Summary
3D-udskrivning på mikrometerskala muliggør hurtig prototyping af polymere enheder til neuronale cellekulturer. Som et bevis på princippet blev strukturelle forbindelser mellem neuroner begrænset ved at skabe barrierer og kanaler, der påvirker neuritudvækst, mens de funktionelle konsekvenser af sådan manipulation blev observeret ved ekstracellulær elektrofysiologi.
Abstract
Neuronale kulturer har været en reference eksperimentel model i flere årtier. Imidlertid mangler 3D-cellearrangement, rumlige begrænsninger på neuritudvækst og realistisk synaptisk forbindelse. Sidstnævnte begrænser studiet af struktur og funktion i forbindelse med opdeling og mindsker betydningen af kulturer i neurovidenskab. Tilnærmelse ex vivo det strukturerede anatomiske arrangement af synaptisk forbindelse er ikke trivielt, på trods af at det er nøglen til fremkomsten af rytmer, synaptisk plasticitet og i sidste ende hjernens patofysiologi. Her anvendes to-fotonpolymerisation (2PP) som en 3D-printteknik, der muliggør hurtig fremstilling af polymere cellekulturindretninger ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS) i mikrometerskala. Sammenlignet med konventionelle replika støbning teknikker baseret på mikrofotolitografi, 2PP mikro-skala udskrivning muliggør hurtig og overkommelig turnaround af prototyper. Denne protokol illustrerer design og fremstilling af PDMS-baserede mikrofluidiske enheder med det formål at dyrke modulære neuronale netværk. Som et bevis på princippet præsenteres en to-kammer enhed for fysisk at begrænse tilslutningen. Specifikt foretrækkes en asymmetrisk aksonal udvækst under ex vivo-udvikling og tillades at blive rettet fra det ene kammer til det andet. For at undersøge de funktionelle konsekvenser af ensrettede synaptiske interaktioner vælges kommercielle mikroelektrodearrayer til at overvåge den bioelektriske aktivitet af sammenkoblede neuronale moduler. Her illustreres metoder til 1) at fremstille forme med mikrometerpræcision og 2) udføre in vitro multisite ekstracellulære optagelser i rottekortikale neuronale kulturer. Ved at reducere omkostningerne og den fremtidige udbredte tilgængelighed af 2PP 3D-print vil denne metode blive mere og mere relevant på tværs af forskningslaboratorier verden over. Især inden for neuroteknologi og neurale dataoptagelse med høj kapacitet vil letheden og hurtigheden af prototypeforenklede in vitro-modeller forbedre eksperimentel kontrol og teoretisk forståelse af in vivo store neurale systemer.
Introduction
Undersøgelse af neuronal aktivitet i opførende organismer giver flere udfordringer. For eksempel er fysisk adgang til hjernevævet begrænset af behovet for at bevare dets integritet, så hjernens overfladiske regioner lettere overvejes. Isolering af specifikke mål i det intakte væv er ofte en skræmmende opgave og undertiden umulig. Selvom dissocierede homogene neuronale kulturer giver nem adgang til de molekylære, biokemiske og biofysiske egenskaber af individuelle (sub) cellulære komponenter i et neuralt kredsløb, går en realistisk forbindelse og anatomisk organisering af den intakte hjerne tabt. Disse grundlæggende begrænsninger inspirerede forskningsindsatsen for at opnå en mellemvej, hvor in vivo-kompleksitet undgås, mens strukturen kan konstrueres in vitro, hvilket er efter behov 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Især modulære neuronale kulturer har været genstand for omfattende forskning i de sidste årtier med det formål at tackle centrale spørgsmål om hjernefysiologi som beskrevet nedenfor.
Organisation: In vivo undersøgelser viser, at hjernen er struktureret anatomisk i lag med præcise celletyper og arrays af fremskrivninger. Funktionelle assays afslørede organiseringen af neuronale netværk i nodesamlinger og moduler med præcise forbindelsesskemaer10,11. Konnektivitetens og mikrokredsløbsmotivernes rolle kan imidlertid ikke undersøges tilstrækkeligt in vivo på grund af det store antal synapser, der er involveret, samt de sammenvævede virkninger af udvikling og aktivitetsafhængig plasticitet.
Signaloverførsel: I in vivo eller tilfældige in vitro-kulturer er det udfordrende at vurdere signaloverførsel. Undersøgelse af aksonal ledning og handlingspotentiale langs dens længde kræver styring af neuritudvækst ved overfladefunktionalisering eller kemisk mønster, hvilket giver et højt signal-støj-forhold i ekstracellulære aflæsninger af elektrisk aktivitet12.
Translationel relevans: Dekryptering af den eksklusive rolle af præ- versus postsynaptiske elementer på tværs af patologiske tilstande kræver at have adgang til disse elementer individuelt. Modulære kulturer med begrænset konnektivitet, der effektivt adskiller de præ- og postsynaptiske elementer, er uundværlige værktøjer til dette formål13.
Der findes flere metoder til at opnå en form for struktur i neuronal kultur. De kan bredt kategoriseres som kemisk og fysisk overflademanipulation9. De tidligere metoder 14,15 er afhængige af neuronale cellers tilbøjelighed til at binde sig til visse (bio) kemiske forbindelser. Dette kræver deponering af klæbemiddel eller attraktive molekyler på en overflade med mikroskalapræcision og efter et detaljeret mønster. Mens dette tillader en delvis dækning af overfladen af cellerne, efter det ønskede mønster, er kemiske metoder i sagens natur begrænsede og har en relativt lav succesrate i neurit vækstvejledning 16. Fuld kontrol over axonretningsvirkning kræver etablering af en rumlig gradient af ad hoc-kemikalier for at forme aksonal vejledning17. Sidstnævnte metoder involverer fysisk overflademanipulation og bruges mere almindeligt til at strukturere neuronale netværk in vitro. Neuronale celler er fysisk begrænset på ønskede steder af geometriske indeslutninger, såsom mikroskopiske kamre, vægge, kanaler osv., Formning af en biokompatibel polymer såsom polydimethylsiloxan (PDMS) 3,5,6,7,18,19,20 hærdet og størknet til en mikrofluidisk enhed. De facto-metoden til PDMS-mikrofluidisk fabrikation er blød fotolitografi21, hvor en todimensionel maske er mønstret i mikroskala og anvendes til selektivt at ætse et siliciumbaseret materiale ved UV-eksponering. I en nøddeskal overtrækkes en UV-hærdelig harpiks (dvs. fotoresist) på en siliciumskive gennem spin-belægning og når en bestemt højde bestemt af dens viskositet og spindehastighed. Derefter placeres den mønstrede maske over fotoresisten og udsættes for UV-lys. Gennemsigtige områder inden for masken, svarende til områder af interesse, vil lade UV-lys inducere lokaliseret tværbinding af fotoresistmolekylerne. Områderne med ueksponeret fotoresist vaskes væk ved hjælp af et opløsningsmiddel, hvilket resulterer i dannelsen af en masterform. Dette bruges gentagne gange til at bage en elastomer efter eget valg (dvs. PDMS), som derefter graveres med de ønskede geometrier i så mange replikaer som ønsket. En sådan fremstillingsmetode er den mest almindelige metode til fremstilling af mikrofluidiske anordninger22. Måske er de største begrænsninger ved blød fotolitografi forudsætningen for bemærkelsesværdige kapitalinvesteringer og biologiske laboratoriers manglende kendskab til de krævede teknikker og ekspertise. Forberedelsen af masken og trinene i blød fotolitografi, der kræves for at designe komplekse geometrier med flere højder, er ikke-trivielle23 og kræver ofte outsourcing. Selv om der er foreslået alternative lavbudgetmetoder, opfylder de ikke altid de høje præcisionskrav til biologisk prototypefremstilling24.
