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Bioengineering

Dispositivo microfluídico bicamada para produção de plugue combinatório

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/66154
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology

Summary

A fabricação de um dispositivo de bicamada à base de polidimetilsiloxano (PDMS) para a produção de bibliotecas combinatórias em emulsões de água em óleo (plugs) é apresentada aqui. O hardware e o software necessários para automatizar a produção de plugues são detalhados no protocolo, e a produção de uma biblioteca quantitativa de plugues fluorescentes também é demonstrada.

Abstract

A microfluídica de gotículas é uma ferramenta versátil que permite a execução de um grande número de reações em compartimentos de nanolitros quimicamente distintos. Tais sistemas têm sido usados para encapsular uma variedade de reações bioquímicas - desde a incubação de células únicas até a implementação de reações de PCR, da genômica à síntese química. O acoplamento dos canais microfluídicos com válvulas reguladoras permite o controle sobre sua abertura e fechamento, permitindo assim a rápida produção de bibliotecas combinatórias em larga escala que consistem em uma população de gotículas com composições únicas. Neste artigo, são apresentados protocolos para a fabricação e operação de um dispositivo microfluídico bicamada baseado em PDMS acionado por pressão que pode ser utilizado para gerar bibliotecas combinatórias de emulsões de água em óleo chamadas plugues. Ao incorporar programas de software e hardware microfluídico, o fluxo de fluidos desejados no dispositivo pode ser controlado e manipulado para gerar bibliotecas de plugues combinatórios e controlar a composição e a quantidade de populações de plugues constituintes. Esses protocolos agilizarão o processo de geração de telas combinatórias, particularmente para estudar a resposta a medicamentos em células de biópsias de pacientes com câncer.

Introduction

A microfluídica permite a manipulação de pequenas quantidades de fluidos em microcanais1. A escala de operação de dispositivos microfluídicos típicos é de dezenas a centenas de micrômetros, o que permite a miniaturização de reações químicas e biológicas, permitindo assim que tais reações sejam realizadas com quantidades relativamente pequenas de reagentes. Inicialmente, os dispositivos microfluídicos foram fabricados com materiais como silício2 e vidro3. Embora ainda estejam em uso4, apresentam alguns problemas, como compatibilidade de solventes, alto custo de fabricação e dificuldades na integração de controles para fluxo de fluidos 5,6. As metodologias de fabricação baseadas em PDMS, denominadas litografia suave, oferecem uma alternativa barata para a prototipagem rápida de dispositivos7 e um caminho para fabricar dispositivos complexos de várias camadas8. A adição de válvulas e bombas aos dispositivos PDMS permite a capacidade de controlar o roteamento e a velocidade dos fluidos nos dispositivos 9,10. Vários métodos para projetar e acionar microválvulas de maneira reversível ou irreversível foram desenvolvidos - por exemplo, válvulas bimetálicas feitas de silício e alumínio, que são acionadas termicamente11 ou usando gás gerado a partir de uma reação eletroquímica para desviar uma membrana de nitreto de silício12. Gu et al. demonstram o uso dos pinos mecânicos de uma tela Braille para aplicar pressão em microcanais para regular o fluxo13. Um conjunto de microválvulas que ganhou popularidade são as válvulas pneumáticas baseadas em PDMS, pioneiras do grupo de Stephen Quake14. Normalmente, essas válvulas são compostas por dois microcanais ortogonais - um canal de fluxo e um canal de controle. Após a pressurização do canal de controle, uma fina membrana PDMS desvia sobre o canal de fluxo, fechando-o e, assim, interrompendo o fluxo do fluido. Uma vez despressurizada, a membrana relaxa, abrindo assim o canal de fluxo e permitindo a retomada do fluxo de fluido. As válvulas PDMS permitem, assim, a regulação do fluxo de forma robusta e reversível, uma vez que o canal de controle pode ser pressurizado e despressurizado várias vezes15. Além disso, como essas válvulas podem ser acionadas pela aplicação de pressão, elas abrem caminhos para controle e automação digital16. Além disso, como são do mesmo material, podem ser integrados perfeitamente na fabricação de dispositivos baseados em PDMS usando técnicas de litografia suave 8,17,18. Esses recursos tornam as válvulas PDMS uma escolha atraente para regulação de fluxo em dispositivos microfluídicos. Thorsen et al. usaram o princípio de tais válvulas para projetar um multiplexador fluídico - uma matriz combinatória de válvulas pneumáticas - para endereçar quase mil canais de fluxo de entrada com vinte canais de controle19. Este princípio foi estendido para rotear seletivamente fluidos para quimiostatos microfluídicos no chip, de modo que reações únicas possam ser realizadas simultaneamente em cada reator 20,21,22,23. No entanto, esses microrreatores, embora úteis para otimizar o uso de reagentes limitados, não podem paralelizar várias reações e não são suficientes para estudos de alto rendimento.

A microfluídica de gotículas é uma subcategoria da microfluídica que envolve a produção de gotículas por meio da manipulação do fluxo de líquido multifásico imiscível em dispositivos microfluídicos24. A formação de gotículas envolve a quebra de um fluido contínuo pela introdução de um fluido imiscível, resultando em um pinch-off devido à instabilidade na energia interfacial e na formação de uma emulsão25. Os surfactantes auxiliam na formação de gotículas arredondadas quando as emulsões saem do microcanal, estabilizando as energias interfaciais26. Gotículas maiores, chamadas plugues, são menos estáveis e podem ser coletadas em um compartimento de retenção (como um pedaço de tubo) como uma matriz de compartimentos aquosos espaçados em ambos os lados por um ou mais líquidos imiscíveis27. Além da miniaturização e compartimentalização, a microfluídica de gotículas também oferece maior rendimento de reações biológicas, pois um grande número de gotículas monodispersas pode ser produzido - cada uma servindo como um nanorreator28. As gotículas, uma vez geradas, também podem ser submetidas a outras manipulações, como divisão29,30, fusão31,32, classificação33,34 e montagem em estruturas de ordem superior35,36. A microfluídica de gotículas revolucionou vários campos e tecnologias científicas - do PCR37 à transcriptômica de célula única38, da descoberta de medicamentos39,40 à virologia41, do sequenciamento de próxima geração42 à síntese química43.

A integração de litografia suave baseada em PDMS e microválvulas com tecnologia de gotículas é uma combinação potente que permite a regulação do fluxo de fluido em microcanais e subsequente controle sobre o conteúdo de gotículas. Dependendo da abertura e fechamento dos canais, é possível produzir populações distintas de gotículas, cada uma com uma composição específica. Tal plataforma poderia miniaturizar, compartimentar e paralelizar reações bioquímicas e, portanto, ser uma técnica útil para triagem combinatória44. A triagem combinatória é um método de alto rendimento para gerar dezenas de milhares de combinações de reagentes selecionados para produzir bibliotecas que consistem em populações individuais de composição conhecida. A triagem combinatória tem sido usada para descobrir efeitos sinérgicos entre drogas e antibióticos para inibição do crescimento bacteriano45. No campo da terapia do câncer, a triagem combinatória tem sido usada para testar combinações de medicamentos anticâncer para um determinado paciente, avançando assim na terapia personalizada46,47. Mathur et al. construíram essa tecnologia integrando uma abordagem combinatória de código de barras de DNA para avaliar as alterações do transcriptoma na triagem de drogas de alto rendimento48. Assim, a triagem combinatória é uma tecnologia poderosa, mas nascente, e há uma necessidade de desenvolver diversas tecnologias microfluídicas para executar e facilitar tais procedimentos de triagem.

