Summary
De fabricage van een dubbellaags apparaat op basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) voor de productie van combinatorische bibliotheken in water-in-olie-emulsies (pluggen) wordt hier gepresenteerd. De benodigde hardware en software die nodig zijn om de productie van stekkers te automatiseren, worden gedetailleerd beschreven in het protocol en de productie van een kwantitatieve bibliotheek van fluorescentiestekkers wordt ook gedemonstreerd.
Abstract
Druppelmicrofluïdica is een veelzijdig hulpmiddel waarmee een groot aantal reacties kan worden uitgevoerd in chemisch verschillende nanolitercompartimenten. Dergelijke systemen zijn gebruikt om een verscheidenheid aan biochemische reacties in te kapselen - van incubatie van afzonderlijke cellen tot implementatie van PCR-reacties, van genomica tot chemische synthese. Door de microfluïdische kanalen te koppelen aan regelkleppen kan controle worden uitgeoefend over hun opening en sluiting, waardoor de snelle productie van grootschalige combinatorische bibliotheken mogelijk wordt, bestaande uit een populatie druppels met unieke samenstellingen. In dit artikel worden protocollen gepresenteerd voor de fabricage en werking van een drukgedreven, PDMS-gebaseerd dubbellaags microfluïdisch apparaat dat kan worden gebruikt om combinatorische bibliotheken van water-in-olie-emulsies te genereren, pluggen genaamd. Door softwareprogramma's en microfluïdische hardware op te nemen, kan de stroom van gewenste vloeistoffen in het apparaat worden gecontroleerd en gemanipuleerd om combinatorische plugbibliotheken te genereren en om de samenstelling en hoeveelheid van samenstellende plugpopulaties te beheersen. Deze protocollen zullen het proces van het genereren van combinatorische schermen versnellen, met name om de geneesmiddelrespons in cellen uit biopsieën van kankerpatiënten te bestuderen.
Introduction
Microfluïdica maakt de manipulatie van kleine hoeveelheden vloeistoffen in microkanalen mogelijk1. De werkingsschaal van typische microfluïdische apparaten is tientallen tot honderden micrometers, wat de miniaturisatie van chemische en biologische reacties mogelijk maakt, waardoor dergelijke reacties kunnen worden uitgevoerd met relatief kleine hoeveelheden reagentia. Aanvankelijk werden microfluïdische apparaten vervaardigd met materialen zoals silicium2 en glas3. Hoewel ze nog steeds in gebruik zijn4, brengen ze bepaalde problemen met zich mee, zoals de compatibiliteit met oplosmiddelen, hoge fabricagekosten en moeilijkheden bij de integratie van regelaars voor vloeistofstroom 5,6. PDMS-gebaseerde fabricagemethodologieën, softlithografie genaamd, bieden een goedkoop alternatief voor de snelle prototyping van apparaten7 en een manier om complexe meerlagige apparaten te fabriceren8. De toevoeging van kleppen en pompen aan PDMS-apparaten maakt het mogelijk om de routing en snelheid van vloeistoffen in apparaten 9,10 te regelen. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om microkleppen op een omkeerbare of onomkeerbare manier te ontwerpen en te bedienen - bijvoorbeeld bimetaalkleppen gemaakt van silicium en aluminium, die thermisch worden bediend11 of waarbij gas wordt gebruikt dat wordt gegenereerd door een elektrochemische reactie om een siliciumnitridemembraan af te buigen12. Gu et al. demonstreren het gebruik van de mechanische pinnen van een brailleleesregel om druk uit te oefenen op microkanalen om de stroom te reguleren13. Een set microkleppen die aan populariteit heeft gewonnen, zijn de pneumatische PDMS-gebaseerde kleppen die zijn ontwikkeld door de groep van Stephen Quake14. Meestal zijn dergelijke kleppen samengesteld uit twee orthogonale microkanalen - een stroomkanaal en een regelkanaal. Bij het onder druk zetten van het regelkanaal buigt een dun PDMS-membraan af op het stroomkanaal, sluit het af en onderbreekt daardoor de vloeistofstroom. Eenmaal drukloos ontspant het membraan, waardoor het stroomkanaal wordt geopend en de vloeistofstroom kan worden hervat. PDMS-kleppen maken daarbij een debietregeling op een robuuste en omkeerbare manier mogelijk, aangezien het regelkanaal meerdere keren onder druk kan worden gezet en drukloos kan worden gemaakt15. Aangezien dergelijke kleppen bovendien kunnen worden bediend door het uitoefenen van druk, openen ze mogelijkheden voor digitale regeling en automatisering16. Bovendien kunnen ze, omdat ze van hetzelfde materiaal zijn, naadloos worden geïntegreerd in de fabricage van PDMS-gebaseerde apparaten met behulp van softlithografietechnieken 8,17,18. Deze eigenschappen maken PDMS-kleppen een aantrekkelijke keuze voor debietregeling in microfluïdische apparaten. Thorsen et al. gebruikten het principe van dergelijke kleppen om een fluïdische multiplexer te ontwerpen - een gecombineerde reeks pneumatische kleppen - om bijna duizend ingangsstroomkanalen aan te spreken met twintig regelkanalen19. Dit principe is uitgebreid om vloeistoffen selectief te routeren naar microfluïdische chemostaten in de chip, zodat unieke reacties tegelijkertijd in elke reactor kunnen worden uitgevoerd 20,21,22,23. Dergelijke microreactoren zijn echter weliswaar nuttig bij het optimaliseren van het gebruik van beperkte reagentia, maar kunnen meerdere reacties niet parallelliseren en zijn niet voldoende voor studies met een hoge doorvoer.
Druppelmicrofluïdica is een subcategorie van microfluïdica die de productie van druppeltjes omvat door de manipulatie van niet-mengbare, multifasische vloeistofstromen in microfluïdische apparaten24. Druppelvorming omvat het uiteenvallen van een continue vloeistof door de introductie van een niet-mengbare vloeistof, wat resulteert in een afknijpen als gevolg van instabiliteit in de grensvlakenergie en in de vorming van een emulsie25. Oppervlakteactieve stoffen helpen bij de vorming van afgeronde druppeltjes wanneer emulsies het microkanaal verlaten door de grensvlakenergieën te stabiliseren26. Grotere druppels, pluggen genaamd, zijn minder stabiel en kunnen worden opgevangen in een opbergruimte (zoals een stuk slang) als een reeks waterige compartimenten die aan weerszijden van elkaar zijn geplaatst door een of meer niet-mengbare vloeistoffen27. Naast miniaturisatie en compartimentering biedt druppelmicrofluïdica ook een verhoogde doorvoer van biologische reacties, omdat een groot aantal monodisperse druppeltjes kan worden geproduceerd - elk dienend als een nanoreactor28. Druppels, eenmaal gegenereerd, kunnen ook worden onderworpen aan verdere manipulaties, zoals splitsing29,30, fusie31,32, sortering33,34 en assemblage in structuren van hogere orde35,36. Druppelmicrofluïdica heeft een revolutie teweeggebracht in verschillende wetenschappelijke gebieden en technologieën - van PCR37 tot single-cell transcriptomics38, van medicijnontdekking39,40 tot virologie41, van next-generation sequencing42 tot chemische synthese43.
De integratie van PDMS-gebaseerde zachte lithografie en microkleppen met druppeltechnologie is een krachtige combinatie die de regulering van de vloeistofstroom in microkanalen en de daaropvolgende controle over de druppelinhoud mogelijk maakt. Afhankelijk van het openen en sluiten van kanalen is het mogelijk om verschillende populaties druppels te produceren, elk met een specifieke samenstelling. Een dergelijk platform zou biochemische reacties kunnen miniaturiseren, compartimenteren en parallelliseren en daarom een nuttige techniek zijn voor combinatorische screening44. Combinatorische screening is een high-throughput-methode om tienduizenden combinaties van geselecteerde reagentia te genereren om bibliotheken te produceren die bestaan uit individuele populaties met een bekende samenstelling. Combinatorische screening is gebruikt om synergetische effecten tussen geneesmiddelen en antibiotica te ontdekken voor remming van de bacteriegroei45. Op het gebied van kankertherapie is combinatorische screening gebruikt om combinaties van geneesmiddelen tegen kanker voor een bepaalde patiënt te testen, waardoor gepersonaliseerde therapie wordt bevorderd46,47. Mathur et al. hebben voortgebouwd op deze technologie door een combinatorische DNA-barcodebenadering te integreren om transcriptoomveranderingen in high-throughput drug screening te beoordelen48. Combinatorische screening is dus een krachtige maar ontluikende technologie, en er is behoefte aan de ontwikkeling van diverse microfluïdische technologieën om dergelijke screeningprocedures uit te voeren en te vergemakkelijken.