Her præsenteres en alternativ fremstillingsmetode, der er afhængig af to-fotonpolymerisation (2PP) og additiv fremstilling. Det er ligetil og kræver ikke i sig selv avanceret mikrofabrikation og mikrofotolitografiekspertise. Forskningsfeltet 2PP mikrofremstilling opstod i slutningen af 90'erne25, og siden da har det været vidne til eksponentiel vækst26. Mere om de grundlæggende principper for denne teknik kan findes andetsteds26. Kort sagt, ved at fokusere excitationslysimpulsen i tredimensionelt rum, udnytter 2PP den ikke-lineære afhængighed af multifotonabsorption af intensitet. Dette giver mulighed for begrænset absorption, hvilket sikrer præcis og selektiv excitation inden for meget lokaliserede regioner. I det væsentlige udsættes en negativtonefotoresist, et materiale med nedsat opløselighed ved lyseksponering, for en fokuseret stråle af femtosekundlaserimpulser ved en lav arbejdscyklus27. Dette giver mulighed for impulser med høje intensiteter ved lave gennemsnitlige kræfter, hvilket muliggør polymerisering uden at skade materialet. Interaktionen mellem fotoinducerede radikalmonomerer giver anledning til radikale oligomerer, der initierer polymerisation, der strækker sig gennem fotoresisten op til et særskilt volumen, dvs. voxel, hvis størrelse afhænger af intensiteten og varigheden af laserpulserne28.
I dette arbejde præsenteres to komponenter: A) design og hurtig fremstilling af en 3D-trykt form, der kan genbruges mange gange til fremstilling af engangspolymere neuronale cellekulturanordninger (figur 1), og B) deres mekaniske kobling på overfladen af plane neuronale cellekultursubstrater eller endda af substratintegrerede mikroelektrodearrayer, der er i stand til multisite-optagelser af bioelektriske signaler.
Computer Assisted Design af en 3D mekanisk model er meget kort beskrevet her og ledsaget af trinene, der fører til en 3D-printet form og fremstilling af PDMS-enheder er også detaljeret.
En række computerstøttede designsoftwareapplikationer kan bruges til at generere den startende 3D-objektmodel og producere en STL-fil til styring af 2PP-udskrivningsprocessen. Inden for materialefortegnelsen er de første og de sidste applikationer, der er angivet, gratis eller forsynet med en gratis licens. Konstruktion af en 3D-model kræver altid, at der oprettes en 2D-skitse, som derefter ekstruderes i efterfølgende modelleringstrin. For at demonstrere dette koncept fremhæves en generisk 3D CAD-softwaredesignproces i protokolafsnittet, hvilket fører til en struktur lavet af overlappende terninger. For mere omfattende information er en række online tutorials og gratis træningsressourcer tilgængelige, som angivet i materialetabellen.
Den resulterende STL-fil oversættes derefter til en række kommandoer, der skal udføres af 3D-printeren (dvs. udskæringsprocedure). For den specifikke 2PP 3D-printer i brug, softwaren DeScribe bruges til at importere STL-filen og konvertere den til proprietært General Writing Language (GWL) format. Succesen med 2PP-udskrivningsprocessen afhænger af forskellige parametre, især laserkraft og dens scanningshastighed, syning og ruge-udskæringsafstande. Valget af disse parametre sammen med valget af objektiv og fotoresist afhænger af designets mindste funktioner såvel som den tilsigtede anvendelse. Således bliver parameteroptimering afgørende for at opfylde kravene i forskellige designscenarier og brugssager. Til dette arbejde er den anbefalede opskrift IP-S 25x ITO Shell (3D MF) blevet betragtet som en konfiguration for udskrivningsparametrene. I sidste ende udskrives en mekanisk stabil printet del med den nødvendige opløsning, samtidig med at dens 3D-printtid minimeres.
Formdesignet og den relaterede STL-fil, der demonstreres i dette arbejde, består af en firkantet ramme til at adskille rummet i en cellekultur i to rum: et ydre område (dvs. omtalt som kilde efterfølgende) og et indre område (dvs. omtalt som mål efterfølgende). Disse to rum er forbundet gennem sæt mikrokanaler, der hver især er kendetegnet ved skarpe vinkelgrænser, designet til specifikt at hindre væksten af neuritter fra målet til kilden, men ikke omvendt, og som sådan fremme en retningsbestemt synaptisk forbindelse mellem neuroner, der vokser på de to områder.
Tidligere undersøgelser anvendte forskellige geometrier af mikrokanaler for at fremme retningsbestemt vækst af neuritter. Eksempler omfatter trekantede former18, kanalpiggestrukturer19 og tilspidsede kanaler20. Her anvendes et design med skarpe vinkelbarrierer på tværs af mikrokanalens grænser, der også er kendetegnet ved asymmetriske indgange. Disse mikrokanaler tjener til at etablere kontinuitet mellem et lukket indre, målrummet, og det ydre område, kilderummet. Tragtformen på den indledende del af mikrokanalerne, fra kildesiden, er designet til at fremme dannelsen af aksonale bundter og deres vækst langs den korteste, dvs. lige linje, sti, der forbinder kilden med målet. Det trekantede rum, der realiseres ved at vende mod skarpe vinkler, har større volumen på målsiden for at sigte mod effektivt at forsinke neuritternes stifinding, samtidig med at man favoriserer hurtig optagelse af bundter, der stammer fra kilden og besættelse af det tilgængelige rum. Valget af 540 μm for mikrokanalernes længde filtrerer effektivt den generelt kortere dendritiske udvækst39. Derudover forhindrer deres 5 μm højde cellesomata i at trænge gennem mikrokanalerne. Samlet set viste denne konfiguration sig at fremme ensrettet forbindelse mellem de ydre, kilde og indre målmoduler, og den præsenteres her som et principbevis blandt de mange alternative valg.