O objetivo deste manuscrito é apresentar um conjunto completo de protocolos para a fabricação de um dispositivo microfluídico bicamada capaz de gerar uma biblioteca combinatória de tampões de água em óleo e descrever o hardware e o software necessários para a operação de tal dispositivo. O fluxo de fluido é regulado usando válvulas pneumáticas baseadas em PDMS controladas por pressão, que por sua vez são controladas por um programa LabVIEW personalizado. O fluxo de reagentes no dispositivo é obtido usando bombas de pressão disponíveis comercialmente. Um protótipo de oito entradas é apresentado em que um tampão é formado pelo conteúdo de três entradas, cada uma contendo um reagente aquoso. A fase aquosa encontra uma fase oleosa contínua e os plugues são produzidos em uma junção em T com uma frequência de 0,33 Hz. O funcionamento do sistema é demonstrado pela produção de uma biblioteca quantitativa contendo três populações distintas de plugues fluorescentes. Essa tecnologia e o conjunto de protocolos ajudarão a agilizar a produção de bibliotecas combinatórias para fins de triagem de alto rendimento.

Protocol

1. Litografia suave

NOTA: O dispositivo microfluídico é composto por duas camadas, camada de fluxo e camada de controle (Figura 1A), e cada camada é moldada a partir de wafers padronizados individualmente usando um fotorresistente positivo e negativo, respectivamente (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre fotorresiste e reveladores).

  1. Execute a fabricação de wafer para a camada de fluxo conforme descrito abaixo.
    1. Desidratar uma bolacha de silício (100 mm de diâmetro, <1-0-0> orientada, 525) durante a noite (12-16 h) a 250 °C.
    2. Deixe o wafer esfriar antes de prosseguir com o revestimento giratório. Aplique 3-4 mL do fotorresistente positivo no centro do wafer.
    3. Gire por 40 s a 1400 rpm (344 rpm/s) para obter uma altura de recurso de 45 μm.
    4. Assar suavemente numa placa de aquecimento com uma rampa de temperatura, aumentando a 450 °C/h, de 35 °C a 105 °C. Esta etapa também pode ser realizada em tecidos de microfibra para evitar o contato direto e minimizar o borbulhar do fotorresistente. Retire o wafer da placa de aquecimento e deixe-o esfriar sobre os tecidos de microfibra.
    5. Colocar a fotomáscara (produzida comercialmente) correspondente à camada de fluxo (lado da emulsão para baixo) sobre a bolacha de silício revestida com resistência e expô-la sob uma lâmpada UV, a 10 mW/cm2, até atingir uma exposição total de 200 mJ/cm2 .
    6. Use duas placas de aquecimento - uma a 65 ° C e outra a 95 ° C - para realizar um cozimento pós-exposição - por 1 min e 7 min, respectivamente - nas placas.
    7. Desenvolva o wafer transferindo-o para uma placa de Petri cheia de revelador para fotorresistente positivo. Agite a placa de Petri agitando-a em um agitador de bancada com o wafer completamente submerso e atualize a solução do revelador periodicamente até que o wafer esteja completamente desenvolvido e os recursos possam ser vistos claramente.
    8. Use água desmineralizada para enxaguar a resistência residual do wafer e verifique em um microscópio estereoscópico se há resíduos dentro dos canais. Remova os resíduos retornando o wafer à solução do revelador ou adicionando-o cuidadosamente ao wafer com uma micropipeta. Depois de concluído, seque o wafer usando uma pistola de nitrogênio.
    9. Refluir o wafer colocando-o numa placa de aquecimento regulada para 110 °C durante 25 min. Esse processo resulta em recursos arredondados.
    10. Prossiga para a silanização do wafer conforme detalhado na etapa 1.3.
      NOTA: A deposição de vapor de hexametildisilazana (HMDS) também pode ser realizada nos wafers de silício antes da aplicação do resist para melhorar a adesão entre o resist e o wafer.
  2. Execute a fabricação de wafer para a camada de controle conforme descrito abaixo.
    1. Pegue outro wafer de silício e desidrate-o colocando-o em uma placa de aquecimento regulada a 110 °C por 15 min.
    2. Remova o wafer e deixe-o esfriar até a temperatura ambiente antes de prosseguir com o revestimento giratório.
    3. Aplique 5 mL do fotorresistente negativo no centro do wafer.
    4. Use o seguinte protocolo de rotação para obter uma altura de recurso de 40 μm: 5 s a 500 rpm (aceleração de 100 rpm/s), 33 s a 1400 rpm (300 rpm/s) e, finalmente, desacelerar para 0 rpm por 5 s a 300 rpm/s.
    5. Asse suavemente usando duas placas separadas ajustadas para 65 ° C e 95 ° C por 1 min e 15 min, respectivamente. Retire o wafer da placa de aquecimento e deixe-o esfriar sobre os tecidos de microfibra.
    6. Colocar a fotomáscara (produzida comercialmente) correspondente à camada de controlo (lado da emulsão para baixo) sobre o wafer revestido com resistência e expor o wafer sob uma lâmpada UV, regulada para 15 mW/cm2, até se atingir uma exposição total de 250 mJ/cm2 .
    7. Utilizar duas placas de aquecimento - uma a 65 °C e outra a 95 °C - e cozedura o wafer a posteriori durante 2 min e depois 5 min, respectivamente. Retire o wafer da placa de aquecimento e deixe-o esfriar sobre os tecidos de microfibra.
    8. Revele o wafer transferindo-o para uma placa de Petri cheia de revelador para fotorresistente negativo por 4 min. Atualize o desenvolvedor e continue o processo por mais 4 minutos.
    9. Enxágue o wafer com isopropanol para remover o fotorresistente residual e use um microscópio estéreo para verificar se há resíduos no interior dos canais.
    10. Remova os resíduos retornando o wafer à solução do revelador ou adicionando-o cuidadosamente ao wafer com uma micropipeta. Depois de concluído, seque o wafer usando uma pistola de nitrogênio.
    11. Depois de totalmente desenvolvido, coze o fotorresistente colocando o wafer numa placa de aquecimento regulada a 95 °C durante 10 min.
    12. Prossiga para a silanização conforme detalhado na etapa 1.3.
  3. Realize a silanização conforme descrito abaixo.
    1. Coloque o wafer em um dessecador. Coloque um frasco de vidro no dessecador e adicione 4-5 gotas de 1,1,3,3 tetrametildisiloxano.
      CUIDADO: 1,1,3,3 tetrametildisiloxano não é tóxico, mas é inflamável. Outros silanos podem ser usados, mas podem ser tóxicos. Recomenda-se realizar a silanização em uma capela de exaustão usando os Equipamentos de Proteção Individual (EPI) necessários, como jaleco, óculos e luvas de nitrilo.
    2. Puxe o aspirador por 15 min e sele o dessecador por 12-16 h para permitir que o silano se deposite no wafer.
    3. Abra o dessecador e descarte a garrafa de vidro. Coloque o wafer em uma placa de Petri limpa.
  4. Execute a fabricação de dispositivos microfluídicos conforme descrito abaixo.
    NOTA: O protocolo a seguir foi adaptado de trabalhos anteriores23.
    1. Prepare duas soluções PDMS separadas - uma para a camada de fluxo e outra para a camada de controle. Para cada solução, misturar o agente de base e o agente de cura do kit PDMS num copo e agitar com uma vareta de mistura. A camada de controle requer 10 g de agente base e 0,5 g de agente de cura (proporção 20:1), enquanto a camada de fluxo requer 40 g do agente base e 8 g do agente de cura (proporção 5:1).
    2. Desgaseifique as soluções PDMS em um dessecador até que as soluções estejam livres de gás.
    3. Coloque o wafer da camada de fluxo silanizado em uma placa de Petri coberta com papel alumínio e despeje a solução PDMS correspondente sobre o wafer. Coloque a placa de Petri de volta no dessecador e puxe o aspirador para desgaseificar ainda mais (por aproximadamente 20 min).
    4. Gire o wafer da camada de controle silanizado com sua solução PDMS correspondente. Despeje 3-4 mL da solução no centro do wafer e gire por 20 s a 1500 rpm a 408 rpm / s. Coloque o wafer em uma superfície nivelada em uma placa de Petri fechada por 20 minutos.
    5. Coloque as camadas de fluxo e controle em um forno a 80 °C por 18-20 min. Monitore periodicamente as duas camadas para verificar se estão curadas. As camadas estão prontas quando são duras o suficiente para serem maleáveis, mas ligeiramente pegajosas, pois isso melhora a ligação entre as duas camadas.
    6. Corte o PDMS ao redor de cada um dos dispositivos no wafer da camada de fluxo com um bisturi. Certifique-se de não cortar muito perto dos recursos e deixe aproximadamente 2 cm de espaço entre o recurso e as bordas do PDMS. Uma vez separado do wafer de silício, cubra o bloco PDMS com fita adesiva no lado do recurso para evitar qualquer contaminação por poeira.
    7. Uma vez que todos os blocos PDMS tenham sido cortados, coloque-os um a um no wafer da camada de controle correspondente, realizando um alinhamento aproximado a olho nu.
    8. Depois que todos os blocos tiverem sido colocados em suas áreas correspondentes na camada de controle, ajuste a posição de cada um dos blocos de forma que as válvulas de controle se sobreponham aos canais de fluxo correspondentes para completar o alinhamento. Isso também pode ser realizado com a ajuda de um microscópio estéreo.
    9. Remova as bolsas de ar entre as duas camadas aplicando pressão. Se a bolsa de ar estiver ligada ou perto de um recurso, tome cuidado para não colapsar os canais durante a aplicação de pressão.
    10. Coloque os dispositivos no forno a 80 °C e deixe-os agir por 12-16 h. Coloque pesos de 100 g em cada um dos dispositivos para melhorar a ligação entre as duas camadas.
    11. Retire o wafer e corte cada dispositivo individual. Retire os dispositivos do wafer da camada de controle e cubra o lado do recurso com fita adesiva.
    12. Coloque cada dispositivo individual em uma esteira de corte com o lado do recurso voltado para cima e faça um furo para cada uma das oito entradas da camada de fluxo, oito entradas do canal da camada de controle, as entradas de óleo e a saída usando um punção de biópsia de 0,75 mm com o lado do recurso voltado para cima.
    13. Carregue o asher de plasma com uma lâmina de microscópio e um único dispositivo com a fita removida e o lado do recurso voltado para cima. Execute o incineramento de plasma de oxigênio com uma potência de 30 W por uma duração de 20 s.
    14. Retire o dispositivo e a corrediça de vidro assim que o corte estiver completo e coloque o dispositivo com o lado do recurso voltado para baixo na lâmina. A adesão entre o PDMS e o vidro deve ser imediatamente visível a olho nu. Aplique pressão em qualquer região com bolsas de ar para espremer o ar.
    15. Coloque os dispositivos em uma placa de aquecimento regulada para 110 °C por 60 min com um peso por cima para melhorar a ligação do PDMS ao vidro.

