Summary
Se proporciona un protocolo paso a paso para la fabricación de rejillas de afinidad de estreptavidina para su uso en estudios estructurales de muestras macromoleculares desafiantes mediante criomicroscopía electrónica.
Abstract
Las rejillas de afinidad de estreptavidina proporcionan estrategias para superar muchos de los desafíos de preparación de muestras de criomicroscopía electrónica (crio-EM) que se encuentran con frecuencia, incluida la desnaturalización de la muestra y las orientaciones preferenciales que pueden ocurrir debido a la interfaz aire-agua. Sin embargo, las rejillas de afinidad de estreptavidina son utilizadas actualmente por pocos laboratorios de crio-EM porque no están disponibles comercialmente y requieren un proceso de fabricación cuidadoso. Los cristales bidimensionales de estreptavidina se cultivan en una monocapa lipídica biotinilada que se aplica directamente a las rejillas crio-EM de carbono perforado estándar. La interacción de alta afinidad entre la estreptavidina y la biotina permite la posterior unión de muestras biotiniladas que están protegidas de la interfaz aire-agua durante la preparación de muestras crio-EM. Además, estas rejillas proporcionan una estrategia para concentrar muestras disponibles en cantidades limitadas y purificar complejos proteicos de interés directamente en las rejillas. Aquí, se proporciona un protocolo optimizado paso a paso para la fabricación robusta de rejillas de afinidad de estreptavidina para su uso en experimentos de crio-EM y tinción negativa. Además, se incluye una guía de solución de problemas para los desafíos más experimentados para hacer que el uso de las rejillas de afinidad de estreptavidina sea más accesible para la comunidad crio-EM en general.
Introduction
La criomicroscopía electrónica (crio-EM) ha revolucionado el campo de la biología estructural al permitir la determinación de la estructura macromolecular de muestras grandes, flexibles y heterogéneas que antes eran inaccesibles mediante cristalografía de rayos X o resonanciamagnética nuclear. Este método funciona mediante la congelación instantánea de macromoléculas en solución para crear una fina capa de hielo vítreo que puede ser posteriormente fotografiada con un microscopio electrónico. En los últimos años, los avances significativos tanto en el hardware del microscopio como en el software de procesamiento de imágenes han ampliado aún más los tipos de muestras adecuadas para la determinación de estructuras de alta resolución mediante crio-EM.
Sin embargo, la preparación de muestras finas y vitrificadas sigue siendo uno de los pasos más críticos en la determinación de la estructura macromolecular mediante crio-EM. Las muestras biológicas suelen ser dinámicas, frágiles, propensas a la desnaturalización y, a veces, solo están disponibles en pequeñas cantidades para estudios crioelectromagnéticos. Durante el proceso de transferencia, estas partículas interactúan con la interfaz hidrofóbica aire-agua, lo que puede dar lugar a orientaciones preferidas por las partículas, desmontaje de complejos frágiles, desnaturalización parcial o completa de la muestra y agregación 2,3,4. El uso de detergentes u otros tensioactivos, la reticulación química y la adsorción de muestras para soportar capas son estrategias comunes para preservar muestras biológicas durante el proceso de congelación. Las capas de soporte como el óxido de grafeno 5,6,7 o el carbono amorfo8 también funcionan para concentrar partículas en la rejilla por adsorción cuando la muestra está disponible en cantidades limitadas. Sin embargo, estos métodos no son generales ni fiables, y la optimización de la preparación de la red puede llevar mucho tiempo o fallar por completo.