Het doel van dit manuscript is om een complete set protocollen te presenteren voor de fabricage van een dubbellaags microfluïdisch apparaat dat in staat is om een combinatorische bibliotheek van water-in-oliepluggen te genereren en de hardware en software te beschrijven die nodig zijn voor de werking van een dergelijk apparaat. De vloeistofstroom wordt geregeld met behulp van drukgeregelde pneumatische kleppen op PDMS-basis, die op hun beurt worden bestuurd door een op maat gemaakt LabVIEW-programma. De stroom van reagentia in het apparaat wordt bereikt met behulp van in de handel verkrijgbare drukpompen. Er wordt een prototype van acht inlaten gepresenteerd waarin een prop wordt gevormd door de inhoud van drie inlaten, elk met een waterig reagens. De waterige fase ontmoet een continue oliefase en pluggen worden geproduceerd op een T-splitsing met een frequentie van 0,33 Hz. De werking van het systeem wordt gedemonstreerd door het produceren van een kwantitatieve bibliotheek met drie verschillende populaties fluorescerende stekkers. Deze technologie en een reeks protocollen zullen helpen om de productie van combinatorische bibliotheken voor screeningdoeleinden met een hoge doorvoer te versnellen.
Protocol
1. Zachte lithografie
OPMERKING: Het microfluïdische apparaat is samengesteld uit twee lagen, een stroomlaag en een controlelaag (Figuur 1A), en elke laag is gegoten uit afzonderlijk gedessineerde wafers met behulp van respectievelijk een positieve en negatieve fotoresist (raadpleeg de materiaaltabel voor details over fotoresist en ontwikkelaars).
- Voer de fabricage van de wafer uit voor de stroomlaag zoals hieronder beschreven.
- Dehydrateer een siliciumwafel (diameter 100 mm, <1-0-0> georiënteerd, 525) een nacht (12-16 uur) bij 250 °C.
- Laat de wafer afkoelen voordat u doorgaat met centrifugeren. Breng 3-4 ml van de positieve fotoresist aan op het midden van de wafer.
- Centrifugeer gedurende 40 s bij 1400 tpm (344 tpm/s) om een kenmerkhoogte van 45 μm te verkrijgen.
- Zacht bakken op een hete plaat met behulp van een temperatuurverhoging, oplopend met een snelheid van 450 °C /u, van 35 °C tot 105 °C. Deze stap kan ook worden uitgevoerd op microvezelweefsels om direct contact te voorkomen en het borrelen van de fotoresist te minimaliseren. Haal de wafel van de kookplaat en laat deze afkoelen op microvezeldoekjes.
- Plaats het fotomasker (commercieel geproduceerd) dat overeenkomt met de vloeilaag (met de emulsie naar beneden) op de resist-gecoate siliciumwafer en stel het bloot onder een UV-lamp, bij 10 mW/cm2, totdat een totale blootstelling van 200 mJ/cm2 is bereikt.
- Gebruik twee kookplaten - één op 65 °C en de andere op 95 °C - om na blootstelling - respectievelijk 1 minuut en 7 minuten - op de platen te bakken.
- Ontwikkel de wafer door deze over te brengen naar een petrischaal gevuld met ontwikkelaar voor positieve fotoresist. Schud de petrischaal door deze op een tafelschudder te schudden met de wafer volledig ondergedompeld en vernieuw de ontwikkelaarsoplossing regelmatig totdat de wafer volledig is ontwikkeld en de functies duidelijk te zien zijn.
- Gebruik gedemineraliseerd water om resten van de wafer af te spoelen en controleer onder een stereomicroscoop op eventuele resten in de kanalen. Verwijder resten door de wafer terug te plaatsen in de ontwikkeloplossing of door de ontwikkelaar voorzichtig met een micropipet aan de wafer toe te voegen. Als u klaar bent, droogt u de wafer af met een stikstofspuitpistool.
- Laat de wafer opnieuw stromen door deze gedurende 25 minuten op een kookplaat te plaatsen die is ingesteld op 110 °C. Dit proces resulteert in afgeronde functies.
- Ga verder met silanisatie van de wafer zoals beschreven in stap 1.3.
OPMERKING: Hexamethyldisilazaan (HMDS) dampafzetting kan ook worden uitgevoerd op de siliciumwafers voorafgaand aan het aanbrengen van de resist om de hechting tussen de resist en de wafer te verbeteren.
- Voer de waferfabricage uit voor de controlelaag zoals hieronder beschreven.
- Neem een andere siliciumwafel en dehydrateer deze door deze gedurende 15 minuten op een kookplaat op 110 °C te plaatsen.
- Verwijder de wafer en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat met het centrifugeren van de coating.
- Breng 5 ml van de negatieve fotoresist aan op het midden van de wafer.
- Gebruik het volgende centrifugeprotocol om een kenmerkhoogte van 40 μm te verkrijgen: 5 s bij 500 tpm (100 tpm/s acceleratie), 33 s bij 1400 tpm (300 tpm/s) en ten slotte vertragen tot 0 tpm gedurende 5 s bij 300 tpm/s.
- Zacht bakken met twee aparte kookplaten ingesteld op 65 °C en 95 °C gedurende respectievelijk 1 minuut en 15 minuten. Haal de wafel van de kookplaat en laat deze afkoelen op microvezeldoekjes.
- Plaats het fotomasker (commercieel geproduceerd) dat overeenkomt met de controlelaag (met de emulsiezijde naar beneden) op de resist-gecoate wafer en stel de wafer bloot onder een UV-lamp, ingesteld op 15 mW/cm2, totdat een totale blootstelling van 250 mJ/cm2 is bereikt.
- Gebruik twee kookplaten - een op 65 °C en de andere op 95 °C - en bak de wafel na belichting gedurende respectievelijk 2 minuten en vervolgens 5 minuten. Haal de wafel van de kookplaat en laat deze afkoelen op microvezeldoekjes.
- Ontwikkel de wafer door deze gedurende 4 minuten over te brengen naar een petrischaal gevuld met ontwikkelaar voor negatieve fotoresist. Vernieuw de ontwikkelaar en ga nog 4 minuten door met het proces.
- Spoel de wafer af met isopropanol om resterende fotoresist te verwijderen en gebruik een stereomicroscoop om de wafer te controleren op eventuele resten in de kanalen.
- Verwijder resten door de wafer terug te plaatsen in de ontwikkeloplossing of door de ontwikkelaar voorzichtig met een micropipet aan de wafer toe te voegen. Als u klaar bent, droogt u de wafer af met een stikstofspuitpistool.
- Eenmaal volledig ontwikkeld, bak je de fotoresist hard door de wafel gedurende 10 minuten op een kookplaat op 95 °C te plaatsen.
- Ga verder met silanisatie zoals beschreven in stap 1.3.
- Voer silanisatie uit zoals hieronder beschreven.
- Plaats de wafel in een exsiccator Plaats een glazen fles in de exsiccator en voeg 4-5 druppels 1,1,3,3 tetramethyldisiloxaan toe.
LET OP: 1,1,3,3 tetramethyldisiloxaan is niet giftig maar wel ontvlambaar. Andere silanen kunnen worden gebruikt, maar deze kunnen giftig zijn. Het wordt aanbevolen om silanisatie uit te voeren in een zuurkast terwijl u de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) draagt, zoals een laboratoriumjas, een bril en nitrilhandschoenen. - Trek 15 minuten aan het vacuüm en sluit de exsiccator 12-16 uur af zodat de silaan zich op de wafer kan afzetten.
- Open de exsiccator en gooi de glazen fles weg. Leg de hostie in een schone petrischaal.
- Plaats de wafel in een exsiccator Plaats een glazen fles in de exsiccator en voeg 4-5 druppels 1,1,3,3 tetramethyldisiloxaan toe.
- Voer de fabricage van microfluïdische apparaten uit zoals hieronder beschreven.