2. Configuração de hardware

NOTA: Um esquema das conexões com o dispositivo microfluídico é mostrado na Figura 1B e uma realização de tal esquema usando o hardware necessário é mostrada na Figura 2.

  1. Configure as válvulas pneumáticas conforme descrito abaixo.
    NOTA: Cada canal de controle, que regula uma válvula PDMS no chip, é controlado por uma única válvula solenóide. O protótipo aqui apresentado consiste em oito canais de controle (Figura 1A) e, portanto, são necessárias oito válvulas solenoides.
    1. As válvulas solenoides são controladas usando um programa de software LabVIEW personalizado (Main Interface Program; Figura 3 e Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4). Este programa envia comandos MODBUS através de uma conexão TCP (Arquivo Suplementar 5, Arquivo Suplementar 6), para um controlador WAGO. Conecte o dispositivo WAGO ao computador com o programa LabVIEW usando um cabo ethernet. Prossiga para conectar as válvulas solenóides sequencialmente às portas do controlador WAGO. Para uma descrição mais detalhada, consulte os protocolos descritos anteriormente23.
    2. Conecte o conjunto de válvulas solenóides a uma fonte de ar comprimido usando 1/4 de polegada de tubulação e ajuste a pressão do conjunto de válvulas para 3,5 bar. Nesse sistema, foram utilizadas as oito válvulas marcadas de 9 a 16.
  2. Configure os reguladores de pressão conforme descrito abaixo.
    NOTA: Uma bomba de pressão disponível comercialmente é usada para controlar o fluxo de fluido (Figura 2). Um conjunto de bombas de oito portas e um conjunto de quatro portas foram usados para acomodar oito entradas aquosas e duas entradas de óleo no dispositivo. A pressão de cada porta é regulada por meio de software fornecido pelos fabricantes.
    1. Conecte a bomba de pressão a uma fonte de ar comprimido garantindo que a pressão fornecida não exceda a pressão máxima permitida pela bomba (2.2 bar para os controladores de oito e quatro portas).
    2. Conecte as bombas de pressão a um computador usando um conector USB.
    3. Uma vez que as bombas são ligadas, elas devem estar visíveis no software correspondente. Defina as pressões para zero durante a configuração das bombas.
    4. Conecte um luer macho ao conector farpado de 3/32 pol. a cada uma das 12 portas de saída de trava luer fêmea nos controladores.
    5. Conecte um pedaço de tubo macio (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 15 cm) à farpa. Conecte outro luer macho ao conector de farpa de 3/32 de polegada à outra extremidade do tubo macio.
    6. Conecte um stub luer (23 G, 0.5 pol.) ao conector de farpa. Neste ponto, o regulador de pressão está configurado e pronto para ser usado.