Las rejillas de afinidad de estreptavidina 9,10 se desarrollaron para superar estas deficiencias y proporcionar un método suave y de aplicación general para secuestrar el complejo de interés y protegerlo de la interfaz aire-agua. Estas rejillas utilizan una red cristalina de estreptavidina bidimensional (2D) que crece sobre una monocapa de lípidos biotinilados en la rejilla. Después de que las muestras se biotinilan (a menudo de forma escasa y aleatoria, lo que significa una biotina por complejo en promedio), se pueden aplicar a la rejilla recubierta de estreptavidina. Debido a que la adsorción de muestras se basa en la afinidad extremadamente alta entre la estreptavidina y la biotina, se pueden usar concentraciones de muestra tan bajas como 10 nM con estas rejillas. Los kits de biotinilación disponibles en el mercado para proteínas y cebadores biotinilados para complejos que contienen ADN hacen que sea relativamente fácil unir los restos de biotina necesarios a la mayoría de las muestras de interés. Además de concentrar la muestra y mantenerla alejada de la dañina interfaz aire-agua durante el blot, la biotinilación aleatoria de uno o pocos residuos de lisina puede mejorar significativamente el rango de orientaciones de la molécula de interés en la rejilla crio-EM, como se ha demostrado en varios estudios11. Si bien la señal del cristal de estreptavidina subyacente está presente en las imágenes sin procesar, los esquemas de procesamiento de datos que involucran la filtración de Fourier de las reflexiones nítidas de Bragg del cristal pueden eliminarse fácilmente durante el procesamiento temprano de los datos, lo que en última instancia permite reconstrucciones de alta resolución de la muestra de interés 11,12,13. Aquí, se proporciona un protocolo optimizado, paso a paso, para la producción robusta de rejillas de afinidad de estreptavidina y su posterior uso en experimentos de crio-EM. Se espera que el protocolo proporcionado se complete en un período de 2 semanas (Figura 1A). Las primeras partes del protocolo describen la preparación de los reactivos, el pretratamiento de las rejillas y los primeros pasos de evaporación del carbono. A continuación, se describen las instrucciones para la preparación de la monocapa lipídica y el crecimiento de cristales de estreptavidina en las rejillas EM. Además, se proporcionan instrucciones para el uso de rejillas de afinidad de estreptavidina en experimentos de EM de tinción negativa y crio-EM. Por último, se proporcionan procedimientos para eliminar la señal de estreptavidina de las micrografías una vez que se han adquirido los datos de crio-EM.
Protocol
1. Preparación de reactivos
- Diluir la estreptavidina comprada comercialmente hasta una concentración final de 0,5 mg/ml en tampón de cristalización (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% de trehalosa). Asegúrese de que la concentración final de trehalosa sea del 10%. Congelar rápidamente alícuotas de 25-50 μL en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.
- Disolver la sal sódica de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) en disolvente 65:35:8 v/v/v cloroformo/metanol/agua para obtener una concentración final de lípidos de 1 mg/ml. Almacenar alícuotas de un solo uso de 20-30 μL a -80 °C en viales de vidrio.
NOTA: La preparación del disolvente es más precisa si se realiza por peso. En primer lugar, combine 1,85 g de agua ultrapura con 6,41 g de metanol de grado de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y agréguelo a 22,42 g de cloroformo para preparar el disolvente.
PRECAUCIÓN: Lea y comprenda las hojas de datos de seguridad del fabricante y las instrucciones recomendadas para el manejo y eliminación de solventes orgánicos de cloroformo y metanol antes de comenzar este protocolo. Evite el contacto directo del metanol con la piel.
2. Pretratamiento de rejillas
- Lave la lámina de carbón en rejillas de malla dorada sumergiéndola dos veces en cloroformo al 100% y una vez en etanol al 100%. Coloque las rejillas sobre papel de filtro limpio para que se sequen. Repita el proceso de lavado durante un total de tres ciclos.
NOTA: Se ha logrado un éxito reproducible con rejillas de lámina de carbono disponibles comercialmente que tienen una película de carbono de 10-12 nm de espesor (consulte la lista de materiales) con tamaños de orificio que oscilan entre 0,6 y 2 μm. También se han utilizado con éxito rejillas de lámina de oro disponibles en el mercado y rejillas caseras de carbono agujereado preparadas siguiendo el protocolo de nanofabricación del Laboratorio Rubinstein14 . Se han obtenido resultados menos reproducibles con rejillas disponibles comercialmente que tienen películas de carbono más delgadas. No utilice rejillas de cobre, ya que el cobre reacciona con las aminas orgánicas que pueda haber en la muestra. - Después de que las rejillas se sequen, evapore una capa de carbono de 2,5-5 nm de espesor en el lado de carbono de las rejillas de carbono agujereadas. El espesor del carbono se controla con la medición del espesor de la película de cristal de cuarzo que está incorporada en el evaporador de carbono proporcionado en el archivo de la Tabla de Materiales .