OPMERKING: Het volgende protocol is een bewerking van eerdere werken23.- Bereid twee afzonderlijke PDMS-oplossingen voor: één voor de stromingslaag en één voor de controlelaag. Meng voor elke oplossing het basismiddel en het uithardingsmiddel van de PDMS-kit in een bekerglas en roer met een mengstaaf. De controlelaag vereist 10 g basismiddel en 0,5 g uithardingsmiddel (verhouding 20:1), terwijl de vloeilaag 40 g van het basismiddel en 8 g van het uithardingsmiddel vereist (verhouding 5:1).
- Ontgas de PDMS-oplossingen in een exsiccator totdat de oplossingen gasvrij zijn.
- Plaats de silanized flow layer wafer in een met folie beklede petrischaal en giet de bijbehorende PDMS-oplossing over de wafel. Plaats de petrischaal terug in de exsiccator en trek het vacuüm om verder te ontgassen (ongeveer 20 min).
- Spin coat de silanized control layer wafer met de bijbehorende PDMS-oplossing. Giet 3-4 ml van de oplossing op het midden van de wafer en draai gedurende 20 s op 1500 tpm bij 408 tpm/s. Leg de wafel 20 minuten op een vlakke ondergrond in een gesloten petrischaal.
- Plaats zowel de stroom- als de regellaag in een oven op 80 °C gedurende 18-20 min. Controleer regelmatig de twee lagen om te controleren of ze zijn uitgehard. De lagen zijn klaar als ze taai genoeg zijn om kneedbaar te zijn, maar toch een beetje plakkerig, omdat dit de hechting tussen de twee lagen verbetert.
- Knip het PDMS rond elk van de apparaten op de flowlaagwafel uit met een scalpel. Zorg ervoor dat u niet te dicht bij de elementen snijdt en laat ongeveer 2 cm ruimte tussen de functie en de randen van het PDMS. Eenmaal losgemaakt van de siliciumwafel, bedek het PDMS-blok met tape aan de objectzijde om stofverontreiniging te voorkomen.
- Zodra alle PDMS-blokken zijn uitgesneden, plaatst u ze één voor één op de bijbehorende controlelaagwafer en voert u een ruwe uitlijning met het oog uit.
- Nadat alle blokken op hun overeenkomstige gebieden op de controlelaag zijn geplaatst, past u de positie van elk van de blokken zodanig aan dat de regelkleppen overlappen over de overeenkomstige stroomkanalen om de uitlijning te voltooien. Dit kan ook worden uitgevoerd met behulp van een stereomicroscoop.
- Verwijder de luchtbellen tussen de twee lagen door druk uit te oefenen. Als de luchtzak zich op of in de buurt van een functie bevindt, zorg er dan voor dat de kanalen niet inklappen terwijl u druk uitoefent.
- Plaats de apparaten in de oven van 80 °C en laat ze 12-16 uur trekken. Plaats gewichten van 100 g op elk van de apparaten om de hechting tussen de twee lagen te verbeteren.
- Haal de wafer eruit en knip elk afzonderlijk apparaat uit. Trek de apparaten van de controlelaagwafer en bedek de functiezijde met tape.
- Plaats elk afzonderlijk apparaat op een snijmat met de kant naar boven gericht en prik een gat voor elk van de acht stroomlaaginlaten, acht inlaten van de controlelaagkanalen, de olieinlaten en de uitlaat met behulp van een biopsiepons van 0.75 mm met de functiezijde naar boven gericht.
- Laad de plasmaaser met een microscoopglaasje en een enkel apparaat met de tape verwijderd en de objectzijde naar boven gericht. Voer de zuurstofplasma-assing uit met een vermogen van 30 W voor een duur van 20 s.
- Haal het apparaat en de glazen schuif eruit zodra het asken is voltooid en plaats het apparaat met de functie naar beneden op het objectglaasje. De hechting tussen PDMS en glas moet direct zichtbaar zijn voor het blote oog. Oefen druk uit op alle gebieden met luchtbellen om de lucht eruit te persen.
- Plaats de apparaten gedurende 60 minuten op een kookplaat die is ingesteld op 110 °C met een gewicht erop om de hechting van het PDMS aan het glas te verbeteren.
2. Hardware-instelling
OPMERKING: Een schema van de verbindingen met het microfluïdische apparaat wordt weergegeven in Figuur 1B en een realisatie van een dergelijk schema met behulp van de benodigde hardware wordt weergegeven in Afbeelding 2.
- Stel de pneumatische kleppen in zoals hieronder beschreven.
OPMERKING: Elk regelkanaal dat een PDMS-klep op de chip regelt, wordt op zijn beurt bestuurd door een enkele magneetklep. Het hier gepresenteerde prototype bestaat uit acht stuurkanalen (figuur 1A) en daarom zijn er acht magneetventielen nodig.- De magneetventielen worden aangestuurd met behulp van een op maat gemaakt LabVIEW-softwareprogramma (Main Interface Program; Figuur 3 en aanvullend dossier 1, aanvullend dossier 2, aanvullend dossier 3, aanvullend dossier 4). Dit programma stuurt MODBUS-commando's via een TCP-verbinding (Supplementary File 5, Supplementary File 6) naar een WAGO-controller. Sluit het WAGO-apparaat met behulp van een ethernetkabel aan op de computer met het LabVIEW-programma. Sluit de magneetventielen vervolgens achtereenvolgens aan op de poorten van de WAGO-controller. Voor een meer gedetailleerde beschrijving verwijzen wij u naar de eerder beschreven protocollen23.
- Sluit de magneetventielarray aan op een persluchtbron met behulp van 1/4 in-slang en stel de druk van de kleppenarray in op 3.5 bar. In dit systeem werden de acht kleppen gemarkeerd met 9-16 gebruikt.
- Stel drukregelaars in zoals hieronder beschreven.
OPMERKING: Een in de handel verkrijgbare drukpomp wordt gebruikt om de vloeistofstroom te regelen (Figuur 2). Een pompset met acht poorten en een pompset met vier poorten werden gebruikt om acht waterige inlaten en twee olie-inlaten in het apparaat op te nemen. De druk van elke poort wordt geregeld via software die door de fabrikanten wordt geleverd.- Sluit de drukpomp aan op een persluchtbron en zorg ervoor dat de toegevoerde druk de maximaal toegestane druk van de pomp niet overschrijdt (2.2 bar voor zowel de achtpoorts- als de vierpoortsregelaars).
- Sluit de drukpompen aan op een computer met behulp van een USB-connector.
- Zodra de pompen zijn ingeschakeld, moeten ze zichtbaar zijn in de bijbehorende software. Zet de druk op nul tijdens het instellen van de pompen.
- Sluit een mannelijke luer aan op 3/32 in barb-connector op elk van de 12 vrouwelijke luer-lock-uitgangspoorten op de controllers.
- Sluit een stuk zachte slang (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 15 cm) aan op de weerhaak. Sluit een andere mannelijke luer aan op 3/32 in weerhaakconnector op het andere uiteinde van de zachte slang.
- Sluit een luer-stub (23 G, 0.5 inch) aan op de weerhaakconnector. Op dit punt is de drukregelaar ingesteld en klaar voor gebruik.
3. Installatie van microfluïdisch apparaat
- Sluit de slang van het stuurkanaal aan zoals hieronder beschreven (Figuur 2).
- Snijd voor elk besturingskanaal een stuk PolyTetraFluorethyleen (PTFE) slang (OD: 0.042 inch, ID: 0.022 inch). Steek de pen van een 23 G, 0.5 in luer stomp aan het ene uiteinde.
- Sluit de luer-stub aan op een mannelijke luer op 3/32 in barb nylon connector. Steek de weerhaak van de connector in een stuk polyurethaanslang (OD: 4 mm, ID: 2,5 mm). Sluit het andere uiteinde van de polyurethaanslang rechtstreeks aan op een magneetventiel.
- Vul een spuit met water en sluit aan het uiteinde een 23 G, 0,5 inch luer stub aan.
- Sluit het vrije uiteinde van de PTFE-slang aan op deze spuit en injecteer water tot ongeveer halverwege de slang.
- Koppel de slang los van de spuit en steek het vrije uiteinde van de slang in een geperforeerd gat van het overeenkomstige bedieningskanaal (Figuur 1A-C 1-8). Herhaal dit totdat elk stuurkanaal is aangesloten op het bijbehorende magneetventiel.