3. Configuração do dispositivo microfluídico

  1. Conecte a tubulação do canal de controle conforme descrito abaixo (Figura 2).
    1. Para cada canal de controle, corte um pedaço de tubo de politetrafluoretileno (PTFE) (OD: 0.042 pol., ID: 0.022 pol.). Insira o pino de um stub luer de 23 G, 0.5 pol. em uma extremidade.
    2. Conecte o stub luer a um luer macho para um conector de nylon farpado de 3/32 pol. Insira a farpa do conector em um pedaço de tubo de poliuretano (OD: 4 mm, ID: 2.5 mm). Conecte a outra extremidade do tubo de poliuretano diretamente a uma válvula solenóide.
    3. Encha uma seringa com água e conecte um topo luer de 23 G, 0,5 pol. na extremidade.
    4. Conecte a extremidade livre do tubo de PTFE a esta seringa e injete água até aproximadamente a metade do tubo.
    5. Desconecte o tubo da seringa e insira a extremidade livre do tubo em um orifício perfurado do canal de controle correspondente (Figura 1A-C 1-8). Repita até que cada canal de controle tenha sido conectado à sua válvula solenóide correspondente.
      NOTA: Neste trabalho, as válvulas solenoides 9-16 foram conectadas aos canais de controle correspondentes a C1 a C8, respectivamente. Embora possam ser conectados de qualquer maneira, é importante lembrar a ordem e a sequência das conexões, especialmente durante a operação do programa de interface principal.
    6. Use o programa de interface principal (Figura 3) para abrir todas as válvulas solenóides (Pressurizar todos os canais de controle). Isso empurrará o fluido da tubulação para os canais de controle do dispositivo microfluídico e, assim, o preencherá. Um exemplo de válvulas pressurizadas e despressurizadas é mostrado na Figura 4.
  2. Conecte os reagentes e prepare o dispositivo conforme descrito abaixo.
    1. Certifique-se de que todos os canais de controle estejam pressurizados pressionando o botão Pressurizar todos os canais de controle no programa de interface principal (Figura 3).
    2. Para cada um dos reagentes aquosos, corte um segmento de tubo de PTFE (OD: 0,042 pol., ID: 0,022 pol.) longo o suficiente para conectar as bombas às entradas das entradas do dispositivo microfluídico. Conecte uma das tubulações ao stub luer da etapa 2.2.6.
    3. Encha uma seringa com o reagente necessário e conecte um cano luer de 23 G, 0,5 pol.
    4. Injete o reagente no tubo de PTFE correspondente até que o tubo esteja cheio. Tome cuidado para que o reagente não entre na porta de saída do conjunto de bombas.
    5. Insira a extremidade livre da tubulação em uma entrada correspondente no chip microfluídico.
    6. Aplicar uma pressão de 400 mbar a cada um dos reagentes aquosos de entrada utilizando o software fornecido.
    7. Despressurize sequencialmente os canais de controle individualmente usando o programa de Interface Principal (Figura 3) para garantir que todos os reagentes tenham atingido a junção em T do dispositivo. Acione válvulas individuais, se necessário, pressionando os botões correspondentes no programa na caixa Canais de Controle Pressurização Manual.
    8. Repita as etapas 3.2.3 a 3.2.5 para os reagentes de óleo. Aplique uma pressão de 400 mbar a cada um dos reagentes de óleo de entrada.
    9. Despressurize simultaneamente todos os canais de controle pressionando Despressurizar todos os canais de controle (Figura 3) até que todo o ar tenha sido removido do dispositivo. Isso é observável a olho nu ou sob um microscópio.
    10. Pressurize todos os canais de controle pressionando o botão Pressurizar todos os canais de controle (Figura 3). Nesta fase, todos os reagentes foram conectados e o dispositivo está preparado e pronto para uso.
  3. Programe e execute o experimento conforme descrito abaixo.
    1. Codifique a composição, a sequência e as réplicas de cada população de plugues a serem produzidas em um arquivo .csv, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 7 , que serve como entrada para o Experimento Automático no programa de Interface Principal (Figura 3). Marque os canais de controle necessários com um 0 se corresponder a uma entrada que precisa ser aberta e um 1 se precisar ser fechado. Cada linha no arquivo .csv corresponde a uma população de plugues distinta.
    2. Carregue o .csv no programa de interface principal clicando no botão Pasta na guia Arquivo de experimento .
    3. Insira os campos relevantes no programa, como Iterações do experimento (para determinar quantas vezes a sequência de plugues é produzida), Tempo de despressurização (para determinar por quanto tempo os canais de entrada precisam ser abertos e o canal de controle correspondente precisa ser despressurizado em milissegundos), Tempo de pressurização (para determinar por quanto tempo as entradas precisam ser fechadas entre as sequências de preenchimento de plugues em milissegundos).
    4. Selecione o(s) canal(is) de entrada correspondente(s) à produção de código de barras na seção Entradas de código de barras (até 3 canais) junto com o tempo durante o qual eles precisam estar abertos (Tempo para código de barras (ms)). Como alternativa, esses códigos de barras também podem ser codificados no arquivo de .csv de entrada, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 7.
    5. Reduza a pressão dos reagentes de óleo de entrada para 200 mbar.
    6. Conecte uma tubulação de PTFE (OD: 0.042 pol., ID: 0.022 pol.) do comprimento desejado na tomada para coletar os plugues. Para garantir uma produção uniforme de plugues, use tubos de aproximadamente 100 cm pré-preenchidos com plugues para coleta. Isso é para neutralizar a diferença de pressão na saída que é exercida pela coleta de plugues na tubulação.
    7. Pressione Executar experimento para iniciar o programa e a produção de plugues.
  4. Execute o registro e a análise de dados conforme descrito abaixo (consulte a Figura 5).
    NOTA: Esta seção descreve especificamente um método para analisar plugues fluorescentes. Dependendo da natureza dos plugues gerados, esta seção pode ser alterada conforme necessário.
    1. Encha uma seringa com óleo (óleo mineral ou óleo fluorado) e conecte um topo luer de 23 G 0.5 pol. na extremidade. Fixe a seringa a uma bomba.
    2. Conecte uma das extremidades do tubo coletor cheio ao topo luer na seringa. Fixe a outra extremidade do tubo de coleta preenchido acima da lente objetiva de um microscópio.
    3. Coloque um reservatório de resíduos abaixo da extremidade da tubulação perto da objetiva.
    4. Focalize o microscópio em uma determinada região da tubulação e configure-o para registrar a fluorescência no(s) canal(is) desejado(s).
    5. Ajuste a bomba para uma vazão de 50 μL/min.
    6. Grave o vídeo do canal fluorescente como um arquivo .avi.
    7. Analise o arquivo .avi usando o script python fornecido (Arquivo Suplementar 8) para extrair a fluorescência média em uma região de interesse (ROI) predefinida por quadro do arquivo .avi (um exemplo disso é dado no Arquivo Suplementar 9).
    8. Use o script R personalizado fornecido (Arquivo Suplementar 10) para extrair as condições e plotar os dados brutos e as alturas dos picos.
      NOTA: O script R no Arquivo Suplementar 10 foi usado para análise neste artigo. As funções R personalizadas usadas neste script para cortar dados, detectar condições usando códigos de barras e analisar as alturas de pico para plugues individuais e plotagem são fornecidas no Arquivo Suplementar 11.

Representative Results

Uma das características cruciais do chip microfluídico são as válvulas PDMS e sua capacidade de regular o fluxo de fluido foi caracterizada por influenciar o paradigma operacional do dispositivo. Para este fim, a vazão de água destilada (medida usando um sensor de vazão comercial) através dos canais de entrada foi registrada em função de diferentes pressões de entrada durante a pressurização periódica (3,5 bar por 2000 ms) e despressurização (1000 ms) das válvulas PDMS (Figura 6A). Observou-se que as válvulas foram capazes de regular o fluxo de fluido até aproximadamente 800 mbar de pressão de entrada, conforme indicado pela queda na vazão para zero quando as válvulas são acionadas (Figura 6 B-D). Isso valida o uso de tais válvulas baseadas em PDMS para regular o fluxo de reagentes dentro dos canais. Além disso, a 1200 mbar, a pressão de entrada é muito alta para as válvulas regularem o fluxo, como é evidenciado pela vazão não reduzir a zero (Figura 6E). Embora a duração da pressurização e despressurização das válvulas PDMS possa ser modificada, a taxa de variação do fluxo de fluido nas condições atuais de pressurização (2000 ms) e despressurização (1000 ms) foi calculada. Para uma pressão de entrada de 400 mbar, o fluxo pode ser ligado e desligado a uma taxa de 1.26 Hz e 1.44 Hz, respectivamente (Figura 6C).