- Deje que el carbón recién evaporado envejezca (es decir, se vuelva más hidrofóbico) durante 1 semana.
3. Preparación de la red de estreptavidina
NOTA: Para cultivar cristales de estreptavidina 2D en las rejillas EM de carbono agujereado, primero se aplica una monocapa lipídica biotinilada a los orificios de la película de carbono (Figura 1B) mediante transferencia de Langmuir-Schaefer. La monocapa lipídica se forma siguiendo los pasos siguientes (Figura 2). Los polvos de talco crean un límite entre el aceite de ricino y la placa de Petri, y una fina capa de aceite de ricino ayuda a mantener una presión superficial constante cuando se forma la monocapa lipídica. El lado que contiene el carbono evaporado del paso 2.2 se usa para recoger la monocapa, el exceso de lípidos se lava con tampón de cristalización y la solución de estreptavidina se incuba en la rejilla para la cristalización.
- Limpie el área del banco con etanol al 70%.
- Enjuague una jeringa de vidrio de 5 μL varias veces con cloroformo para limpiarla. Deje que la jeringa se seque completamente antes de usarla.
- Vuelva a lavar las rejillas evaporadas con carbón, es decir, justo antes de su uso, sumergiéndolas en etanol al 100%. Deje que las rejillas se sequen en papel de filtro limpio.
- Mientras se secan las rejillas, lave cada pinza anticapilar con 100% cloroformo y 100% etanol. Deja que las pinzas se sequen por completo.
- En el lado limpio del parafilm, prepare tres gotas de 50 μL de tampón de cristalización (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% de trehalosa) para cada rejilla que se hará.
- Llene la tapa de una placa de Petri sin recubrimiento de 35 mm con tampón de cristalización (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% de trehalosa). Limpie la superficie con papel para lentes.
- Espolvorea polvos de talco de grado científico alrededor del perímetro de la placa de Petri. Posteriormente, esto sirve como indicador, en el siguiente paso, de hasta dónde se ha extendido el aceite de ricino. Agregue suficientes polvos de talco para crear una barrera que proteja el aceite de ricino de tocar el borde de la placa de Petri. Agregar demasiados polvos de talco limita el espacio disponible para hacer la monocapa lipídica.
- Sumerja una punta de pipeta de 200 μL en el aceite de ricino para obtener una gota de tamaño mediano (aproximadamente 20 μL) que cuelga de la punta de la pipeta. Toque esta gota con la superficie del tampón en la placa de Petri, donde se extenderá para formar una película uniforme. La película delgada de aceite resultante sirve como un pistón15, que mantiene una presión superficial constante cuando se forma una monocapa lipídica (paso 3.10).
NOTA: Es importante agregar suficiente aceite de ricino en lugar de muy poco, y es mejor agregar como una sola gota. Deje que el aceite de ricino se extienda completamente antes de hacer la monocapa de lípidos. - Enjuague la jeringa de vidrio de 5 μL una o dos veces con el lípido disuelto antes de tomar una alícuota para su uso. Evite crear burbujas de aire en el lípido que llena la jeringa.
NOTA: La jeringa de vidrio se enjuaga con lípidos disueltos en caso de que quede algún residuo de cloroformo del paso 3.2. El cloroformo residual puede afectar a la calidad de la monocapa resultante. - Dispense el volumen más pequeño posible (~0,5 μL) de lípidos de la jeringa y toque suavemente la gota colgante con la superficie de la película de aceite de ricino. Tenga en cuenta que la solución lipídica atraviesa la película de aceite de ricino en el punto de contacto y que la monocapa lipídica resultante forma un círculo en el centro de la película delgada de aceite de ricino.
- Agregue varias gotas de lípido secuencialmente o agregue más lípido después de hacer algunas cuadrículas, pero si se agrega demasiado, el lípido se extenderá más allá del límite del aceite de ricino y hacia el perímetro donde se han secuestrado los polvos de talco y cualquier tensioactivo contaminante. Si esto ocurre, será necesario reiniciar el proceso.
- Tome una rejilla con una pinza anticapilar de modo que el brazo recto de la pinza y el lado de la rejilla con carbono evaporado miren hacia la monocapa.