OPMERKING: In dit document zijn de magneetventielen 9-16 aangesloten op de regelkanalen die overeenkomen met respectievelijk C1 en C8 . Hoewel deze op elke manier kunnen worden aangesloten, is het belangrijk om de volgorde en volgorde van de verbindingen te onthouden, vooral tijdens het gebruik van het Main Interface-programma. - Gebruik het programma Main Interface (Figuur 3) om alle magneetventielen te openen (Zet alle bedieningskanalen onder druk). Hierdoor wordt de vloeistof uit de slang in de besturingskanalen van het microfluïdische apparaat geduwd en zo gevuld. Een voorbeeld van druk- en drukloze kleppen wordt weergegeven in figuur 4.
- Sluit reagentia aan en vul het apparaat zoals hieronder beschreven.
- Zorg ervoor dat alle bedieningskanalen onder druk staan door op de knop Alle bedieningskanalen onder druk zetten in het hoofdinterfaceprogramma (Figuur 3) te drukken.
- Snijd voor elk van de waterige reagentia een segment PTFE-slangen (OD: 0.042 inch, ID: 0.022 inch) lang genoeg om de pompen aan te sluiten op de inlaten van de inlaten van het microfluïdische apparaat. Sluit een van de slangen aan op de luer-stub uit stap 2.2.6.
- Vul een spuit met het benodigde reagens en sluit aan het uiteinde een 23 G, 0,5 inch luer-stomp aan.
- Injecteer het reagens in de overeenkomstige PTFE-slang totdat de slang vol is. Zorg ervoor dat het reagens niet in de uitgangspoort van de pompset terechtkomt.
- Steek het vrije uiteinde van de slang in een overeenkomstige inlaat in de microfluïdische chip.
- Oefen een druk van 400 mbar uit op elk van de waterige reagentia in de inlaat met behulp van de meegeleverde software.
- Verlaag achtereenvolgens de regelkanalen afzonderlijk drukloos met behulp van het hoofdinterfaceprogramma (Figuur 3) om ervoor te zorgen dat alle reagentia de T-splitsing van het apparaat hebben bereikt. Bedien individuele kleppen, indien nodig, door op de overeenkomstige knoppen op het programma in de doos te drukken Bedieningskanalen Handmatige drukregeling.
- Herhaal de stappen 3.2.3 tot en met 3.2.5 voor de oliereagentia. Oefen een druk van 400 mbar uit op elk van de inlaatoliereagentia.
- Maak tegelijkertijd alle regelkanalen drukloos door op Alle regelkanalen drukloos maken (Figuur 3) te drukken totdat alle lucht uit het apparaat is verwijderd. Dit is met het blote oog of onder een microscoop waarneembaar.
- Zet alle bedieningskanalen onder druk door op de knop Alle bedieningskanalen onder druk te zetten (Figuur 3). In dit stadium zijn alle reagentia aangesloten en is het apparaat geprimed en klaar voor gebruik.
- Programmeer en voer het experiment uit zoals hieronder beschreven.
- Codeer de samenstelling, volgorde en replicaten van elke plugpopulatie die moet worden geproduceerd in een .csv bestand zoals weergegeven in aanvullend bestand 7 dat dient als invoer voor het automatische experiment in het hoofdinterfaceprogramma (Figuur 3). Markeer de benodigde regelkanalen met een 0 als het overeenkomt met een inlaat die open moet zijn en een 1 als deze gesloten moet worden. Elke rij in het .csv-bestand komt overeen met één afzonderlijke plug-populatie.
- Laad de .csv in het programma Hoofdinterface door op de knop Map in het tabblad Experimentbestand te klikken.
- Voer de relevante velden in het programma in, zoals iteraties van het experiment (om te bepalen hoe vaak de gegeven reeks pluggen wordt geproduceerd), Tijd van drukverlaging (om te bepalen hoe lang de inlaatkanalen open moeten zijn en het bijbehorende stuurkanaal moet worden verlaagd in milliseconden), Tijd van drukverhoging (om te bepalen hoe lang de inlaten moeten worden gesloten tussen sequenties van plugpopulatie in milliseconden).
- Selecteer het (de) inlaatkanaal(en) die overeenkomen met de productie van streepjescodes in het gedeelte Streepjescode-inlaten (maximaal 3 kanalen), samen met de duur waarvoor ze open moeten zijn (Tijd voor streepjescodering (ms)). Als alternatief kunnen deze streepjescodes ook worden gecodeerd in het invoerbestand .csv, zoals weergegeven in aanvullend bestand 7.
- Verlaag de druk van de inlaatoliereagentia tot 200 mbar.
- Sluit een PTFE-slang (OD: 0.042 in, ID: 0.022 in) van de gewenste lengte aan op het stopcontact om de stekkers op te vangen. Om een gelijkmatige productie van pluggen te garanderen, gebruikt u voor het verzamelen slangen van ongeveer 100 cm voorgevuld met pluggen. Dit is om het drukverschil aan de uitlaat te neutraliseren dat wordt uitgeoefend door het verzamelen van pluggen in de slang.
- Druk op Experiment uitvoeren om het programma te starten en de productie te pluggen.
- Voer gegevensregistratie en -analyse uit zoals hieronder beschreven (zie afbeelding 5).
OPMERKING: In dit gedeelte wordt specifiek een methode beschreven voor het analyseren van fluorescentiestekkers. Afhankelijk van de aard van de gegenereerde pluggen, kan dit gedeelte naar wens worden gewijzigd.- Vul een spuit met olie (minerale olie of gefluoreerde olie) en sluit aan het uiteinde een 23 G 0.5 in luer stomp aan. Bevestig de spuit aan een pomp.
- Sluit een van de uiteinden van de gevulde opvangslang aan op de luer-stomp op de spuit. Bevestig het andere uiteinde van de gevulde opvangslang boven de objectieflens van een microscoop.
- Plaats een afvalreservoir onder het uiteinde van de slang in de buurt van het objectief.
- Stel de microscoop scherp op een bepaald deel van de slang en stel deze in om fluorescentie in het (de) gewenste kanaal(en) op te nemen.
- Stel de pomp in op een debiet van 50 μL/min.
- Neem de video van het fluorescerende kanaal op als een .avi bestand.
- Analyseer het .avi-bestand met behulp van het meegeleverde python-script (aanvullend bestand 8) om de gemiddelde fluorescentie te extraheren in een vooraf gedefinieerd interessegebied (ROI) per frame van het .avi-bestand (een voorbeeld hiervan wordt gegeven in aanvullend bestand 9).
- Gebruik het meegeleverde aangepaste R-script (aanvullend bestand 10) om de omstandigheden te extraheren en de onbewerkte gegevens en de piekhoogtes uit te zetten.
OPMERKING: Het R-schrift in aanvullend bestand 10 is gebruikt voor analyse in dit artikel. De op maat gemaakte R-functies die in dit script worden gebruikt om gegevens te knippen, omstandigheden te detecteren met behulp van barcodes en de piekhoogtes voor individuele pluggen en plotten te analyseren, worden geleverd in aanvullend bestand 11.
Representative Results
Een van de cruciale kenmerken van de microfluïdische chip zijn de PDMS-kleppen en hun vermogen om de vloeistofstroom te reguleren werd gekenmerkt omdat het het operationele paradigma van het apparaat beïnvloedt. Daartoe werd het debiet van gedestilleerd water (gemeten met behulp van een in de handel verkrijgbare debietsensor) door de inlaatkanalen geregistreerd als functie van verschillende ingangsdrukken, terwijl de PDMS-kleppen periodiek onder druk werden gezet (3,5 bar gedurende 2000 ms) en drukloos werden gemaakt (1000 ms). Er werd waargenomen dat de kleppen in staat waren de vloeistofstroom te regelen tot ongeveer 800 mbar ingangsdruk, zoals aangegeven door de daling van het debiet tot nul wanneer de kleppen worden bediend (figuur 6 B-D). Dit valideert het gebruik van dergelijke PDMS-gebaseerde kleppen om de stroom van reagentia in de kanalen te regelen. Bovendien is de ingangsdruk bij 1200 mbar te hoog voor de kleppen om het debiet te regelen, zoals blijkt uit het feit dat het debiet niet tot nul wordt gereduceerd (figuur 6E). Hoewel de duur van druk- en drukverlaging van de PDMS-kleppen kan worden gewijzigd, werd de veranderingssnelheid van de vloeistofstroom onder de huidige omstandigheden van druk (2000 ms) en drukverlaging (1000 ms) berekend. Bij een ingangsdruk van 400 mbar kan het debiet worden in- en uitgeschakeld met een snelheid van respectievelijk 1,26 Hz en 1,44 Hz (afbeelding 6C).