Iterações anteriores de um dispositivo microfluídico combinatório de alto rendimento semelhante também incorporaram um canal de resíduos acoplado a cada canal de fluxo46,47. Esses dispositivos foram operados em um regime de vazão constante (onde os reagentes foram injetados no dispositivo a taxas de fluxo constantes, em vez de pressão constante), e os canais de resíduos foram programados para abrir quando seus canais de entrada correspondentes fossem fechados para aliviar qualquer acúmulo de pressão. Esses canais, embora úteis, resultam em perda de reagentes, pois o conteúdo do canal de resíduos não contribui para a formação de tampões. Além disso, canais de controle adicionais - e, portanto, bombas adicionais - também são necessários para regular a abertura e o fechamento dos canais de resíduos. No protótipo aqui apresentado, os canais de resíduos foram removidos e foi estabelecido um paradigma operacional que permite reduzir o desperdício de reagentes e reduzir a complexidade operacional e de design. Isso envolve a injeção dos reagentes aquosos no modo de pressão constante, em oposição ao modo de vazão constante. Para melhor compreensão dos dois regimes, a relação entre pressão e vazão nos canais durante o acionamento da válvula foi avaliada em cada caso (usando a mesma configuração mostrada na Figura 6A), cujos resultados são mostrados na Figura 7. Na Figura 7A, a vazão de água destilada foi medida durante a injeção a uma pressão constante (300 mbar) e observou-se que durante o acionamento da válvula, a vazão cai para zero e após a despressurização da válvula a vazão se recupera para os níveis pré-atuação. No entanto, em um regime de vazão constante, em que a pressão nos canais foi registrada durante a injeção da água destilada a uma vazão constante (2,5 μL/min; Figura 7B), o acionamento da válvula não resultou no fechamento completo da entrada - evidenciado pela vazão não cair para zero - e foi observado um acúmulo de pressão no canal. Esta é a pressão que é aliviada pela abertura de canais de resíduos. Como um regime de pressão de entrada constante permite a operação do dispositivo sem contrapressão no acionamento da válvula, negando assim a necessidade de canais de resíduos, esse regime foi adotado para a operação do chip microfluídico.

Para demonstrar a funcionalidade do dispositivo microfluídico, foi gerada uma biblioteca combinatória quantitativa de plugues fluorescentes. Para as oito entradas do dispositivo, três reagentes aquosos - fluoresceína (50 μM) em quatro entradas (I1Eu3, Eu5, Eu7), água destilada em três entradas (I4Eu6, Eu8), uma entrada com um corante de cor azul (I2; para atuar como um código de barras) - e dois reagentes de óleo - óleo fluorado (FC-40) e óleo mineral (MO) nas entradas O1 e O2, respectivamente - foram plugados (Figura 1A, Figura 8A). O óleo fluorado serve como fase de suporte na qual os plugues aquosos são dispersos, e o óleo mineral auxilia na estabilidade do plugue e minimiza a adesão do conteúdo do plugue às paredes, minimizando assim a contaminação cruzada entre os plugues46. Com três entradas contribuindo para a composição de uma única população de plugue, essa configuração pode gerar três populações fluorescentes distintas: FFF - composta de fluoresceína de três canais, FFW - composta de fluoresceína de dois canais e água de um canal, e FWW - composta de fluoresceína de um canal e água de dois canais. Com essa configuração, existem 12 condições distintas (populações de plugues produzidas com uma combinação distinta de três entradas) que podem produzir plugues FWW, 18 condições distintas que podem produzir plugues FFW e quatro condições distintas que podem produzir plugues FFF. Portanto, o chip foi programado para produzir essas 34 condições diferentes com cinco plugues de réplica diferentes cada, juntamente com cinco réplicas de plugues de código de barras separando-os. Recomenda-se intercalar as populações de plugues fluorescentes com uma população de código de barras, ou seja, um conjunto de plugues coloridos (idealmente não fluorescentes) (neste caso formados pela abertura dos canais de entrada correspondentes ao corante azul e dois canais de água destilada) que são visíveis a olho nu. Ele permite que o usuário monitore a produção de plugues em busca de problemas como quebra ou fusão de plugues e ajuda na análise downstream dos plugues. Para tanto, um total de 340 plugues - 170 plugues experimentais e 170 plugues de código de barras separando as diferentes condições - foram gerados e coletados em tubos de PTFE, dos quais uma amostra é mostrada em Figura 8B. O tempo de despressurização e o tempo de pressurização foram fixados em 1000 ms e 2000 ms, respectivamente. A fluorescência dos plugues e sua variabilidade dentro e entre as diferentes condições experimentais foram analisadas, cujos resultados são mostrados em Figura 8C,D. Figura 8C Mostra a fluorescência por quadro do arquivo .avi gerado na etapa 3.4.6, que destaca as 34 condições experimentais em consideração (demarcadas por uma linha azul). O valor fluorescente médio dos picos dentro de uma condição é mostrado em vermelho e as linhas tracejadas indicam o erro padrão dentro dessa condição. As alturas dos picos de todos os plugues em cada população, obtidas subtraindo-se a fluorescência basal da fluorescência máxima detectada em cada pico, foram plotadas em Figura 8D. O último pico em cada condição foi negligenciado para os cálculos, pois era um tampão contaminado devido à mistura de reagentes na junção T (uma vez que a fluorescência dos tampões foi registrada na ordem inversa da produção do tampão, o primeiro tampão em uma população durante a produção é o último tampão em uma população durante a análise). Evidenciou-se que a altura dos plugues de PFT é de cerca de um terço (média = 40,9, desvio-padrão = 3,1) e a dos plugues de PFT é de cerca de dois terços (média = 78,4, desvio-padrão = 5) da altura dos plugues de FFF (média = 117, desvio-padrão = 10). Esses resultados correspondem às proporções esperadas de fluorescência em diferentes populações de plugues FFF/FFW/FWW, o que destaca a robustez do dispositivo e seu funcionamento.