- Transfiera parte de la monocapa al carbono agujereado tocando el lado evaporado de carbono de la rejilla a la monocapa durante 1-2 s.
NOTA: La transferencia exitosa se indica cuando la superficie de la rejilla se vuelve hidrófila, lo que hace que una tapa delgada y esférica de tampón cubra toda la rejilla después de que se haya levantado de la placa de Petri. - Toque la tapa esférica del tampón que ahora se adhiere a la rejilla, secuencialmente durante 1 s cada una, con las tres gotas de 50 μL de tampón de cristalización que se prepararon en parafilm en el paso 3.5.
NOTA: Este paso trata de eliminar tanto como sea posible el exceso de lípidos, que cubre la superficie de la tapa esférica (en lugar de la película de carbono anteriormente hidrofóbica), para evitar la formación de vesículas lipídicas cuando las muestras se observan en el microscopio electrónico. - Agregue con cuidado 4 μL de 0,5 mg/ml de estreptavidina en la tapa esférica restante de tampón de cristalización en la rejilla.
- Coloque la rejilla en una cámara de humedad. Repita los pasos 3.11-3.14 para todo el lote de cuadrículas.
- Incubar las rejillas a temperatura ambiente (RT) durante 2 h dentro de una cámara de humedad para evitar la evaporación.
NOTA: Es importante que el lado dorado de la rejilla no se moje en ningún momento después de que se haya aplicado la monocapa. - Después de las 2 h de incubación, prepare una gota de 300 μL de tampón de enjuague (10 mM de HEPES, pH 7,5, 50 mM de KCl, 5 mM de EDTA, 10% de trehalosa) para cada rejilla en el lado limpio del parafilm.
NOTA: El tampón de enjuague contiene 50 mM de KCl en lugar de 150 mM de KCl, que se encuentra en el tampón de cristalización utilizado para los pasos 3.5-3.6. - Lave el exceso de estreptavidina (no unida) colocando la rejilla sobre la gota de 300 μL de tampón de enjuague. Realice los pasos 3.18-3.20 para una cuadrícula a la vez. Evite dejar las rejillas en la gota de tampón de enjuague de 300 μL durante períodos prolongados de tiempo.
NOTA: Solo se realiza un lavado porque el cristal/monocapa de estreptavidina es frágil en este punto. Cada vez que se levanta una rejilla de la superficie de una gota de tampón de lavado, se rompe el puente líquido entre la rejilla y la gota de lavado. En el momento de la ruptura, se aplica un gradiente de presión transitoria (presión de succión) a los cristales monocapa autoportantes que atraviesan los orificios abiertos de la película de carbono. Se espera que esta presión de succión provoque una formación transitoria del cristal monocapa, acompañada de una expansión del área cubierta por los cristales. Si el aumento en el área excede el límite elástico del cristal, el cristal puede fracturarse o desordenarse. - Seque inmediatamente las pinzas anticapilares con una toallita sin pelusa para facilitar la liberación de la rejilla sobre el papel de filtro en el siguiente paso. Recoja la rejilla que flota en la gota de tampón de enjuague pegando el brazo retorcido de la pinza anticapilar en la gota.
- Seca suavemente el exceso de tampón desde el costado con papel de filtro. Coloque la rejilla sobre papel de filtro con el lado dorado hacia abajo, repita los pasos 3.18-3.20 para cada rejilla y deje que las rejillas se sequen durante 15-20 minutos.
- Después de que las rejillas estén secas, dales la vuelta para que el lado dorado quede hacia arriba. Evapore una capa delgada de carbono (de aproximadamente 0,5-2 nm de espesor) en el lado dorado de las rejillas.
NOTA: Almacene las rejillas a una humedad constante, cuyo valor no parece importar, teniendo en cuenta que se espera que múltiples cambios en la humedad relativa den lugar a ciclos de expansión y contracción. Deje que las rejillas envejezcan durante 1 semana antes de usar crio-EM para obtener mejores resultados, ya que la hidrofobicidad de la parte posterior de la rejilla puede ser importante para la estabilidad de la monocapa. Las rejillas son estables durante largos períodos de tiempo, pero después de 3 meses, el carbono de la parte posterior puede volverse menos hidrofóbico.