Mens PDMS-enhederne, fremstillet af 2PP-formen, kan fastgøres til overfladen af almindelige cellekultursubstrater, såsom glasdæksler eller petriskåle, blev der i dette arbejde anvendt kommercielt tilgængelige substratintegrerede mikroelektrodearrayer. Der er ikke gjort noget for at optimere 3D-designet til mikroelektrodearray-layoutet, og den mekaniske kobling blev udført under stereomikroskopivejledning, der kun sigter mod at placere enheden på tværs af arrayet, hvilket efterlader noget mikroelektrode afdækket i begge sider, kilden og målet. Dette muliggør en foreløbig vurdering af de funktionelle konsekvenser af den begrænsede forbindelse i neuronale cellekulturer.
Protocol
Alle procedurer, der involverer håndtering af dyr, blev udført i overensstemmelse med europæisk og italiensk lovgivning (Europa-Parlamentets og Rådets direktiv af 22. september 2010 [2010/63/EU]; Italiensk regeringsdekret af 4. marts 2014, nr. 26), blev udtrykkeligt godkendt af den institutionelle OpBA (Committee for Animal Care) ved Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati og blev officielt godkendt af det italienske sundhedsministerium (Auth. nr. 22DAB. N.UVD). Disse førte til tilgængeligheden af ikke-følende materiale fra det udplantede rottehjernevæv, der skulle bruges til eksperimentel validering af den metode, der præsenteres i dette arbejde.
1. 3D formfremstilling ved to-fotonpolymerisation
- Generering af CAD-filer
BEMÆRK: Følgende trin demonstrerer en generisk 3D-designarbejdsgang, der anvender computerstøttet designsoftware (dvs. SolidWorks). Eksemplet på STL-designfilen, der er beskrevet i dette arbejde (figur 2), er tilgængelig som supplerende kodningsfil 1 såvel som gennem Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).- Start desktop-applikationen til computerstøttet designsoftware. Fra den øverste menulinje skal du vælge Ny.
- Vælg Del fra indstillingerne : en 3D-repræsentation af en enkelt designkomponent. Tryk på tastekombinationen Ctrl + 5 for at etablere skitsens øverste visning.
- Vælg Skitse i sidepanelet, og vælg Hjørnerektangel. Vælg den ene kant af rektanglet ved at klikke på den. Når et parameterpanel vises, skal du indstille længden til 100 enheder.
- Gentag trin 1.1.3 for kanten vinkelret på den forrige: Indstil længden til 50 enheder. Vælg rektanglet ved at trække over det, mens du holder venstre museknap nede.
- I menuen Tilføj relation skal du vælge Ret for at begrænse relationerne mellem linjerne.
- Afslut skitsen, og gentag trin 1.1.3 til 1.1.5, og opret et nyt (mindre) rektangel, der overlapper den forrige skitse.
- Vælg Funktioner i sidepanelet, og vælg Ekstruderet boss/base: Indstil dybden af både de store og små rektangler til henholdsvis 5 og 10 enheder.
- Fra menuen Filer skal du gemme delen i STL-format (dvs. Standard Tessellation Language).
- Behandling af CAD-filer
- Overfør STL-filen til en pc, der er udstyret med DeScribe-applikationssoftwaren.
- Start Beskriv og åbn STL-filen fra menuen Filer. En 3D-repræsentation af modellen vises.
- Fra retningsafsnittet i menuen til højre skal du dreje modellen for at orientere den korrekt i rummet og centrere den i planet.
- Juster den overordnede skalering ved at vælge afsnittet Skalering i menuen til højre.
- Fra rullemenuen øverst skal du vælge IP-S 25x ITO Shell (3D MF) opskrift. Dette specificerer IP-S som fotoresist, 25x for forstørrelseskraften for objektivet, Indium Tinoxid (ITO) belagt substrat som tryksubstrat og skal- og stilladsudskrivning som driftstilstand med mellemstore funktioner (MF).
- Naviger gennem guiden, vælg og indstil Udskæringsafstand til 1 μm og Skraveringsafstand til 0,5 μm for både skallen og stilladset.
- I outputtrinnet i importguiden skal du under opdeling definere blokstørrelsen som X = 200 μm, Y = 200 μm og Z = 265 μm og blokforskydningen som X = 133 μm, Y = 133 μm og Z = 0, hvilket sikrer, at mikrokanalernes sarte strukturer ikke påvirkes af syningslinjerne.
- Som scanningstilstand skal du bruge standarden: Galvo til X-Y-plan og Piezo til Z-aksen.
- Tryk på Gem , og erstat linjen var $baseLaserPower = $shellLaserPower i den næste tekstmenu med var $baseLaserPower = 75 for at reducere lasereffekten på det laveste lag af udskriften til 75%.
- Overfør GWL-filerne, der er opnået ved ovenstående trin, til arbejdsstationen dedikeret til 2PP 3D-udskrivning.
- 3D-print og prøveudvikling
- Start NanoWrite-applikationssoftwaren . Efter printerinitialisering skal du klikke på Exchange Holder på softwaregrænsefladen for at indsætte substratholderen og montere målet.
- Monter 25x-målet i den rigtige position på næsestykket. Identificer, hvilken side af glassubstratet der er belagt med ITO, ved hjælp af et elektronisk multimeter, der er indstillet til at måle modstande: aflæsningen skal være lave værdier, såsom 100-300 Ω, men kun for den ITO-belagte side.
- Placer glasunderlaget på holderen, og vend den ITO-belagte side opad. Brug tape til at holde den fast på plads.
- Under den kemiske damphætte påføres en dråbe IP-S fotoresist i midten af glassubstratet.
- Indsæt holderen i 3D-printeren med harpiksdråben vendt mod målet (dvs. nedad).
- Gennem softwaremenuen Filer skal du indlæse GWL-filerne. Vælg Indflyvningseksempel for at flytte målet tæt på harpiksdråben.
- Vælg Find grænseflade for at tillade registrering af ITO-fotoresist-udskrivningsgrænsefladen baseret på brydningsindeksforskellen mellem de to materialer.
- Vælg Start job for at starte udskrivningen. Når udskrivningen er færdig, skal du trykke på Ombytningsholder for at hente holderen.
- Tag holderen frem, og fjern forsigtigt underlaget med den trykte del. Nedsænk glassubstratet i propylenglycolmethyletheracetat (PGMEA) i 20 minutter under stinkhætten for at udvikle den trykte del.
- Fjern substratet fra PGMEA og nedsænk det i isopropanol i 5 min. Lad den trykte del lufttørre under den kemiske damphætte.
- Efterbehandling og formmontering
- Hærd den trykte del ved udsættelse for UV-lys (dvs. 365-405 nm) med tilstrækkelig effekt i 5-20 minutter (se diskussion for strømdetaljer).
- Under en laminær strømningshætte skal du forsigtigt fjerne den trykte del fra glassubstratet. Drop ~2 μL harpiks i bunden af en 35 mm x 10 mm petriskål.