Eerdere iteraties van een soortgelijk combinatorisch high-throughput microfluïdisch apparaat bevatten ook een afvalkanaal dat aan elk stroomkanaalwas gekoppeld 46,47. Deze apparaten werden gebruikt in een constant debietregime (waarbij reagentia in het apparaat werden geïnjecteerd met constante stroomsnelheden in plaats van constante druk), en de afvalkanalen werden geprogrammeerd om te openen wanneer hun overeenkomstige inlaatkanalen gesloten waren om eventuele drukopbouw te verlichten. Dergelijke kanalen, hoewel nuttig, resulteren in een verlies van reagentia omdat de inhoud van het afvalkanaal niet bijdraagt aan de vorming van proppen. Bovendien zijn er ook extra regelkanalen - en dus extra pompen - nodig om het openen en sluiten van de afvalkanalen te regelen. In het hier gepresenteerde prototype zijn de afvalkanalen verwijderd en is een operationeel paradigma opgesteld dat zorgt voor minder verspilling van reagentia en een verkleining van het ontwerp en de operationele complexiteit. Dit houdt in dat de waterige reagentia worden geïnjecteerd in de modus met constante druk in plaats van in de modus met constante stroomsnelheid. Om de twee regimes beter te begrijpen, werd de relatie tussen druk en debiet in de kanalen tijdens de bediening van de klep in elk geval beoordeeld (met behulp van dezelfde opstelling als weergegeven in figuur 6A), waarvan de resultaten zijn weergegeven in figuur 7. In figuur 7A werd het debiet van gedestilleerd water gemeten terwijl het werd geïnjecteerd bij een constante druk (300 mbar) en werd waargenomen dat tijdens de bediening van de klep het debiet tot nul daalt en dat bij drukverlaging van de klep het debiet zich herstelt tot het niveau van vóór de bediening. Echter, in een constant debietregime, waarbij de druk in de kanalen werd geregistreerd tijdens het injecteren van het gedestilleerde water met een constant debiet (2,5 μl/min; Figuur 7B), leidde de bediening van de klep niet tot volledige sluiting van de inlaat - wat blijkt uit het feit dat het debiet niet tot nul daalde - en werd een drukopbouw in het kanaal waargenomen. Dit is de druk die wordt verlicht door het openen van afvalkanalen. Aangezien een constant ingangsdrukregime de werking van het apparaat mogelijk maakt zonder tegendruk bij het bedienen van de klep, waardoor er geen afvalkanalen nodig zijn, werd dit regime aangenomen voor de werking van de microfluïdische chip.
Om de functionaliteit van het microfluïdische apparaat te demonstreren, werd een kwantitatieve combinatorische bibliotheek van fluorescerende pluggen gegenereerd. Naar de acht inlaten van het apparaat fluoresceïne (50 μM) in vier inlaten (I1Ik3, Ik5, Ik7), gedestilleerd water in drie inlaten (I4Ik6, Ik8), een inlaat met een blauwe kleurstof (I2; om als streepjescode te fungeren) - en twee oliereagentia - gefluoreerde olie (FC-40) en minerale olie (MO) in inlaten O1 en O2, respectievelijk - waren aangesloten (Figuur 1A, Figuur 8A). De gefluoreerde olie dient als de draagfase waarin de waterige pluggen worden verspreid, en de minerale olie helpt bij de stabiliteit van de plug en minimaliseert de hechting van de pluginhoud aan de wanden, waardoor kruisbesmetting tussen pluggen wordt geminimaliseerd46. Met drie inlaten die bijdragen aan de samenstelling van een enkele stekkerpopulatie, kan deze configuratie drie verschillende fluorescerende populaties genereren: FFF - samengesteld uit fluoresceïne uit drie kanalen, FFW - samengesteld uit fluoresceïne uit twee kanalen en water uit één kanaal, en FWW - samengesteld uit fluoresceïne uit één kanaal en water uit twee kanalen. Met deze opstelling zijn er 12 verschillende omstandigheden (plugpopulaties geproduceerd met een duidelijke combinatie van drie inlaten) die FWW-pluggen kunnen produceren, 18 verschillende omstandigheden die FFW-pluggen kunnen produceren en vier verschillende omstandigheden die FFF-pluggen kunnen produceren. Daarom is de chip geprogrammeerd om deze 34 verschillende omstandigheden te produceren met elk vijf verschillende replicatiestekkers, samen met vijf replica's van streepjescodestekkers die ze scheiden. Het wordt aanbevolen om de populaties fluorescerende pluggen af te wisselen met een barcodepopulatie, d.w.z. een set gekleurde (idealiter niet-fluorescerende) pluggen (in dit geval gevormd door het openen van de inlaatkanalen die overeenkomen met de blauwe kleurstof en twee gedestilleerde waterkanalen) die met het blote oog zichtbaar zijn. Het stelt de gebruiker in staat om de productie van pluggen te controleren op problemen zoals het breken of smelten van pluggen en helpt bij de stroomafwaartse analyse van pluggen. Daarom werden in totaal 340 stekkers - 170 experimentele stekkers en 170 barcodestekkers die de verschillende omstandigheden scheiden - gegenereerd en verzameld in PTFE-slangen, waarvan een monster wordt getoond in Figuur 8B. De tijd van drukverlaging en tijd van drukregeling werden vastgesteld op respectievelijk 1000 ms en 2000 ms. De fluorescentie van de pluggen en hun variabiliteit binnen en tussen de verschillende experimentele omstandigheden werden geanalyseerd, waarvan de resultaten worden weergegeven in Figuur 8C,D. Figuur 8C toont de fluorescentie per frame van het .avi bestand dat is gegenereerd in stap 3.4.6, waarin de 34 experimentele omstandigheden in overweging worden gemarkeerd (afgebakend door een blauwe lijn). De gemiddelde fluorescerende waarde van pieken binnen een toestand wordt in rood weergegeven en de stippellijnen geven de standaardfout binnen die toestand aan. De hoogten van de pieken van alle pluggen in elke populatie, verkregen door de basislijnfluorescentie af te trekken van de maximale fluorescentie die in elke piek werd gedetecteerd, werden uitgezet in Figuur 8D. De laatste piek in elke toestand werd verwaarloosd voor de berekeningen, omdat het een verontreinigde plug was als gevolg van de vermenging van reagentia op de T-splitsing (aangezien de fluorescentie van de pluggen werd geregistreerd in omgekeerde volgorde van de productie van de plug, is de eerste plug in een populatie tijdens de productie de laatste plug in een populatie tijdens de analyse). Het was duidelijk dat de hoogte van de FWW-stekkers ongeveer een derde is (gemiddelde = 40,9, standaarddeviatie = 3,1) en die van de FFW-stekkers ongeveer tweederde (gemiddelde = 78,4, standaarddeviatie = 5) van de hoogte van de FFF-pluggen (gemiddelde = 117, standaarddeviatie = 10). Deze resultaten komen overeen met de verwachte proporties van fluorescentie in verschillende populaties van FFF/FFW/FWW-stekkers, wat de robuustheid van het apparaat en de werking ervan benadrukt.
