05152 से Y.T.) के लिए ग्रांट-इन-एड और चुनौतीपूर्ण खोजपूर्ण अनुसंधान के लिए अनुदान सहायता (22K19178 से A. M.) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessory kits for SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plant Growth Chamber with white fluorescent light |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| Half tray | Sakata | 72000113 | A set of tray and lid |
| Hyponex | Hyponex | No catalogue number available | Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants |
| Image J | Natinal Institute of Health | Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Used for manual measurement of stomatal aperture |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | For MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | For MES-KOH |
| Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Rifampicin | Wako | 185-01003 | Dissolve in DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | silicone surfactant used in spray inoculation |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush used for spray inoculation |
| SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | No catalogue number available | Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil |
| White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Used for Biotron |
References
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