Figure 1
Figura 1: Esquema do design do dispositivo e configuração microfluídica. (A) A camada de fluxo do chip é mostrada em azul e a camada de controle é mostrada em vermelho. Um total de oito reagentes aquosos exclusivos podem fluir através das entradas (I1-8) em direção à junção em T, onde encontram as fases oleosas das entradas de óleo (O1-2) para formar tampões que são coletados na saída. Cada canal de fluxo de entrada está sob o controle de um canal de controle exclusivo (C1-8). (B) O esquema do chip microfluídico junto com as conexões da tubulação com as entradas, canais de controle e reagentes de óleo é mostrado junto com a tubulação de saída. As setas indicam a direção do fluxo de fluido na tubulação. A inserção mostra o princípio de funcionamento das válvulas PDMS. As linhas tracejadas indicam que a camada de controle está abaixo da camada de fluxo. Esta figura foi modificada de Dubuc et al49. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema da configuração de hardware para produção de plugues. As bombas de pressão controlam o fluxo de reagentes (aquosos e óleo) nos canais de entrada, e as válvulas solenóides controlam o acionamento das válvulas PDMS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: O programa de interface principal para controlar o dispositivo microfluídico. Este programa feito sob medida permite a pressurização manual de válvulas pneumáticas individuais (painel branco). Também permite a execução de um experimento completo (painel azul) onde aceita um arquivo .csv com as populações de plugues desejadas e parâmetros necessários, como tempos de pressurização e despressurização da válvula, e exibe o status da execução do experimento, incluindo quais canais de controle são pressurizados e não, em tempo real. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Acionamento da válvula acionada por pressão. Imagens de microscopia de campo claro de (A) válvula PDMS (horizontal) sendo despressurizada e o canal de entrada (vertical) aberto e (B) válvula PDMS sendo pressurizada e fechando o canal de entrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Esquema da configuração de gravação de dados. O tubo de coleta é conectado a uma seringa com óleo, que é afixada a uma bomba. Os plugues são transportados através do tubo de coleta e as imagens/vídeos são capturados usando um microscópio de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Efeito da atuação da válvula na vazão em uma determinada pressão de entrada. (A) Esquema da configuração de hardware usada para monitorar a vazão nos canais microfluídicos. A resposta da vazão nos canais quando operados em diferentes pressões de entrada de (B) 200 mbar, (C) 400 mbar, (D) 800 mbar e (E) 1200 mbar. A duração da atuação da válvula é mostrada na região sombreada em vermelho. Água destilada foi usada para todos os experimentos. O desvio padrão de três medições independentes é mostrado pela região sombreada em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Relação entre pressão e vazão de reagentes nos canais de entrada após o acionamento da válvula. (A) Em uma válvula de regime de pressão de entrada constante (300 mbar), a vazão reduz a zero após o acionamento da válvula. (B) Em um regime de vazão constante (2,5 μL/min), o acionamento da válvula resulta em rápido aumento de pressão no canal até que a válvula seja despressurizada. A duração da atuação da válvula é mostrada na região sombreada em vermelho. Água destilada foi usada para todos os experimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Produção de populações de plugues fluorescentes. (A) Esquema da configuração experimental que descreve a conexão dos diferentes reagentes ao dispositivo. Abreviaturas: F = Fluoresceína, W = água destilada, B = Corante alimentar azul, FC-40 = óleo fluorado e MO = óleo mineral. (B) Exemplo de imagem da tubulação de coleta contendo plugues. (C) Os dados brutos obtidos da análise mostram a intensidade média de fluorescência medida em uma região de interesse (ROI) especificada versus o número do quadro do arquivo de vídeo. As linhas vermelhas mostram a média do pico de fluorescência para cada condição (população de plugues produzidos com uma combinação específica de três entradas) e as linhas tracejadas mostram o erro padrão correspondente. (D) Boxplots da altura dos picos nas diferentes condições. Os pontos correspondem a picos individuais, as caixas para cada condição variam do primeiro ao terceiro quartil da distribuição dos picos correspondentes e a linha grossa é usada para o valor mediano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: O programa de interface principal para operação do dispositivo. A interface de controle para pressurização manual dos canais de controle e execução de um experimento automático no dispositivo de oito entradas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: Programa de interface principal alternativo para operação do dispositivo. A interface de controle para executar um dispositivo de oito entradas sem uma função de código de barras. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 3: Subprograma do LabVIEW com variáveis globais. SubVI do programa de interface principal listando e exibindo o status das variáveis globais no programa de interface principal, ou seja, os canais de controle. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 4: Programa LabVIEW para salvar valores de variáveis globais. SubVI do programa de interface principal que salva o estado atual das válvulas como uma matriz, que será usada para manter o mesmo estado das válvulas no caso de o usuário ficar inativo por mais de 30 segundos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 5: Programa LabVIEW do Transmission Control Protocol (TCP). SubVI para manter a conexão TCP entre o programa de interface principal e o controlador WAGO. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 6: Subprograma LabVIEW da variável global TCP. Programa para armazenar a variável de saída TCP. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 7: Entrada para realização de experimento automático. O arquivo .csv que codifica composição, sequência e réplicas de populações de plugues para a realização de experimentos para produzir plugues fluorescentes quantitativos, conforme detalhado neste artigo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 8: Script Python para análise da população de plugues fluorescentes. Script python personalizado para ler valores de fluorescência da gravação de plugues (arquivo .avi). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 9: Saída da análise de fluorescência de plugues. Saída do script Python contendo valores de fluorescência para um ROI 5x5 da gravação dos plugues. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 10: Programa R para ler o arquivo de saída. Programa personalizado usado neste trabalho para ler os valores fluorescentes de saída e plotar dados brutos, alturas de pico e desvios padrão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 11: Funções R para analisar e plotar dados fluorescentes. Funções R personalizadas que são usadas para 1. cortar os dados brutos dos valores fluorescentes, 2. definir diferentes condições experimentais, 3. identificar picos das condições dadas, 4. plotar os dados brutos e as condições detectadas sobrepostas e 5. plotar os picos identificados e os dados brutos sobrepostos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Neste artigo, foi apresentado um conjunto de protocolos para a fabricação e operação de um dispositivo microfluídico baseado em PDMS para a geração automatizada de bibliotecas combinatórias em compartimentos de água em óleo chamados plugues. A combinação de microfluídica com tecnologia de gotículas fornece uma técnica poderosa para encapsular pequenas quantidades de reagentes em um grande número de compartimentos, abrindo caminhos para triagem combinatória em larga escala.

Anteriormente, várias tecnologias foram descritas para gerar compartimentos quimicamente distintos usando microfluídica, cada uma com suas vantagens e limitações. Kulesa et al.50, descreveram uma estratégia para encapsular células com códigos de barras em gotículas usando placas de microtitulação e mesclar essas gotículas usando um campo elétrico para criar uma biblioteca combinatória. Embora essa abordagem possa gerar muitas combinações de gotículas, ela é limitada pela necessidade de etapas de manuseio manual no fluxo de trabalho. Tomasi et al.51 desenvolveram uma plataforma microfluídica para fundir uma gotícula contendo esferoides (agregados de células flutuantes livres) com uma gota de estímulo, permitindo assim a manipulação do microambiente esferoide. Este método permite o estudo de fenômenos importantes, como interações célula-célula e o efeito de drogas, mas é relativamente baixo. Eduati et al.46 e Utharala et al.47 desenvolveram uma plataforma baseada em válvula microfluídica que pode gerar bibliotecas combinatórias de alto rendimento de forma automatizada. No entanto, nesses estudos, as válvulas são operadas usando um dispositivo Braille, o que requer etapas de alinhamento complicadas entre a microválvula e o chip microfluídico. Uma característica fundamental do sistema descrito neste artigo é a implementação de válvulas pneumáticas PDMS para regular o fluxo de fluido nos canais de entrada. Como essas válvulas são baseadas em PDMS, elas podem ser incorporadas sem problemas nas etapas de fabricação do chip microfluídico. Além disso, eles são uma opção relativamente simples para controlar o fluxo de líquidos nos canais de entrada, pois podem ser acionados aplicando pressão através de uma fonte externa de gás. Finalmente, a duração e a sequência de pressurização e despressurização dessas válvulas podem ser programadas, automatizando assim a produção de populações distintas de plugues de maneira de alto rendimento. Outra característica importante é o uso de regimes de pressão constante para a injeção de reagentes através da entrada, o que permite optar por não incorporar canais de resíduos para aliviar qualquer acúmulo de pressão que surja em um regime de vazão constante. Isso simplifica o design do dispositivo, reduz a necessidade de válvulas e hardware adicionais para controlar as válvulas do canal de resíduos e minimiza o desperdício de reagente.