Figuur 1: Schema van het ontwerp van het apparaat en de opstelling van de microfluïdische installatie. (A) De stroomlaag van de chip wordt weergegeven in blauw en de controlelaag wordt weergegeven in rood. In totaal kunnen acht unieke waterige reagentia door de inlaten (I1-8) naar de T-splitsing stromen, waar ze de oliefasen van de olie-inlaten (O1-2) tegenkomen om pluggen te vormen die bij de uitlaat worden verzameld. Elk inlaatstroomkanaal staat onder controle van een uniek regelkanaal (C1-8). (B) Schematisch van de microfluïdische chip samen met de slangverbindingen naar de inlaten, besturingskanalen en oliereagentia wordt weergegeven samen met de uitlaatslang. Pijlen geven de richting van de vloeistofstroom in de slang aan. De inzet toont het werkingsprincipe van PDMS-kleppen. Stippellijnen geven aan dat de controlelaag zich onder de stroomlaag bevindt. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Dubuc et al49. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema van de hardware-opstelling voor de productie van stekkers. De drukpompen regelen de stroom van reagentia (zowel waterig als olie) in de inlaatkanalen en de magneetventielen regelen de bediening van de PDMS-kleppen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het belangrijkste interfaceprogramma om het microfluïdische apparaat te besturen. Dit op maat gemaakte programma maakt het mogelijk om individuele pneumatische kleppen handmatig op druk te brengen (wit paneel). Het maakt ook de uitvoering van een volledig experiment mogelijk (blauw paneel) waarbij het een .csv bestand accepteert met de gewenste plugpopulaties en noodzakelijke parameters zoals klepdruk en drukverlagingstijden en de status van de uitvoering van het experiment weergeeft, inclusief welke besturingskanalen onder druk staan en niet, in realtime. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 4: Drukgestuurde klepbediening. Helderveldmicroscopiebeelden van (A) PDMS-klep (horizontaal) die drukloos is en het inlaatkanaal (verticaal) dat open is en (B) PDMS-klep die onder druk staat en het inlaatkanaal afsluit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Schema van de instelling van de gegevensregistratie. De verzamelslang is verbonden met een spuit met olie, die aan een pomp is bevestigd. De pluggen worden door de verzamelslang gevlogen en foto's/video's worden vastgelegd met een fluorescentiemicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Effect van de bediening van de klep op het debiet bij een bepaalde ingangsdruk. (A) Schema van de hardware-opstelling die wordt gebruikt om het debiet in de microfluïdische kanalen te controleren. De respons van het debiet in de kanalen bij gebruik bij verschillende ingangsdrukken van (B) 200 mbar, (C) 400 mbar, (D) 800 mbar en (E) 1200 mbar. De duur van de bediening van de klep wordt weergegeven in het rood gearceerde gebied. Voor alle experimenten werd gedestilleerd water gebruikt. De standaarddeviatie van drie onafhankelijke metingen wordt weergegeven door het groen gearceerde gebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Relatie tussen druk en debiet van reagentia in de inlaatkanalen bij het bedienen van de klep. (A) In een klep met een constant ingangsdrukregime (300 mbar) neemt het debiet af tot nul wanneer de klep wordt bediend. (B) In een constant debietregime (2,5 μL/min) resulteert klepbediening in een snelle drukopbouw in het kanaal totdat de klep drukloos is. De duur van de bediening van de klep wordt weergegeven in het rood gearceerde gebied. Voor alle experimenten werd gedestilleerd water gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Productie van fluorescerende stekkerpopulaties. (A) Schema van de experimentele opstelling waarin de aansluiting van de verschillende reagentia op het apparaat is weergegeven. Afkortingen: F = Fluoresceïne, W = gedestilleerd water, B = Blauwe kleurstof voor levensmiddelen, FC-40 = gefluoreerde olie en MO = minerale olie. (B) Voorbeeldfoto van een verzamelslang met pluggen. (C) Onbewerkte gegevens verkregen uit de analyse tonen de gemiddelde fluorescentie-intensiteit gemeten in een gespecificeerd interessegebied (ROI) versus het framenummer van het videobestand. Rode lijnen tonen het gemiddelde van de piekfluorescentie voor elke aandoening (populatie van pluggen geproduceerd met een specifieke combinatie van drie inlaten), en de stippellijnen geven de overeenkomstige standaardfout aan. (D) Boxplots van de hoogte van de toppen in de verschillende omstandigheden. Stippen komen overeen met individuele pieken, vakken voor elke aandoening variëren van het eerste tot het derde kwartiel van de verdeling van de overeenkomstige pieken en de dikke lijn wordt gebruikt voor de mediaanwaarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Het hoofdinterfaceprogramma voor de bediening van het apparaat. De besturingsinterface voor het handmatig op druk brengen van de stuurkanalen en het uitvoeren van een automatisch experiment in het apparaat met acht inlaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Alternatief hoofdinterfaceprogramma voor de bediening van het apparaat. De besturingsinterface voor het gebruik van een apparaat met acht inlaten zonder barcodefunctie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 3: LabVIEW subprogramma met globale variabelen. SubVI van het hoofdinterfaceprogramma waarin de status van de globale variabelen in het hoofdinterfaceprogramma, namelijk de besturingskanalen, wordt vermeld en weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 4: LabVIEW-programma om waarden van globale variabelen op te slaan. SubVI van het hoofdinterfaceprogramma dat de huidige toestand van de kleppen opslaat als een array, die zal worden gebruikt om dezelfde toestand van de kleppen te behouden in het geval dat de gebruiker langer dan 30 seconden inactief is. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 5: Transmission Control Protocol (TCP) LabVIEW-programma. SubVI voor het in stand houden van de TCP-verbinding tussen het hoofdinterfaceprogramma en de WAGO-besturing. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 6: TCP global variable LabVIEW subprogramma. Programma om de TCP-uitvoervariabele op te slaan. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 7: Invoer voor het uitvoeren van automatisch experiment. Het .csv bestand dat de samenstelling, sequentie en replica's van stekkerpopulaties codeert voor het uitvoeren van experimenten om kwantitatieve fluorescerende stekkers te produceren, zoals beschreven in dit artikel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 8: Python-script voor analyse van de populatie fluorescerende stekkers. Aangepast python-script om fluorescentiewaarden uit te lezen van de opname van stekkers (.avi bestand). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 9: Uitvoer van fluorescentieanalyse van stekkers. Uitvoer van het Python-script met fluorescentiewaarden voor een ROI van 5x5 van de opname van de pluggen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 10: R-programma om het uitvoerbestand te lezen. Aangepast programma dat in dit werk wordt gebruikt om de fluorescerende uitgangswaarden te lezen en onbewerkte gegevens, piekhoogtes en standaarddeviaties te plotten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 11: R-functies voor het analyseren en plotten van fluorescerende gegevens. Aangepaste R-functies die worden gebruikt om 1. snijd de ruwe gegevens van de fluorescentiewaarden, 2. definieer verschillende experimentele omstandigheden, 3. Identificeer pieken van de gegeven omstandigheden, 4. plot de ruwe gegevens en de gedetecteerde omstandigheden overlappen, en 5. Plot de geïdentificeerde pieken en de ruwe gegevens overlappen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
In dit artikel is een reeks protocollen gepresenteerd voor de fabricage en werking van een PDMS-gebaseerd microfluïdisch apparaat voor het geautomatiseerd genereren van combinatorische bibliotheken in water-in-oliecompartimenten, pluggen genaamd. De combinatie van microfluïdica met druppeltechnologie biedt een krachtige techniek om kleine hoeveelheden reagentia in een groot aantal compartimenten in te kapselen, waardoor wegen worden geopend voor grootschalige combinatorische screening.