- Placer forsigtigt den trykte del over dråben, og lad harpiksen flyde under delen. Hærd den trykte del yderligere ved udsættelse for UV-lys i 5 min.
- Dæk petriskålen med hætten og overfør den til ovnen til varmehærdning, over 30 minutter ved 80 °C. Forvarm ikke ovnen for at undgå deformation eller brud på den trykte del. Efter hærdning fastgøres den trykte del permanent til bunden af petriskålen. Fra nu af vil den trykte og monterede del blive omtalt som skimmelsvamp.
2. Fremstilling af PDMS-enheder fra form- og cellekultursubstraterne
- Fremstilling af PDMS-enheder
- Forbered 20 ml 10: 1 (vægtforhold) blanding af basen oghærdningsmidlet af upolymeriseret PDMS. For hver enhed og afhængigt af den krævede højde er 1-2 ml PDMS-blanding nok. Opbevar det overskydende upolymeriserede PDMS ved -20 °C til senere brug.
- Under en laminær strømningshætte omrøres blandingen grundigt i 4 min. Da blandingen fanger luftbobler jævnt, bliver den uigennemsigtig.
- Overfør blandingen til et 50 μL μrør og centrifuger det ved 168 x g i 5 minutter for at fjerne luftbobler fra blandingen og opnå et klart udseende.
- Behandl formen med 10 μL hydrofobismiddel (dvs. Repel-silan ES) og lad den hvile i 7 minutter, hvilket sikrer en jævn løsrivelse af det polymeriserede PDMS fra formen senere.
- Skyl skimmelsvamp 1x med 70% ethanol og 2x med deioniseret (DI) vand. Lad formen lufttørre under laminar strømningshætte.
- Hæld forsigtigt PDMS-blandingen på formen, indtil enhedens tilsigtede endelige højde er nået. For at forhindre dannelse af luftbobler hældes blandingen forsigtigt og tæt på formens overflade.
- Dæk formen til og overfør den i 18 minutter til en ovn, der er forvarmet og stabiliseret ved 80 °C, til hærdning. For enhedshøjder mere end 5 mm og op til 1 cm forlænges hærdetiden fra 18 til 25 min.
- Under laminar flowhætten løsnes forsigtigt den hærdede PDMS-blok fra formen og nedsænkes i isopropanol i mindst 10 minutter inde i en petriskål af glas. Isopropanol eliminerer utværbundet PDMS. Hold altid PDMS-blokken tildækket.
- Forny isopropanolen, og skær forsigtigt den centrale firkantede del af enheden (identificeret som målområdet i dette arbejde) ud under et stereomikroskop med en oftalmisk stikkniv. Fortsæt derefter med at skære yderligere langs kanterne for at opnå enhedens ultimative form.
- Hent enheden fra isopropanol og nedsænk den i ethanol i 30 minutter, og skyl den derefter 3x med sterilt DI-vand. Oprethold sterilitet fra dette tidspunkt og fremefter.
- Under en laminar strømningshætte overføres enheden til en ny petriskål, og lad hætten være let åben. Lad det lufttørre helt.
- Forberedelse af enhedsmontering og cellekultursubstrater.
- Steriliser hvert mikroelektrodearrays (MEA'er) ved at nedsænke i 70% ethanol i 30 minutter, og skyl det derefter 3x med sterilt DI-vand.
- Brug sterile fine pincetter under en laminær strømningshætte og stereomikroskop til at montere PDMS-enheden på det indre område af et MEA. Juster den ene side af PDMS-enheden til midten af det indre MEA-område med substratintegrerede mikroelektroder, så få mikroelektroder efterlades afdækket fra både kilde- og målområder (se figur 2).
BEMÆRK: Til dette arbejde er det ikke nødvendigt at justere MEA-mikroelektroder til PDMS-enhedens mikrokanal. Det kan være nødvendigt med et forsigtigt tryk på enheden for at opnå en tæt forsegling mellem PDMS-enheden og MEA-overfladen. Undgå for enhver pris at røre mikroelektroderne ved pincettens spids. - Indsæt MEA med PDMS-enheden på den i plasmarensekammeret for at aktivere overfladeaktiveringen gennem luftplasma. Start processen med en 4 minutters vakuumpumpe evakuering af kammeret. Åbn derefter luftventilen lidt for at tillade kontrolleret luftblødning. Luk luftventilen, og tænd plasmainduktorerne, juster RF-effektniveauet mellem 10 W og 18 W.
- Når et glødende lys vises, lad processen køre i 80 s. Sluk derefter plasmainduceren, luk vakuumpumpeventilen, og åbn forsigtigt luftventilen. Åbn kammeret for at hente MEA.
BEMÆRK: Hvis plasmabehandlingen indebærer udsættelse af MEA'er for et ikke-sterilt miljø, skal du placere hvert MEA under UV-lys i en laminær strømningshætte i 30 minutter for at sikre steriliteten. - Tilsæt 1 ml polyethyleneimin (PEI) 0,1% vægt/vol opløsning til MEA og inkuber den ved 37 °C natten over. Opsug PEI-opløsningen og skyl med sterilt DI-vand 5x. Tilsæt 1 ml af cellekulturmediet til MEA og inkuber det før cellesåning.
3. Neuronal cellekultur og elektrofysiologi
- Forbered dissektionsmediet, fordøjelsesopløsningen og opløsningerne 1-3 på forhånd (se tabel 1).
- Dissocieret neuronal cellekultur.
- Tag forsigtigt fat i en neonatal Wistar-rotteunge i alderen 0-1 dage ved snuden og udfør hurtig halshugning ved hjælp af en skarp saks.
- Skræl hovedbundens hud af, lav et snit langs den sagittale midterlinje af kraniet ved hjælp af en fin saks, og lav derefter et koronalt snit gennem kraniet ved krydset af lillehjernen.
- Fjern kraniet, øs hjernen ud med en fin spatel og overfør den til koldt (4 °C) dissektionsmedium.
- Fjern det subkortikale væv, hippocampus og meninges. Hak vævet i små stykker (dvs. 1-2 mm3) og overfør dem i et 15 ml rør. Kassér opløsningen, og skyl vævet med frisk dissektionsmedium efterfulgt af en vask med fordøjelsesmedium.
- Kassér fordøjelsesmediet, og tilsæt derefter 1 ml opløsning 1. Blandingen inkuberes ved 37 °C i 5 min. Kassér opløsning 1 og skyl vævet med frisk dissektionsmedium. Derefter tilsættes 1 ml opløsning 2 og opbevares i 10 minutter ved 4 °C.
- Kassér opløsning 2 og skyl vævet med frisk dissektionsmedium. Derefter tilsættes 1 ml opløsning 3. Cellerne adskilles mekanisk ved langsomt at pipettere op og ned i opløsningen 20 til 30 gange. Når der fremkommer en ensartet uklar blanding af dissocierede celler, hæves dens volumen til 3 ml ved at tilsætte dissektionsmedium.