Embora a fabricação de dispositivos com PDMS seja relativamente simples, a implementação de tais dispositivos requer o uso de extensa parafernália de hardware, como as válvulas solenóides pneumáticas (para controlar o acionamento das válvulas PDMS), bombas de pressão (para controlar o fluxo de entrada e reagentes de óleo) e programas de software (para regular as válvulas solenóides). Embora representem um investimento significativo, essa configuração fornece consistência e confiabilidade para a operação bem-sucedida do dispositivo. Além disso, os componentes de hardware e a arquitetura descritos neste protocolo são configurados de forma modular. Portanto, alternativas podem ser usadas para alguns módulos para reduzir custos ou adaptá-los a uma necessidade específica. Por exemplo, existe uma variedade de bombas que podem ser usadas com base na utilidade, orçamento, disponibilidade e conveniência 52,53,54. Componentes adicionais, como reservatórios de fluido e reguladores de temperatura, podem ser incorporados para reagentes de entrada sensíveis23. Além disso, esse projeto pode ser ampliado ou reduzido para atender a necessidades científicas específicas. Por exemplo, neste artigo, é descrito um protótipo de oito entradas que permite que oito reagentes exclusivos sejam combinados para produzir plugues. Isso pode ser ampliado para um dispositivo de 16 entradas, o que permite um número maior de entradas e combinações maiores das mesmas. Consequentemente, serão necessários canais de controle extras e válvulas solenóides para lidar com as entradas, mas esse protótipo permite que bibliotecas combinatórias maiores e mais diversificadas sejam geradas. Finalmente, neste artigo, cada população de plugue é produzida pela abertura de três das oito entradas aquosas do dispositivo microfluídico. Observou-se que, para tal configuração, uma pressão de aproximadamente 200 mbar para os reagentes de óleo e 400 mbar para os reagentes aquosos correspondia a um regime de produção de tampão, que é acionado exclusivamente pelo acionamento da válvula. Quando pressões mais altas foram aplicadas ao(s) óleo(s), foi observada uma quebra dos plugues e a aplicação de pressões mais baixas levou a uma fusão dos plugues. O regime de pressão ideal para a produção de plugues depende de uma ampla gama de fatores, como o número de entradas que contribuem para a formação de um plugue, a natureza e a viscosidade dos fluidos e as dimensões dos canais, e deve ser otimizado conforme e quando necessário.

Uma das desvantagens de operar em um regime de pressão constante é que fluidos com viscosidades diferentes têm vazões diferentes sob pressão constante. Portanto, é necessário garantir que os reagentes aquosos que fluem através das entradas sejam de viscosidades comparáveis. O uso de fluidos de diferentes viscosidades afetará não apenas o fluxo de fluido nos canais de entrada, mas também a formação de plugues na junção em T, comprometendo assim a composição das populações de plugues. Outra desvantagem é a contaminação de uma população de tampão por reagentes residuais na junção em T. Quando o dispositivo alterna entre a produção de diferentes populações de plugues, o primeiro/último plugue na sequência de cada população tende a ser contaminado pela população anterior ou seguinte. Isso pode ser superado produzindo réplicas extras de cada população e descontando o tampão contaminado durante a análise. Finalmente, há também o potencial de variação entre dispositivos individuais decorrentes de inconsistências na fabricação e/ou fontes externas (flutuações de pressão). Esse problema pode ser mitigado reutilizando um único chip microfluídico várias vezes e garantindo que uma execução completa de uma biblioteca combinatória seja executada em um único chip para minimizar o efeito dessas inconsistências.

O dispositivo microfluídico e o conjunto de protocolos operacionais que o acompanham apresentados neste artigo foram usados para demonstrar a produção de uma biblioteca combinatória quantitativa de plugues. Essa plataforma pode, portanto, gerar rapidamente bibliotecas combinatórias de populações distintas de plugues de maneira de alto rendimento. Como resultado, essas tecnologias podem ser usadas para uma variedade de fins de triagem, incluindo, mas não se limitando a, triagem combinatória de drogas em amostras de biópsia de pacientes - em que um pequeno número de células recuperadas de uma biópsia pode ser distribuído em um grande número de gotículas e tratado com uma grande combinação do medicamento anticâncer para otimizar a terapia individual para uma determinada amostra de paciente - e, portanto, acelerar a terapia personalizada do câncer46, 48,55.

Disclosures

F. E. é freelancer da TheraMe! AG. Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Stacey Martina, do NanoLab TuE, pela ajuda com a deposição de vapor HMDS. Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Sistemas Moleculares Complexos (ICMS) da TU/e e pelo programa de gravitação da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO) IMAGINE! (número do projeto 24.005.009).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1,3,3 tetramethyldisiloxane Merck Life Science NV MFCD00008256
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504
Acetone Boom Labs BOOMSKEUZW3
Analysis Software Eindhoven University of Technology https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE
AZ 40XT 11D Merck Life Science NV  212299  Positive photoresist 
AZ 726 MIF developer Merck Life Science NV 10055824960 Developer for positive photoresist
Biopsy Punch, Rapid Core World Precision Instruments Germany, GMBH 504529 0.75 mm ID, W/Plunge
Blue food dye PME FC1036
Controller end module  WAGO Kontakttechnik GmbH  750-600
Ethernet Controller  WAGO Kontakttechnik GmbH  750-881
FC-40 Merck Millipore F9755-100ML
Fluigent flow unit Fluigent FLU-S-D
Fluigent pressure system  Fluigent  MFCS-EZ  0 - 2 bar
Fluorescein Merck Life Science NV MFCD00005050
Hot plate  Torrey Pines Scientific  HP61
Inverted microscope  Nikon Instruments  Eclipse Ti-E
Isopropanol Boom Labs BOOMSKEUZE3
LabVIEW (Software Version 20) Eindhoven University of Technology https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_
VERSION_1		 All files have been saved for LabVIEW version 20. It is advised to use this version or higher to open the files.
Luer stubs  Instech Laboratories, Inc.  LS23 23 ga, 0.5"
Male Luer to barb connectors  Cole Parmer  45505-32  3/32" ID
MasterFlex PTFE tubing Avator/VWR 48634
Microscope Slides VWR 470150-480
Microscope slides,  Plain Corning 2947-75X50
Mineral Oil Merck Millipore 330760-1L
mr DEV 600 Micro resist Technology R815100 Developer for negative photoresist
Oven Thermo Scientific  Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
Photomask CAD/Art Services, Inc.
Photomask Design Eindhoven University of Technology (Adapted from Merten Lab, EPFL) https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg
Pneumatic valve array FESTO 1x 8 valve array, Normally closed valves
Silicon Wafers Silicon Materials <1-0-0>, 100 mm diameter, 525 μm thickness
Single edge blades  GEM Scientific
Soft tubing Fluigent 1 mm ID, 3 mm OD
Spin coater  Laurell Technologies Corporation  WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope  Olympus Corporation  SZ61
SU-8 3050 Kayakli Advanced Materials Y311075 1000L1GL Negative photoresist
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow 1317318
Syringe B Braun Injekt - F Fine Dosage Syringe 10303002
UV-LED exposure system Idonus UV-EXP150S-SYS
Vacuum pump  Vacuumbrand GmbH  MD1C
Weighing scales  Sartorius  M-prove