Eerder zijn verschillende technologieën beschreven om chemisch verschillende compartimenten te genereren met behulp van microfluïdica, elk met zijn voordelen en beperkingen. Kulesa et al.50, beschreven een strategie om cellen met barcodes in druppeltjes in te kapselen met behulp van microtiterplaten en deze druppeltjes samen te voegen met behulp van een elektrisch veld om een combinatorische bibliotheek te creëren. Hoewel een dergelijke aanpak veel combinaties van druppels kan genereren, wordt deze beperkt door de noodzaak van handmatige verwerkingsstappen in de workflow. Tomasi et al.51 ontwikkelden een microfluïdisch platform om een sferoïde (vrij zwevende celaggregaten) bevattende druppel samen te voegen met een stimulusdruppel, waardoor de sferoïde micro-omgeving kan worden gemanipuleerd. Deze methode maakt het mogelijk om belangrijke fenomenen zoals cel-celinteracties en het effect van medicijnen te bestuderen, maar het is een relatief lage doorvoer. Eduati et al.46 en Utharala et al.47 ontwikkelden een op microfluïdisch ventiel gebaseerd platform dat op geautomatiseerde wijze combinatorische bibliotheken met een hoge doorvoer kan genereren. In deze onderzoeken worden de kleppen echter bediend met behulp van een braille-apparaat, wat omslachtige uitlijningsstappen tussen de microklep en de microfluïdische chip vereist. Een belangrijk kenmerk van het systeem dat in dit document wordt beschreven, is de implementatie van pneumatische PDMS-kleppen om de vloeistofstroom in de invoerkanalen te regelen. Omdat deze kleppen op PDMS zijn gebaseerd, kunnen ze vrij soepel worden opgenomen in de fabricagestappen van de microfluïdische chip. Bovendien zijn ze een relatief eenvoudige optie om de vloeistofstroom in de inlaatkanalen te regelen, omdat ze kunnen worden bediend door druk uit te oefenen via een externe gasbron. Ten slotte kunnen de duur en volgorde van drukverlaging en drukverlaging van deze kleppen worden geprogrammeerd, waardoor de productie van verschillende populaties pluggen op een high-throughput-manier wordt geautomatiseerd. Een ander belangrijk kenmerk is het gebruik van constante drukregimes voor de injectie van reagentia via de inlaat, waardoor men kan afzien van het opnemen van afvalkanalen om eventuele drukophoping te verlichten die ontstaat bij een constant debietregime. Dit vereenvoudigt het ontwerp van het apparaat, vermindert de behoefte aan extra kleppen en hardware om de kleppen van het afvalkanaal te regelen en minimaliseert de verspilling van reagens.
Hoewel de fabricage van apparaten met PDMS relatief ongecompliceerd is, vereist de implementatie van dergelijke apparaten wel het gebruik van uitgebreide hardware-parafernalia zoals de pneumatische magneetventielen (om de bediening van de PDMS-kleppen te regelen), drukpompen (om de stroom van inlaat- en oliereagentia te regelen) en softwareprogramma's (om de magneetventielen te regelen). Hoewel ze een aanzienlijke investering vertegenwoordigen, biedt een dergelijke opstelling consistentie en betrouwbaarheid voor de succesvolle werking van het apparaat. Bovendien zijn de hardwarecomponenten en architectuur die in dit protocol worden beschreven, modulair opgezet. Daarom kunnen voor sommige modules alternatieven worden gebruikt om de kosten te verlagen of om ze aan te passen aan een specifieke behoefte. Er bestaat bijvoorbeeld een verscheidenheid aan pompen die kunnen worden gebruikt op basis van bruikbaarheid, budget, beschikbaarheid en gemak 52,53,54. Extra componenten zoals vloeistofreservoirs en temperatuurregelaars kunnen worden ingebouwd voor gevoelige inlaatreagentia23. Bovendien kan dit ontwerp worden op- of afgeschaald om aan specifieke wetenschappelijke behoeften te voldoen. In dit artikel wordt bijvoorbeeld een prototype met acht inlaten beschreven waarmee acht unieke reagentia kunnen worden gecombineerd om pluggen te produceren. Dit kan worden opgeschaald naar een apparaat met 16 inlaten, wat een groter aantal inlaten en grotere combinaties daarvan mogelijk maakt. Bijgevolg zijn er extra regelkanalen en magneetventielen nodig om de inlaten aan te pakken, maar met een dergelijk prototype kunnen grotere en meer diverse combinatorische bibliotheken worden gegenereerd. Ten slotte wordt in dit artikel elke plugpopulatie geproduceerd door het openen van drie van de acht waterige inlaten van het microfluïdische apparaat. Er werd vastgesteld dat voor een dergelijke configuratie een druk van ongeveer 200 mbar voor de oliereagentia en 400 mbar voor de waterige reagentia overeenkwam met een regime van plugproductie, dat uitsluitend wordt aangedreven door klepbediening. Wanneer hogere druk op de olie(s) werd uitgeoefend, werd een breuk van pluggen waargenomen en de toepassing van lagere drukken leidde tot een fusie van pluggen. Het optimale drukregime voor de productie van pluggen hangt af van een breed scala aan factoren, zoals het aantal inlaten dat bijdraagt aan de vorming van een plug, de aard en viscositeit van de vloeistoffen en de afmetingen van de kanalen, en moet indien nodig worden geoptimaliseerd.
Een van de nadelen van het werken met een constant drukregime is dat vloeistoffen met verschillende viscositeiten verschillende stroomsnelheden hebben onder constante druk. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat de waterige reagentia die door de inlaten stromen, een vergelijkbare viscositeit hebben. Het gebruik van vloeistoffen met verschillende viscositeiten heeft niet alleen invloed op de vloeistofstroom in de inlaatkanalen, maar ook op de vorming van pluggen op de T-splitsing, waardoor de samenstelling van de plugpopulaties in gevaar komt. Een ander nadeel is de contaminatie van een proppopulatie door resterende reagentia bij de T-splitsing. Wanneer het apparaat schakelt tussen de productie van verschillende plugpopulaties, heeft de eerste/laatste plug in de reeks van elke populatie de neiging om besmet te raken door de vorige of de volgende populatie. Dit kan worden ondervangen door extra replicaten van elke populatie te produceren en de besmette plug tijdens de analyse buiten beschouwing te laten. Ten slotte is er ook de mogelijkheid van variatie tussen individuele apparaten als gevolg van inconsistenties in de fabricage en/of externe bronnen (drukschommelingen). Dit probleem kan worden verholpen door een enkele microfluïdische chip meerdere keren te hergebruiken en ervoor te zorgen dat een volledige run van een combinatorische bibliotheek wordt uitgevoerd op een enkele chip om het effect van deze inconsistenties te minimaliseren.
Het microfluïdische apparaat en de bijbehorende reeks operationele protocollen die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn gebruikt om de productie van een kwantitatieve combinatorische bibliotheek van pluggen aan te tonen. Dit platform kan daarom snel combinatorische bibliotheken van verschillende plugpopulaties genereren op een high-throughput-manier. Als gevolg hiervan kunnen dergelijke technologieën worden gebruikt voor een verscheidenheid aan screeningdoeleinden, waaronder, maar niet beperkt tot, combinatorische screening van geneesmiddelen op biopsiemonsters van patiënten - waarbij een klein aantal cellen uit een biopsie kan worden verdeeld in een groot aantal druppeltjes en kan worden behandeld met een grote combinatie van het antikankermedicijn om de individuele therapie voor een bepaald patiëntmonster te optimaliseren - en daarom gepersonaliseerde kankertherapie te versnellen46, 48,55.
Disclosures
F. E. is een freelancer voor TheraMe! AG. De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
We willen Stacey Martina van het NanoLab TuE bedanken voor haar hulp bij HMDS-dampafzetting. Dit onderzoek werd gefinancierd door het Institute for Complex Molecular Systems (ICMS) van de TU/e en door het Zwaartekrachtprogramma IMAGINE! (projectnummer 24.005.009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1,3,3 tetramethyldisiloxane | Merck Life Science NV | MFCD00008256 | |
| 4 channel digital input/output module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-504 | |
| Acetone | Boom Labs | BOOMSKEUZW3 | |
| Analysis Software | Eindhoven University of Technology | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE | |
| AZ 40XT 11D | Merck Life Science NV | 212299 | Positive photoresist |
| AZ 726 MIF developer | Merck Life Science NV | 10055824960 | Developer for positive photoresist |
| Biopsy Punch, Rapid Core | World Precision Instruments Germany, GMBH | 504529 | 0.75 mm ID, W/Plunge |
| Blue food dye | PME | FC1036 | |
| Controller end module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-600 | |
| Ethernet Controller | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-881 | |
| FC-40 | Merck Millipore | F9755-100ML | |
| Fluigent flow unit | Fluigent | FLU-S-D | |
| Fluigent pressure system | Fluigent | MFCS-EZ | 0 - 2 bar |
| Fluorescein | Merck Life Science NV | MFCD00005050 | |
| Hot plate | Torrey Pines Scientific | HP61 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-E | |
| Isopropanol | Boom Labs | BOOMSKEUZE3 | |
| LabVIEW (Software Version 20) | Eindhoven University of Technology | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_ VERSION_1 |
All files have been saved for LabVIEW version 20. It is advised to use this version or higher to open the files. |
| Luer stubs | Instech Laboratories, Inc. | LS23 | 23 ga, 0.5" |
| Male Luer to barb connectors | Cole Parmer | 45505-32 | 3/32" ID |
| MasterFlex PTFE tubing | Avator/VWR | 48634 | |
| Microscope Slides | VWR | 470150-480 | |
| Microscope slides, Plain | Corning | 2947-75X50 | |
| Mineral Oil | Merck Millipore | 330760-1L | |
| mr DEV 600 | Micro resist Technology | R815100 | Developer for negative photoresist |
| Oven | Thermo Scientific | Heraeus T6P 50045757 | |
| Oxygen plasma asher | Quorum Technologies | K1050X | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | ||
| Photomask Design | Eindhoven University of Technology (Adapted from Merten Lab, EPFL) | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg | |
| Pneumatic valve array | FESTO | 1x 8 valve array, Normally closed valves | |
| Silicon Wafers | Silicon Materials | <1-0-0>, 100 mm diameter, 525 μm thickness | |
| Single edge blades | GEM Scientific | ||
| Soft tubing | Fluigent | 1 mm ID, 3 mm OD | |
| Spin coater | Laurell Technologies Corporation | WS-650MZ-23NPPB | |
| Stereo microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| SU-8 3050 | Kayakli Advanced Materials | Y311075 1000L1GL | Negative photoresist |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 1317318 | |
| Syringe | B Braun Injekt - F Fine Dosage Syringe | 10303002 | |
| UV-LED exposure system | Idonus | UV-EXP150S-SYS | |
| Vacuum pump | Vacuumbrand GmbH | MD1C | |
| Weighing scales | Sartorius | M-prove |
References
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Terry, S. C., Herman, J. H., Angell, J. B. A gas chromatographic air analyzer fabricated on a Silicon wafer. IEEE Transactions on Electron Devices. 26 (12), 1880-1886 (1979).