- Opsaml cellepillen ved centrifugering af blandingen ved 100 x g i 5 min. Supernatanten suges op, og cellepelletsen opslæmmes i 1 ml forvarmet dyrkningsmedium.
- Tæl celler (dvs. ved et celletællingskammer) og juster densiteten af cellesåningsopløsningen i overensstemmelse hermed.
- Hver MEA frøs med 1 ml såopløsning med en nominel celletæthed på 1,8 x 106 (~ 6500 celler/mm2). De seedede MEA'er inkuberes i en fugtig inkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Udskift mediet med frisk (dvs. ugentligt fremstillet) kulturmedium hver 2. dag.
- Ekstracellulær elektrofysiologi
BEMÆRK: Dissocierede neuronale cellekulturer når en fuldt moden elektrisk fænotype efter 2-3 uger in vitro. De følgende afsnit beskriver en ekstracellulær stimuleringsprotokol ved hjælp af en kommerciel MEA-applikationssoftware (Experimenter) til elektrisk stimulering af en af de neuronale populationer, der dyrkes i moduler, dvs. kilde eller mål, samtidig med at begge populationers aktivitet registreres i modne netværk.- Monter forsigtigt et MEA inde i hovedscenen på den elektroniske multikanalforstærker inde i en tør inkubator (37 °C, 5% CO2), og lad den rumme i 10 minutter. En brugerdefineret PDMS-hætte kan fremstilles separat og bruges som et tæt dæksel til hver MEA for at reducere vandfordampning og opretholde sterilitet.
- Start Experimenter-softwaren. Indstil samplinghastigheden til 25 kHz, og start dataindsamlingen ved at trykke på Start DAQ. I panelet Datavisning vises de rå spor af ekstracellulært registreret aktivitet for hver kanal.
- Overvåg den spontane aktivitet, og identificer og vælg visuelt 3 par nærliggende mikroelektroder, der er aktive under udbrud af spontane synkroniserede aktivitetsudbrud i hele netværket, enten fra mikroelektroderne på kilde- eller målsiden.
- I stimulatorpanelet i softwaren skal du konfigurere parametrene for hvert af de stimulerende mikroelektrodepar i bipolær konfiguration: Vælg en bifasisk pulsbølgeform, og indstil topamplituderne til ± 800 mV og pulsvarigheden til 200 μs.
- Indstil optageren og optag i en periode på 300 ms før til 1000 ms efter stimuleringen.
- Gentag trin 3.3.3 til 3.3.5 for kilden og målsiden på en sammenflettet måde for det krævede antal gentagelser.
Representative Results
Fremstillingen af en 2-rums polymer (neuronal) cellekulturenhed rapporteres her, hvilket eksemplificerer brugen af 2PP 3D-udskrivning til hurtig prototyping af PDMS-enheder. Specifikt produceres en enhed til modulære neuronale netværk med ensrettet synaptisk forbindelse, og dens funktionelle karakterisering præsenteres med hensyn til multisite ekstracellulær elektrofysiologi. Kort fortalt blev en mikrometerskalaform realiseret ved hjælp af direkte laserskrivning ved hjælp af en kommercielt tilgængelig 3D-printer. Især leverer printeren en effekt på 50 mW gennem laserimpulser med centerbølgelængde på 780 nm og en varighed på 80 til 100 fs. Under fremstillingsprocessen fokuseres laserstrålen gennem printerens mål (25x, NA = 0,8) på negativtonefotoresisten (IP-S) for at scanne udskrivningsvolumen ved hjælp af galvo-scanneren til x- og y-akserne og piezo-trinnet til z-aksen. Trykvolumen blev passende opdelt i blokke på 200 mm x 200 mm x 265 mm for at realisere en form med en samlet størrelse på 6500 mm x 6500 mm x 545 mm og nominelt volumen på 12.423 ml. Figur 2A repræsenterer en 2D-skitse af formen, der fremhæver dens dimensioner og funktioners størrelse, mens figur 2B viser et nærbillede af den færdige enhed monteret på en MEA. De forme, der blev fremstillet som beskrevet i det foregående afsnit, var holdbare og kunne genbruges mere end 50 gange til fremstilling af PDMS-enheder.
Den trykte form blev brugt til støbning af PDMS-enheden, som derefter blev monteret på det indre område af glassubstratintegrerede arrays af mikroelektroderarrays (MEA), der skulle bruges til multisite ekstracellulære optagelser af neuronal elektrisk aktivitet og som et principbevis. Kommercielle substratintegrerede MEA'er blev brugt til at overvåge aktiviteten af modulære kulturer som reaktion på rumligt lokaliserede elektriske stimuli leveret ekstracellulært af en delmængde af mikroelecrode placeret i hvert kulturrum. Hver MEA indeholder 120 titannitrat (TiN) mikroelektroder med en diameter på 30 μm og 100 μm interelektrodestigning. Figur 2C-D viser placeringen af PDMS-enheden øverst på MEA. De geometriske træk ved enhedens individuelle mikrokanaler sammen med kammerets samlede fodaftryk vist i figur 2C fører til en opdeling af de dyrkede neuroner. Disse kan skelnes ud fra det rum, de tilhører, i enhedens ydre område (kilde) eller i enhedens indre område (mål). Den foretrukne aksonale vejledning, begrænset fra kilden til målet, dikteres af mikrokanalernes skarpvinklede kanter. Figur 2D viser placeringen af den polymere anordning på MEA og det relative dækningsområde for registreringselektroder placeret inden for kilde- eller målrummene. Bemærk, at en præcis justering af indersiden af enhedens mikrokanaler til en eller flere rækker MEA-mikroelektroder hverken var påkrævet for vores casestudie eller forfulgt.
Figur 3 giver repræsentativ dokumentation for asymmetrisk neuritvækst under ex vivo-udvikling, der viser fluorescerende mærkede neuritter i levende billeddannelse, 6 dage (figur 3A) og 2 dage efter celleplettering (figur 3B-D). Mens neuritterne på målsiden af enheden stødte på skarpe vinkelbarrierer som forhindringer, der hindrede deres progression gennem rummet, voksede neuritterne, der stammer fra kildesiden, uafbrudt og krydsede kanalerne. Denne asymmetri favoriserer en ensrettet aksonal forbindelse mellem neuroner i de to rum, der projicerer fra kilde til mål, som eksplicit beregnet fra designet. Dette resultat understøttes yderligere af en (funktionel) elektrofysiologisk evaluering af elektriske reaktioner fremkaldt af stimuli, der alternativt leveres i hvert af de to rum.