4. Comprobación de la calidad del lote de la rejilla de afinidad de la estreptavidina mediante una tinción negativa
- Prepare dos gotas de 50 μL y una gota de 100 μL de tampón de muestra (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) en el lado limpio del parafilm.
- Retire las rejillas de trehalosa y rehidrate la estreptavidina tocando las dos gotas de 50 μL y deje que la rejilla flote sobre la gota de 100 μL de tampón de muestra durante 10 min.
NOTA: Es mejor evitar el uso de detergente durante la rehidratación y las posteriores incubaciones de unión de muestras. El tampón se dispersará hacia el lado dorado de las rejillas y limitará la eficiencia de los lavados para eliminar el exceso de muestras. - Después de rehidratar, levante la rejilla con una pinza anticapilar para que el brazo retorcido de la pinza anticapilar quede en la caída.
- Seque suavemente el exceso de tampón del lado y vuelva a aplicar rápidamente 4 μL de muestra de 75-100 nM (opcional).
NOTA: Evite dejar que la rejilla se seque después de la rehidratación. - Incubar la muestra en una cámara de humedad durante 1-5 min.
NOTA: Los tiempos de concentración e incubación dependerán de la muestra y deben optimizarse. La concentración de la muestra y el tiempo de incubación proporcionados son puntos de partida sugeridos. - En el lado limpio de la parapelícula, coloque cuatro gotas de 30 μL de tampón de muestra y tinción de formiato de uranilo (UF) al 1%.
NOTA: Lea y comprenda las hojas de datos de seguridad del fabricante y las instrucciones recomendadas para el manejo y la eliminación del formiato de uranilo antes de realizar este paso. El formiato de uranilo es un compuesto tóxico y radiactivo. Asegúrese de obtener la aprobación institucional previa para el uso de material radiactivo. - Lave la muestra no consolidada tocando cada una de las cuatro gotas de tampón de muestra.
- Tiñir la muestra utilizando los procedimientos estándar de tinción negativa con UF. Seca suavemente la mancha de UF desde el costado, dejando una capa muy gruesa de tinte en la rejilla. Se pueden aplicar 0,5 μL adicionales de tinte a la rejilla después de la transferencia para hacer que la mancha sea más gruesa si es necesario. Deja que la rejilla se seque al aire.
NOTA: Dado que las rejillas de estreptavidina son muy hidrófilas, la tinción negativa tiende a formar una película muy uniforme en todas partes, al contrario de lo que se ve comúnmente cuando se utilizan rejillas de carbón continuas tratadas con descarga incandescente. Como resultado, se recomienda dejar una película más gruesa de solución de manchas.
5. Congelación de rejillas de afinidad de estreptavidina con muestras biotiniladas
NOTA: El siguiente procedimiento está diseñado para un émbolo automatizado de un solo lado que contiene un sensor de transferencia interno (también es posible el anotación manual de un lado en otros aparatos de inmersión automatizados)
- Prepare dos gotas de 50 μL y una gota de 100 μL de tampón de muestra (por ejemplo, 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) en el lado limpio del parafilm.
- Rehidrate las rejillas de estreptavidina tocando las dos gotas de 50 μL y deje que la rejilla flote sobre la gota de 100 μL de tampón de muestra durante 10 min.
- Después de rehidratar, levante la rejilla con una pinza anticapilar para que el brazo retorcido de la pinza anticapilar quede en la caída.
- Seque suavemente el exceso de tampón del lado y aplique rápidamente 4 μL de muestra de 75-100 nM.
- Incubar la muestra en una cámara de humedad durante 1-5 min.
NOTA: Una vez más, los tiempos de concentración e incubación dependerán de la muestra y deben optimizarse. La concentración de la muestra y el tiempo de incubación proporcionados son puntos de partida sugeridos. Para muestras a bajas concentraciones, se puede incubar durante períodos de tiempo más largos y/o unir la muestra a las rejillas varias veces. - Prepare dos gotas de 10 μL de tampón de congelación (por ejemplo, 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% de trehalosa, 0,01% NP40) en el lado limpio del parafilm. Después de la incubación, lave la muestra libre tocando la rejilla con la primera gota del tampón de congelación. Suelte la cuadrícula en la segunda gota del búfer de congelación.