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References

  1. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
  2. Terry, S. C., Herman, J. H., Angell, J. B. A gas chromatographic air analyzer fabricated on a Silicon wafer. IEEE Transactions on Electron Devices. 26 (12), 1880-1886 (1979).
  3. Mellors, J. S., Gorbounov, V., Ramsey, R. S., Ramsey, J. M. Fully integrated glass microfluidic device for performing high-efficiency capillary electrophoresis and electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 80 (18), 6881-6887 (2008).
  4. Wlodarczyk, K. L., Hand, D. P., Maroto-Valer, M. M. Maskless, rapid manufacturing of glass microfluidic devices using a picosecond pulsed laser. Sci Rep. 9 (1), 20215 (2019).
  5. Nielsen, J. B., et al. Microfluidics: innovations in materials and their fabrication and functionalization. Anal Chem. 92 (1), 150-168 (2020).
  6. Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
  7. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  8. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  9. Oh, K. W., Ahn, C. H. A review of microvalves. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (5), R13 (2006).
  10. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (2), 179-220 (2011).
  11. Jerman, H. Electrically-activated, normally-closed diaphragm valves. J. Micromech. Microeng. 4 (4), 210 (1994).
  12. Neagu, C. R., Gardeniers, J. G. E., Elwenspoek, M., Kelly, J. J. An electrochemical microactuator: principle and first results. J microelectromechanical sys. 5 (1), 2-9 (1996).
  13. Gu, W., Zhu, X., Futai, N., Cho, B. S., Takayama, S. Computerized microfluidic cell culture using elastomeric channels and Braille displays. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15861-15866 (2004).
  14. Studer, V., et al. Scaling properties of a low-actuation pressure microfluidic valve. J Appl Phys. 95 (1), 393-398 (2004).
  15. Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (40), 14431-14436 (2004).
  16. Ridgeway, W. K., Seitaridou, E., Phillips, R., Williamson, J. R. RNA-protein binding kinetics in an automated microfluidic reactor. Nucleic Acids Res. 37 (21), e142 (2009).
  17. Fu, A. Y., Chou, H. P., Spence, C., Arnold, F. H., Quake, S. R. An integrated microfabricated cell sorter. Anal Chem. 74 (11), 2451-2457 (2002).
  18. Liu, J., Enzelberger, M., Quake, S. A nanoliter rotary device for polymerase chain reaction. Electrophoresis. 23 (10), 1531-1536 (2002).
  19. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  20. Galas, J. C., Haghiri-Gosnet, A. M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab Chip. 13 (3), 415-423 (2013).
  21. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 15985-15990 (2013).
  22. Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synth Biol. 7 (12), 2879-2887 (2018).
  23. van der Linden, A. J., et al. A multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression. J Vis Exp. (152), 59655 (2019).
  24. Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. Emerging droplet microfluidics. Chem Rev. 117 (12), 7964-8040 (2017).
  25. Seemann, R., Brinkmann, M., Pfohl, T., Herminghaus, S. Droplet based microfluidics. Rep Prog Phys. 75, 016601 (2012).
  26. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  27. Clausell-Tormos, J., et al. Droplet-based microfluidic platforms for the encapsulation and screening of mammalian cells and multicellular organisms. Chem Biol. 15 (5), 427-437 (2008).
  28. Umbanhowar, P. B., Prasad, V., Weitz, D. A. Monodisperse emulsion generation via drop break off in a coflowing stream. Langmuir. 16 (2), 347-351 (2000).
  29. Abate, A. R., Thiele, J., Weitz, D. A. One-step formation of multiple emulsions in microfluidics. Lab Chip. 11 (2), 253-258 (2011).
  30. Chen, Y., Gao, W., Zhang, C., Zhao, Y. Three-dimensional splitting microfluidics. Lab Chip. 16 (8), 1332-1339 (2016).
  31. Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl Phys Lett. 88 (26), 264105 (2006).
  32. Fidalgo, L. M., Abell, C., Huck, W. T. S. Surface-induced droplet fusion in microfluidic devices. Lab Chip. 7 (8), 984-986 (2007).
  33. Bernath, K., et al. In vitro compartmentalization by double emulsions: Sorting and gene enrichment by fluorescence activated cell sorting. Anal Biochem. 325 (1), 151-157 (2004).
  34. Aharoni, A., Amitai, G., Bernath, K., Magdassi, S., Tawfik, D. S. High-throughput screening of enzyme libraries: thiolactonases evolved by fluorescence-activated sorting of single cells in emulsion compartments. Chem Biol. 12 (12), 1281-1289 (2005).
  35. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. S. Monodisperse uni- and multicompartment liposomes. J Am Chem Soc. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  36. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. S. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. J Am Chem Soc. 139 (2), 587-590 (2016).
  37. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  38. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  39. Shembekar, N., Chaipan, C., Utharala, R., Merten, C. A. Droplet-based microfluidics in drug discovery, transcriptomics and high-throughput molecular genetics. Lab Chip. 16 (8), 1314-1331 (2016).
  40. Wong, A. H., et al. Drug screening of cancer cell lines and human primary tumors using droplet microfluidics. Sci Rep. 7 (1), 9109 (2017).
  41. Jing, W., Han, H. Droplet microfluidics for high-resolution virology. Anal Chem. 94 (23), 8085-8100 (2022).
  42. Ding, Y., Choo, J., deMello, A. J. From single-molecule detection to next-generation sequencing: microfluidic droplets for high-throughput nucleic acid analysis. Microfluid Nanofluidics. 21 (3), 58 (2017).
  43. Nightingale, A. M., et al. A stable droplet reactor for high temperature nanocrystal synthesis. Lab Chip. 11 (7), 1221-1227 (2011).
  44. De Stefano, P., Bianchi, E., Dubini, G. The impact of microfluidics in high- throughput drug-screening applications. Biomicrofluidics. 16 (3), 031501 (2022).
  45. Tekin, E., et al. Prevalence and patterns of higher-order drug interactions in Escherichia coli. NPJ Syst Biol Appl. 4, 31 (2018).
  46. Eduati, F., et al. A microfluidics platform for combinatorial drug screening on cancer biopsies. Nat Commun. 9 (1), 2434 (2018).
  47. Utharala, R., et al. A microfluidic Braille valve platform for on-demand production, combinatorial screening and sorting of chemically distinct droplets. Nat Protoc. 17 (12), 2920-2965 (2022).
  48. Mathur, L., et al. Combi-seq for multiplexed transcriptome-based profiling of drug combinations using deterministic barcoding in single-cell droplets. Nat Commun. 13 (1), 4450 (2022).
  49. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription–translation for the prototyping of synthetic communication networks. Curr Opin Biotechnol. 58, 72-80 (2019).
  50. Kulesa, A., Kehe, J., Hurtado, J. E., Tawde, P., Blainey, P. C. Combinatorial drug discovery in nanoliter droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (26), 6685-6690 (2018).
  51. Tomasi, R. F. X., Sart, S., Champetier, T., Baroud, C. N. Individual control and quantification of 3D spheroids in a high-density microfluidic droplet array. Cell Rep. 31 (8), 107670 (2020).
  52. White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).
  53. Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
  54. Gonzalez-Suarez, A. M., Long, A., Huang, X. H., Revzin, A. A Compact control system to enable automated operation of microfluidic bioanalytical assays. Biosensors. 12 (12), 1160 (2022).
  55. Mathur, L., Ballinger, M., Utharala, R., Merten, C. A. Microfluidics as an enabling technology for personalized cancer therapy. Small. 16 (9), e1904321 (2020).

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Dispositivo microfluídico bicamada para produção de plugue combinatório
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Yelleswarapu, M., Spinthaki, S., de… More

Yelleswarapu, M., Spinthaki, S., de Greef, T. F. A., Eduati, F. Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production. J. Vis. Exp. (202), e66154, doi:10.3791/66154 (2023).

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