Efter 3-4 uger in vitro, da neuronale netværk nåede fuld modenhed29,30, kunne den funktionelle forbindelse på tværs af de to rum undersøges ved at levere korte elektriske stimuli og overvåge de neuronale reaktioner, de fremkaldte31. Bifasiske elektriske impulser med en amplitude på 800 mV blev derefter alternativt kun anvendt på kilden eller kun på målpopulationerne (N-gentagelser = 150, N-modulære kulturer = 6), leveret af 3 sidestillede par plane mikroelektroder i en bipolær konfiguration og på en sammenflettet måde. Derfor kunne de 3 par elektroder placeres inden for MEA's kildeområde eller inden for MEA's målområde. De elektriske reaktioner, der fremkaldes af hver stimulus, kunne derefter detekteres af alle MEA-mikroelektroder efter en udbredelsesforsinkelse. Optagelser blev udført med en samplinghastighed på 25 kHz / kanal, og de resulterende ekstracellulære rå elektriske signaler blev digitaliseret ved en analog-til-digital konverteringsopløsning på 16 bit. En tærskelkrydsningsalgoritme32 blev brugt offline til at detektere tidspunktet for forekomster af ekstracellulære handlingspotentialer uden at udføre nogen spidssortering. Figur 4A-B afslører klart en stærk asymmetri af fremkaldte reaktioner, gentaget 150 gange, afhængigt af placeringen af stimulusleveringen, hvilket tyder på en betydelig funktionel indvirkning af de geometriske begrænsninger på den foretrukne retningsvirkning af konnektivitet. Efter stimulering af kildesiden steg affyringshastigheden for kildeneuronpopulationen - estimeret ved beregning af peri-stimulus spike-times histogrammet - som forventet og genererede en fuld netværksudbrud af handlingspotentialer 33,31,34, og den blev efterfulgt efter en forsinkelse af en stigning i målpopulationens affyringshastighed. Men da stimuleringen blev leveret inden for målpopulationen, steg kun skudfrekvensen for målpopulationen, idet kildepopulationen for det meste forblev tavs. Figur 4C-D gentager det samme stimulus / responsparadigme i en kontrolkultur, uden polymer enhed til stede (dvs. en ustruktureret neuronal kultur), blev de ekstracellulære stimuli også leveret over 4 gentagelser. For sådanne kontrolbetingelser forekom der ingen asymmetri i de reaktioner, der blev fremkaldt af nogen af stimulus. Mens delmængden af MEA-mikroelektroder, der blev brugt til at levere stimuli, matchede den, der blev brugt i modulære netværk, førte placeringen af stimulusleveringen til et lignende fremkaldt respons fra hele befolkningen. Dette bekræfter, at PDMS-enheden foretrak ensrettet synaptisk forbindelse på tværs af de to rum. Samlet set indikerer asymmetriske reaktioner fremkaldt i modulære kulturer (N = 6) og symmetriske reaktioner fremkaldt i kontrolkulturer (N = 4) stærkt en begrænset anatomisk forbindelse af et opdelt in vitro-system. De elektrofysiologiske data og de scripts, der bruges til at generere figur 4, stilles til rådighed via Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).
Figur 1: Skitse af 2PP mikroformfremstilling og PDMS replika støbning. (A) En 3D-model er designet i CAD og eksporteret i Standard Tessellation Language (STL) format fil, (B) instruere sin 2-foton 3D-udskrivning gennem laserinduceret polymerisering i en dråbe harpiks (IP-S). (C) Den resulterende struktur anvendes som en form til gentagen fremstilling af PDMS-replikaer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempel på intern hurtig prototyping af en polymer (neuronal) cellekultur PDMS-enhed. (A) På mindre end 24 timer gør additiv fremstilling i mikroskala det muligt at gå fra en CAD-model til en 3D-printet master, der skal bruges straks og gentagne gange som en replika form med biokompatible elastomerer, såsom PDMS. (B-C) De resulterende PDMS-enheder er koblet til et neuronalt cellekulturplan substrat, her repræsenteret af en række mikroelektroder. For det specifikke prøvedesign i (A) defineres to kamre: et benævnt kilde og angivet med S, og det andet benævnt mål og angivet med T. (D) Neuroner belagt i hvert kammer kan kun vokse deres neuritter gennem en række mikrokanaler. Når de justeres korrekt under stereomikroskopivejledning i (C), efterlades to sæt substratintegrerede mikroelektroder eksponeret, således at den bioelektriske aktivitet af nærliggende neuroner placeret i begge rum kan stimuleres og registreres. Bemærk her, at justering af mikroelektroder inden for individuelle mikrokanaler ikke var prioriteten for dette principbevis. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Live imaging af celleimpermeant fluorescerende reportermolekyler, identificerer neuritter forlænget af neuroner, få dage efter celleplettering. (A-D) Repræsentative konfokale fluorescensmikrografier af modulære neuronale kulturer af enheden fremstillet fra figur 1 og figur 2 (N = 4, 128 individuelle mikrokanaler) er erhvervet 2 og 6 dage efter celleplettering. (B-D) 40x forstørrelse og en omvendt gråskala af mikrograferne for øget synlighed. Enderne af mikrokanalerne fra kilde- og målrummene betegnes med henholdsvis S og T. (A) viser det brede scanningsbillede af kulturen, hvor Source (dvs. det indre firkantede område) og Target (dvs. det ydre område) er fulde af celler, 6 dage efter plettering. (B) og (C) viser på det tidligere tidspunkt på 2 dage efter plettering væksten af neuritter ved henholdsvis kilden og målsiderne af mikrokanalerne. De små sorte trekanter indikerer repræsentative eksempler på formodede axonbundter terminaler, der tilsyneladende kun stammer fra kilden. De pilformede mikrokanalers grænser peger på forlængelsen af neuritter langs kanten (B), hvor deres passage er uafbrudt og styret mod målet. I den modsatte retning og ved siden af målenden af en mikrokanal (C) er neuritter, der stammer fra målet og rykker frem til kildesiden, fanget i de skarpe hjørner. (D) afslører yderligere detaljerne i neuritudvækst inde i en mikrokanal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Funktionel karakterisering af neuronale elektriske reaktioner, med og uden PDMS-enheden. MEA'er blev brugt som celledyrkningssubstrater og anvendt til at måle de netværksdækkende spiking-responser fremkaldt af en meget kort (dvs. 200 μs, 0,8V) bifasisk elektrisk stimuleringspuls, leveret i en bipolær konfiguration. Med PDMS-enheden i figur 2 varierer de neuronale spiking-responser, der er registreret fra kilden (rød) og fra målet (blå), afhængigt af hvor stimulus leveres. Formodede aksonale, synaptiske og integrationsforsinkelser bliver tydelige i (A), men ikke i (B), hvilket tyder på, at der findes en foretrukken synaptisk forbindelse (dvs. fra kilde til mål). (C-D) Under kontrolbetingelser (dvs. uden PDMS-enhed) afhænger fremkaldte reaktioner detekteret ved to forskellige sæt MEA-mikroelektroder ikke af stimulusleveringsstedet. Den blege skygge, der omslutter linjerne i plottene, angiver middelværdiens øjeblikkelige standardfejl (N-stimuli = 150). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Navn på løsning | Sammensætning | ||
| polyethyleneimin (PEI) 0,1% | 1 ml PEI-stamopløsning, 9 ml sterilt deioniseret (DI) vand. | ||
| Kulturmedium (50 ml) | Minimum Essential Medium (MEM), suppleret med 20 μM glucose, 50 μg/ml Gentamicin, 50 μM L-glutamin og 10% varmeinaktiveret hesteserum. | ||
| Dissektionsmedium (1000 ml) | Hanks′ Balancerede salte 9,52 g, natriumbicarbonat 350 mg, HEPES 2,83 g, D-(+)-glucose 6 g, kynurensyre (slutkoncentration 200 μM), D-AP5 (slutkoncentration 25 μM), Gentamicin 250 μl, bovin serumalbumin 300 mg, magnesiumsulfat 1,44 g. Juster pH-værdien til 7,3, beskyt mod lys og opbevar ved 4 °C. | ||
| Fordøjelsesmedium (100 ml) | Natriumchlorid 800 mg, kaliumchlorid 37 mg, dinatriumhydrogenphosphat 99 mg, HEPES 600 mg, natriumbicarbonat 35 mg, kynurensyre, 200 μL (fra 100 mM lager), D-AP5 100 μL (fra lager 25 mM). pH-værdien indstilles til 7,4, beskyttes mod lys og opbevares ved 4 °C. | ||
| Løsning 1 | Trypsin 5 mg, Deoxyribonuklease I 1,5 mg, i 2 ml fordøjelsesmedium. | ||
| Løsning 2 | Trypsinhæmmer 5 mg, i 5 ml dissektionsmedium. | ||
| Løsning 3 | Deoxyribonuklease I 1,5 g, i 2,5 ml dissektionsmedium. | ||
Tabel 1: Tabel over løsninger. Se materialeoversigten for produktbeskrivelser.