- Agarre rápidamente el borde de la rejilla con las pinzas unidas al émbolo automático de un solo lado. Seque suavemente el exceso de tampón y aplique rápidamente 4 μL de tampón de congelación (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% de trehalosa, 0,01% NP40) a la rejilla.
- Coloque las pinzas en el émbolo automático de un solo lado. Los mejores resultados se han obtenido utilizando un sensor de transferencia que detecta la gota de líquido en la rejilla con tiempos de transferencia entre 4-6 s. Las condiciones variarán en función de la muestra y del tampón utilizado.
6. Procesamiento de datos de películas crio-EM recogidas a partir de rejillas de afinidad de estreptavidina
La recopilación de datos en las rejillas de afinidad de estreptavidina se puede realizar como con las rejillas estándar, y no es necesario realizar ajustes especiales en el microscopio. Sin embargo, el procedimiento detallado aquí elimina la señal de estreptavidina solo después de la corrección de movimiento de la micrografía. Por lo tanto, los pasos de procesamiento de datos, como el pulido de partículas, que se basan en fotogramas de película originales, no se pueden realizar de forma fiable. La sustracción de la señal de estreptavidina (necesaria para todo el procesamiento descendente estándar, excepto para la estimación de CTF) aquí requiere la versión R2014b o posterior de Matlab que se ejecuta en un entorno Linux. La sustracción de señales se basa en la naturaleza cristalina de la capa de estreptavidina, lo que permite el enmascaramiento de picos y, por lo tanto, la eliminación de señales de la transformada de Fourier de cada micrografía.
- Configuración de los scripts de procesamiento
- Copie todos los archivos de Archivos complementarios en una carpeta dedicada dentro del directorio del proyecto
- Prepare un directorio llamado processing_scripts que incluya los siguientes archivos:
lsub.m (Archivo de codificación suplementario 1; el script de resta)
process_subtration.sh (Archivo de codificación suplementario 2; script de contenedor que recorre en bucle todas las micrografías disponibles, genera trabajos paralelos y realiza un seguimiento de la entrada y la salida)
process_subtraction.cfg (Archivo de codificación suplementario 3; archivo de configuración que contiene los parámetros para el trabajo de resta, consulte 6.2) - Prepare un directorio llamado support_scripts que incluya los siguientes archivos:
bg_drill_hole.m (Archivo de codificación suplementario 4)
bg_FastSubtract_standard.m (Archivo de codificación suplementario 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (Archivo de codificación suplementario 6)
bg_push_by_rot.m (Archivo de codificación suplementario 7)
ReadMRC.m (Archivo de codificación suplementario 8)
WriteMRC.m (Archivo de codificación suplementario 9)
WriteMRCHeader.m (Archivo de codificación suplementario 10)
- Ajuste el archivo de configuración según sea necesario (process_subtraction.cfg, (consulte la Figura 3) según sea necesario:
- Entrada: Ruta al directorio que contiene las micrografías corregidas por movimiento en formato mrc. Utilice un directorio o un patrón que incluya comodines (?, *).
Ejemplo:
input="/ruta/a/project_directory/micrografías/"
o
input="/ruta/a/project_directory/micrografías/*.mrc" - output_dir: Ruta al directorio en el que se deben escribir las micrografías sustraídas en la red.
- only_do_unfinished: Especifique (verdadero|falso) si las micrografías sustractidas preexistentes deben sobrescribirse u omitirse. Este parámetro es útil para iniciar el script de resta de celosía en medio de una sesión de microscopio (por defecto: true).
- num_parallel_jobs: Especifique el número de trabajos paralelos. Este número depende de las especificaciones de hardware utilizadas para el procesamiento y no debe ser superior al número de núcleos disponibles. En sistemas con 32 núcleos y un sistema de archivos de red, se logró un rendimiento óptimo con 14 trabajos paralelos. Para obtener el mejor rendimiento, optimice este valor con un subconjunto de micrografías.