- Mellors, J. S., Gorbounov, V., Ramsey, R. S., Ramsey, J. M. Fully integrated glass microfluidic device for performing high-efficiency capillary electrophoresis and electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 80 (18), 6881-6887 (2008).
- Wlodarczyk, K. L., Hand, D. P., Maroto-Valer, M. M. Maskless, rapid manufacturing of glass microfluidic devices using a picosecond pulsed laser. Sci Rep. 9 (1), 20215 (2019).
- Nielsen, J. B., et al. Microfluidics: innovations in materials and their fabrication and functionalization. Anal Chem. 92 (1), 150-168 (2020).
- Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Oh, K. W., Ahn, C. H.
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (2), 179-220 (2011).
- Jerman, H.
- Neagu, C. R., Gardeniers, J. G. E., Elwenspoek, M., Kelly, J. J. An electrochemical microactuator: principle and first results. J microelectromechanical sys. 5 (1), 2-9 (1996).
- Gu, W., Zhu, X., Futai, N., Cho, B. S., Takayama, S. Computerized microfluidic cell culture using elastomeric channels and Braille displays. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15861-15866 (2004).
- Studer, V., et al. Scaling properties of a low-actuation pressure microfluidic valve. J Appl Phys. 95 (1), 393-398 (2004).
- Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (40), 14431-14436 (2004).
- Ridgeway, W. K., Seitaridou, E., Phillips, R., Williamson, J. R. RNA-protein binding kinetics in an automated microfluidic reactor. Nucleic Acids Res. 37 (21), e142 (2009).
- Fu, A. Y., Chou, H. P., Spence, C., Arnold, F. H., Quake, S. R. An integrated microfabricated cell sorter. Anal Chem. 74 (11), 2451-2457 (2002).
- Liu, J., Enzelberger, M., Quake, S. A nanoliter rotary device for polymerase chain reaction. Electrophoresis. 23 (10), 1531-1536 (2002).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R.
- Galas, J. C., Haghiri-Gosnet, A. M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab Chip. 13 (3), 415-423 (2013).
- Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 15985-15990 (2013).
- Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synth Biol. 7 (12), 2879-2887 (2018).
- van der Linden, A. J., et al. A multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression. J Vis Exp. (152), 59655 (2019).
- Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y.
- Seemann, R., Brinkmann, M., Pfohl, T., Herminghaus, S.
- Baret, J. C.
- Clausell-Tormos, J., et al. Droplet-based microfluidic platforms for the encapsulation and screening of mammalian cells and multicellular organisms. Chem Biol. 15 (5), 427-437 (2008).
- Umbanhowar, P. B., Prasad, V., Weitz, D. A. Monodisperse emulsion generation via drop break off in a coflowing stream. Langmuir. 16 (2), 347-351 (2000).
- Abate, A. R., Thiele, J., Weitz, D. A. One-step formation of multiple emulsions in microfluidics. Lab Chip. 11 (2), 253-258 (2011).
- Chen, Y., Gao, W., Zhang, C., Zhao, Y.
- Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl Phys Lett. 88 (26), 264105 (2006).
- Fidalgo, L. M., Abell, C., Huck, W. T. S. Surface-induced droplet fusion in microfluidic devices. Lab Chip. 7 (8), 984-986 (2007).
- Bernath, K., et al. In vitro compartmentalization by double emulsions: Sorting and gene enrichment by fluorescence activated cell sorting. Anal Biochem. 325 (1), 151-157 (2004).
- Aharoni, A., Amitai, G., Bernath, K., Magdassi, S., Tawfik, D. S. High-throughput screening of enzyme libraries: thiolactonases evolved by fluorescence-activated sorting of single cells in emulsion compartments. Chem Biol. 12 (12), 1281-1289 (2005).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. S. Monodisperse uni- and multicompartment liposomes. J Am Chem Soc. 138 (24), 7584-7591 (2016).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. S. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. J Am Chem Soc. 139 (2), 587-590 (2016).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Shembekar, N., Chaipan, C., Utharala, R., Merten, C. A. Droplet-based microfluidics in drug discovery, transcriptomics and high-throughput molecular genetics. Lab Chip. 16 (8), 1314-1331 (2016).
- Wong, A. H., et al. Drug screening of cancer cell lines and human primary tumors using droplet microfluidics. Sci Rep. 7 (1), 9109 (2017).
- Jing, W., Han, H. Droplet microfluidics for high-resolution virology. Anal Chem. 94 (23), 8085-8100 (2022).
- Ding, Y., Choo, J., deMello, A. J. From single-molecule detection to next-generation sequencing: microfluidic droplets for high-throughput nucleic acid analysis. Microfluid Nanofluidics. 21 (3), 58 (2017).
- Nightingale, A. M., et al. A stable droplet reactor for high temperature nanocrystal synthesis. Lab Chip. 11 (7), 1221-1227 (2011).
- De Stefano, P., Bianchi, E., Dubini, G. The impact of microfluidics in high- throughput drug-screening applications. Biomicrofluidics. 16 (3), 031501 (2022).
- Tekin, E., et al. Prevalence and patterns of higher-order drug interactions in Escherichia coli. NPJ Syst Biol Appl. 4, 31 (2018).
- Eduati, F., et al. A microfluidics platform for combinatorial drug screening on cancer biopsies. Nat Commun. 9 (1), 2434 (2018).
- Utharala, R., et al. A microfluidic Braille valve platform for on-demand production, combinatorial screening and sorting of chemically distinct droplets. Nat Protoc. 17 (12), 2920-2965 (2022).
- Mathur, L., et al. Combi-seq for multiplexed transcriptome-based profiling of drug combinations using deterministic barcoding in single-cell droplets. Nat Commun. 13 (1), 4450 (2022).
- Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription–translation for the prototyping of synthetic communication networks. Curr Opin Biotechnol. 58, 72-80 (2019).
- Kulesa, A., Kehe, J., Hurtado, J. E., Tawde, P., Blainey, P. C. Combinatorial drug discovery in nanoliter droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (26), 6685-6690 (2018).
- Tomasi, R. F. X., Sart, S., Champetier, T., Baroud, C. N. Individual control and quantification of 3D spheroids in a high-density microfluidic droplet array. Cell Rep. 31 (8), 107670 (2020).
- White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).
- Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
- Gonzalez-Suarez, A. M., Long, A., Huang, X. H., Revzin, A. A Compact control system to enable automated operation of microfluidic bioanalytical assays. Biosensors. 12 (12), 1160 (2022).
- Mathur, L., Ballinger, M., Utharala, R., Merten, C. A. Microfluidics as an enabling technology for personalized cancer therapy. Small. 16 (9), e1904321 (2020).