Supplerende kodningsfil 1: STL-designfilen svarer til strukturen afbildet i figur 2A. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
På trods af at den er årtier gammel, er anvendelsen af 2PP-teknologi i mikrometerskala PDMS-baseret replikastøbning en nylig udvikling43,44. I denne sammenhæng diskuteres en række punkter nedenfor for at hjælpe brugerne med effektivt at gengive dette værk.
Ved 3D-modeldesign skal du sikre dig, at modellen ikke har huller eller selvskæringer. Privilegium det binære filformat, når du gemmer som STL, for dets mindre filstørrelse fodaftryk end ASCII-kodet. Dette er især gavnligt for design med indviklede geometrier og for milliliter brede genstande. Brug af binære STL-filer indebærer også lav CPU-belastning, senere i processen forbereder den mekaniske del, der skal 3d-printes. Funktionernes fysiske dimensioner i STL-filen er repræsenteret i dimensionsløse enheder. Under efterbehandling af STL-filen fortolkes enheder som mikrometer. Derfor anbefales det at vedtage på forhånd interesseenheden, dvs. mikrometer, når filen udarbejdes. Nøjagtigheden af den trykte model bestemmes af antallet af overflader, der tilnærmer tessellerede trekanter. For et utilstrækkeligt antal overflader vil uønsket overfladeruhed opstå. Ikke desto mindre kommer målet om overdreven høj nøjagtighed af et meget stort antal overflader til prisen for en høj beregningsbelastning, hvilket får filbehandlingen til at være langsom.
Til 3D-udskrivning dannes det fysiske 3D-objekt under udskrivning ved hjælp af hurtig galvo-scanning i x-y-planet og piezobevægelse i z-retningen. Dette fokuserer femtosekundlaserstrålen inden for en given 3D-voxel. Men når udskrivningsstrukturer er større end galvoens og piezoens rumlige dækningsområder, skal objektet programmatisk opdeles i blokke. Selvom dette er et krav til trykte dele i millimeterstørrelse, er kryds mellem blokke forbundet med (ufuldkomne) sylinjer. Omhyggelig optimering af antallet af blokke og placering af sylinjer i x-, y- og z-retninger er afgørende for at undgå at forstyrre kritiske geometriske træk ved det endelige objekt med syningslinjer. Der kan dannes bobler ved udskrivningsgrænsefladen af forskellige årsager (f.eks. substrater fotoresists urenheder og inhomogeniteter) og påvirke kvaliteten og integriteten af den trykte struktur negativt. Desuden kan højere lasereffekt føre til en stigning i deres forekomst. Reduktion af lasereffekten ved det laveste lag af den trykte del minimerer chancerne for bobledannelse. Som et alternativ til at udskrive hele delen som en solid struktur kan skal- og stilladsmetoden overvejes. Det indebærer kun udskrivning af den ydre overflade af delen (skallen) samt trekantede prismeelementer i den. Disse elementer adskilles af vandrette lag (stillads), der holder den upolymeriserede harpiks i små lommer. Denne metode forkorter udskrivningstiden betydeligt, især relevant for strukturer i millimeterstørrelse. Da der imidlertid forbliver ikke-polymeriseret harpiks, er UV-eksponering efter udskrivning bydende nødvendig for at sikre fuld mekanisk stabilitet, selvom dette trin skal udføres forsigtigt for at undgå deformation af den trykte del. Efterhærdningstiden afhænger af den valgte harpiks, delens tykkelse og UV-effekt40. For optimale resultater anbefales det at gennemføre et indledende forsøg for at estimere den tid, der er nødvendig for hærdning i fuld dybde, ved hjælp af en dråbe fotoresist og evaluere dens sektionssnit efter UV-eksponering. Den sædvanlige hærdningsperiode varierer mellem 5 og 20 min.
For PDMS-replikastøbning kan ren fremstilling af en PDMS-enhed med mikrometerskalafunktioner uden renrumsfaciliteter være udfordrende: luftbårne mikropartikler kan opholde sig på PDMS'ens stærkt klæbende overflade og hindre tætningen mellem enheden og substratet eller blokere sektionen af individuelle mikrokanaler. Udførelse af protokoltrinnene under en laminær strømningshætte og konsekvent afskærmning af PDMS-overfladen med isopropanol minimerer kontamineringsrisikoen betydeligt. Hærdningstemperaturen og dens varighed påvirker direkte PDMS-tværbinding og de resulterende fysiske egenskaber. Især klæbeevnen af hærdet PDMS er en kritisk faktor. På den ene side kræves en tæt forsegling mellem PDMS-enheden og overfladen, der anvendes til neuronal celledyrkning (f.eks. Et glasdæksel eller et MEA) for effektivt at begrænse neuritternes passage. På den anden side skal PDMS-enheden fastgøres til overfladen reversibelt, så det sarte isolerende lag MEA'er ikke beskadiges efter fjernelse af enheden. Mens PDMS-krympning under hærdning forekommer og kan korrigeres ved forudgående reskalering af formen, vil krympning for temperaturer og hærdningsintervaller, der er angivet her, være mindre end 2%42 og vil ikke påvirke signifikant, enkeltlags PDMS-enheder. Samlet set skal du nøjagtigt følge de anbefalede hærdningstemperatur- og varighedsværdier for de bedste resultater.