- Pad_Origin_X: 200 para un detector K3 en orientación vertical (anchura de la imagen < altura de la imagen) o cuando se utiliza un detector cuadrado (Falcon III, Falcon IV, K2), 1000 para un detector K3 en orientación horizontal (anchura de la imagen > altura de la imagen). FFT se realiza en cajas cuadradas y se requiere relleno si el detector tiene dimensiones no cuadradas.
- Pad_Origin_Y: 1000 para un detector K3 en orientación vertical (ancho < altura de la imagen), 200 cuando se utiliza un detector cuadrado (Falcon III, Falcon IV, K2) o si se utiliza un detector K3 en orientación horizontal (ancho de imagen > altura de imagen).
- No cambie el Inside_Radius_Ang (90) y el Outside_Radius_Ang (3.0). La resta de red se realiza entre dos resoluciones (la unidad está en angstrom).
- Pixel_Ang: Proporcione el tamaño de píxel como un valor de punto flotante.
- Umbral: Valor de corte del umbral de resta para reemplazar la red con el fondo en el espacio de Fourier. Los valores utilizados con éxito están entre 1,4 y 1,6. Utilice 1.42 como punto de partida.
- No cambie expand_pixel (10) y pad_out_opt (0). expand_pixel es un valor de diámetro que se utiliza para enmascarar alrededor de píxeles con valores superiores al límite de umbral. pad_out_opt es una opción que decide si se incluye un área acolchada en la salida.
- addpath_m: Ruta de acceso a los scripts de soporte.
- path_to_matlab_bin: Ruta al directorio bin de instalación de Matlab del sistema.
- path_matlab_script: Ruta de acceso al script de sustracción de matlab (lsub.m ) que se ha copiado anteriormente en el paso 6.1.2.
- Entrada: Ruta al directorio que contiene las micrografías corregidas por movimiento en formato mrc. Utilice un directorio o un patrón que incluya comodines (?, *).
- Después de guardar el script modificado, ejecute el script (bash ./process_subtraction.sh ) para restar la señal de estreptavidina de las micrografías de entrada. El script puede interrumpirse y/o reiniciarse si el parámetro only_do_unfinished se establece en true (véase en el paso 6.2.3). Si se produce un error, revise los parámetros especificados en el script bash. Asegúrese de que no haya espacios no deseados entre las variables de parámetro y sus valores asignados, ya que esta es una fuente común de errores.
- Utilice las imágenes sustraídas de celosía para el procesamiento de imágenes crio-EM estándar.
Representative Results
Después de la evaporación del carbono en el paso 3.21 (generalmente después de una semana), se pueden usar rejillas de afinidad de estreptavidina para la preparación de muestras crio-EM o de tinción negativa siguiendo los procedimientos descritos en los pasos 4 y 5. En la Figura 4A se muestra una micrografía representativa capturada con un detector K3 en un titán Krios a un aumento de 81.000X con un tamaño de píxel de 1,05 Å de una muestra biotinilada congelada con rejillas de afinidad de estreptavidina. La formación exitosa de la red se observa por el patrón de cuadrícula continua que aparece en el fondo de la imagen. Esto se puede observar más fácilmente por el patrón de difracción que aparece en la transformada rápida de Fourier (FFT) que se muestra en la Figura 4A (derecha). Después de la recolección de datos, siguiendo el procedimiento descrito en el paso 6 de este protocolo, la señal que es aportada a la imagen por la red de estreptavidina se puede enmascarar computacionalmente para producir una micrografía sustraída (Figura 4B) que se puede usar para los pasos posteriores de procesamiento de datos. La FFT de la Figura 4B (derecha) muestra que el patrón de difracción observado en la Figura 4A (derecha) se ha eliminado con éxito de la imagen original.
La figura 4C muestra un ejemplo de micrografía tomada con un microscopio Tecnai 12 a un aumento de 49.000x con un tamaño de píxel de 1,6 Å de una muestra biotinilada unida a rejillas de afinidad de estreptavidina y teñida negativamente con formiato de uranilo. Las rejillas se prepararon siguiendo el procedimiento descrito en el paso 4 de este protocolo, dejando una película de tinte más gruesa.