Oversigt over fordele og begrænsninger ved metoden
En teknik baseret på 2-foton direkte laserskrivning foreslås til hurtig fremstilling af mikroskala polymere enheder til eksperimentel undersøgelse af modulære neurale netværk. I modsætning til blød fotolitografi kræver den foreslåede tilgang ikke et højt niveau af teknisk ekspertise, forudsat at en funktionel 2PP 3D-printopsætning er tilgængelig og operationel. Bemærkelsesværdigt gør metoden det muligt at gå fra en CAD-designet 3D-model til en funktionel PDMS-enhed inden for en enkelt dag, hvilket giver en direkte og effektiv vej fra koncept til håndgribelig realisering. Specifikt reducerer valg af skal-og-stilladsudskrivningstilstand betydeligt den tid, der er nødvendig for at skabe formen, da kun en brøkdel af dens volumen udskrives. Efterfølgende UV-hærdning af den printede komponent garanterer dens mekaniske stabilitet og robusthed, som verificeret her over 50 støbecyklusser med PDMS.
Sammenlignet med traditionelle metoder har 2PP 3D-print en klar fordel, som er mest udtalt, når det kommer til fremstilling af forme med et betydeligt billedformat, krævende opløsningskrav og komplekse tredimensionelle geometrier. Produktionen af masterforme ved hjælp af standard UV-litografi er begrænset af en modstandstykkelse på ca. 200 μm. Indviklede sekvenser af spin-belægning og eksponeringscyklusser35, dyre LIGA (litografi, galvanisering og støbning) eller dyb reaktiv ionætsning (DRIE) processer36 er nødvendige for at opnå større højde- og billedformater. I skarp kontrast, som demonstreret i Kumi et al.'s banebrydende arbejde i 201037, tilbyder 2PP-teknikken et i det væsentlige ubegrænset omfang for billedformatet for de trykte dele, der spænder fra submikrometer til millimeter. Her er mikrofremstillingsprocessen for en form med betydelig forskel i højden af dens portioner blevet eksemplificeret med over en 100 gange skelnen mellem mikrokanalernes højde (5 μm og den maksimale formens højde (545 μm; se figur 2).
Submikrometeropløsning kan også let opnås ved at følge de skitserede protokolspecifikationer. Til sammenligning kræver det kapitalinvesteringer at opnå forbedrede formopløsninger gennem UV-fotolitografi. Maskerne med den fineste opløsning, der udnytter kromaflejring på kvarts med en nominel opløsning på 600 nm, er prissat flere størrelsesordener højere end de lasertrykte overliggende gennemsigtighedsmasker, som har en opløsning på 250 μm35, se dog arbejdet med Pirlo et al.41. For at være levedygtig til intern brug skal en valgt metode være omkostningseffektiv. For mange biologiske laboratorier udgør den samlede udgift forbundet med konventionel blød fotolitografi eller direkte laserskrivning en barriere. Selv om det er muligt at gøre begge teknologier mere tilgængelige ved at købe og samle de væsentlige komponenter, kræver denne tilgang yderligere ekspertise og kræver stadig en betydelig investering. I denne sammenhæng er et vigtigt punkt at overveje det bredere spektrum af applikationer, der kan opnås gennem direkte laserskrivning. I modsætning til konventionel blød fotolitografi, primært begrænset til formmikroproduktion, udviser 2PP 3D-udskrivning bemærkelsesværdig alsidighed. Dens potentielle anvendelser spænder fra mikrofluidik og mikrooptik til integreret fotonik og mikromekanik. Dette gør investering i denne teknologi tiltalende som en fælles facilitet for flere og forskellige videnskabelige områder. For eksempel er den 2PP-baserede metode, der er udviklet i denne protokol, resultatet af et tværfagligt samarbejde mellem neurovidenskabs- og matematikafdelinger inden for vores institution. Derudover er fotoresistudviklingen et aktivt forskningsfelt og kan potentielt udvide anvendelsesområdet for 2PP 3D-udskrivning. Et eksempel herpå er den nylige introduktion af IP-PDMS-harpiks. Ved at polymerisere til strukturer med egenskaber som PDMS38 frigør denne harpiks potentialet for direkte mikrofabrikation af biokompatible komponenter, der har indviklet overflade eller indeholder hule rum. Disse forviklinger står som barrierer for at opnå lignende resultater gennem konventionelle replikastøbningsprocedurer.
Som en demonstration af denne metode blev der fremlagt beviser, der tyder på udviklingen af ensrettet forbindelse mellem to moduler i et modulært neuronalt netværk. Mikroskalaformen, fremstillet ved 2PP-teknik, havde tilstrækkelig udholdenhed til at gennemgå flere PDMS-støbning og har den krævede præcision i mikroskala. Afslutningsvis strækker anvendelsesområdet for den protokol, der er beskrevet i dette arbejde, sig ud over det illustrerede tilfælde. Efterhånden som adgangen til 2PP-printteknologien bliver mere og mere udbredt, vil den indledende investering, der kræves til dens implementering, falde, mens dens vifte af potentielle applikationer vil blive udvidet.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
M.G. anerkender økonomisk støtte fra EU's H2020-rammeprogram gennem Det Europæiske Innovationsråd (IN-FET-projekt, GA n. 862882, Arbor-IO-projektet, FLAG-ERA og Human Brain Project, ID 650003) og fra SISSA (Neuroscience Area). G.N. anerkender økonomisk støtte fra det italienske ministerium for universitet og forskning (MUR) gennem bevillingen Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (matematikområdet). Vi takker M. Gigante, B. Pastore og M. Grandolfo for deres hjælp med 3D-print, celledyrkning og live-billeddannelse samt Dr. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente og H.C. Schultheiss for diskussioner. Bidragyderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om udgivelse eller udarbejdelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). -------------------------------------- Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
References
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13 (2011).
- Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
- Wheeler, B. C., Brewer, G. J.
- DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32 (2016).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010 (2012).
- Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044 (2020).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400 (2014).
- Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157 (2016).
- Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
- Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424 (2016).
- Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
- Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031 (2011).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington's disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
- Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
- Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
- Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
- Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625 (2017).
- le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412 (2015).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276 (2017).
- Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307 (2019).
- Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
- Baldacchini, T. Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , Elsevier. (2015).
- Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication. , CRC Press. (2018).
- Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056 (2010).
- Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26 (2014).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701 (2016).
- Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49 (2017).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
- Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
- Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
- Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
- Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408 (2011).
- Madsen, M. H., Feidenhans'l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002 (2014).
- Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
- Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).