Hay varias observaciones comunes cuando el procedimiento de fabricación de la rejilla de estreptavidina no tiene éxito y que se describen con más detalle en la sección de discusión y en la Tabla 1. Figura 5 muestra varios ejemplos de estas observaciones. La figura 5A muestra una micrografía de una rejilla de afinidad de estreptavidina teñida negativamente utilizada a partir de un lote de más de seis meses de antigüedad. La monocapa se ha movilizado desde los agujeros en la lámina de carbono de las rejillas quantifoil y se observa con dimensiones similares a los agujeros de la rejilla. La Figura 5B muestra un ejemplo de cristales de estreptavidina que tienen una alta mosaicidad que se perturban fácilmente durante los procedimientos de preparación de muestras. La Figura 5C muestra una micrografía representativa de una cuadrícula de afinidad de estreptavidina en la que la evaporación de carbono en el paso 3.21 es demasiado delgada u omitida. La red de estreptavidina se ha fragmentado durante el proceso de preparación de la muestra crio-EM. La Figura 5D muestra una rejilla de afinidad de estreptavidina teñida negativamente que tiene contaminación de vesículas lipídicas, probablemente debido a lavados insuficientes durante el paso 3.13 o al lado dorado de la rejilla que se humedece durante los pasos 3.13-3.20. Consulte la sección de discusión y la Tabla 1 para conocer las estrategias para superar estos problemas comunes.
Figura 1: Esquema del procedimiento de fabricación de la rejilla de afinidad de la estreptavidina. (A) Cronología general del procedimiento de fabricación de la rejilla de afinidad de la estreptavidina. Todo el procedimiento se puede completar durante dos semanas, lo que requiere dos pasos de evaporación de carbono y una semana después de cada uno para permitir que el carbono envejezca lo suficiente. (B) Vista ampliada de un cuadrado de cuadrícula de una cuadrícula de afinidad de estreptavidina que muestra las capas que componen la cuadrícula después de completar el proceso de fabricación, incluida la cuadrícula crio-EM estándar con barras de oro y película de carbono agujereada, la primera capa de carbono evaporado, la monocapa lipídica, el cristal de estreptavidina 2D y la capa de soporte de carbono evaporado posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Monocapa lipídica y cristalización de estreptavidina (A) Imágenes que demuestran cómo formar con éxito la monocapa lipídica dentro de la pequeña placa de Petri utilizando polvos de talco para crear un límite para el aceite de ricino que crea una presión superficial constante mientras forma la monocapa lipídica. (B) Imágenes que demuestran cómo cultivar cristales de estreptavidina en rejillas crio-EM. Primero, el lado de carbono de las rejillas se toca con la monocapa lipídica y luego se realizan tres lavados consecutivos en el tampón de cristalización. Se añade estreptavidina y las rejillas se incuban en una cámara de humedad durante 2 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Parámetros de ejemplo para el archivo process_subtraction.cfg para realizar la sustracción de la red de estreptavidina a partir de micrografías (paso 6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de la fabricación exitosa de la rejilla de afinidad de la estreptavidina. (A) Micrografía crio-EM de complejos proteína/nucleosoma biotinilados preparados con rejillas de afinidad de estreptavidina caseras. La FFT se muestra a la derecha y muestra el patrón de difracción de cristales de estreptavidina. (B) Se muestra la misma micrografía que en el panel A siguiendo el procedimiento de sustracción de celosía para eliminar la señal del cristal de estreptavidina 2D de la imagen original. (C) Un ejemplo de una micrografía obtenida a partir de la tinción negativa de una muestra biotinilada unida a rejillas de afinidad por estreptavidina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos de la fabricación fallida de la rejilla de afinidad de la estreptavidina. (A) Micrografía que muestra la movilización de la monocapa de estreptavidina de los orificios de la rejilla cuando las rejillas tienen más de seis meses. (B) Micrografía que muestre redes de estreptavidina con alta mosaicidad que se dañan fácilmente durante los procedimientos de preparación de muestras crio-EM y de tinción negativa. (C) Micrografía que muestre la fragmentación de la red de estreptavidina durante la preparación de la muestra crio-EM cuando la capa de evaporación de carbono en el paso 3.21 es demasiado delgada o se omite. (D) Micrografía representativa que esté contaminada con vesículas lipídicas probablemente debido a un lavado insuficiente durante el paso 3.13 o al hecho de que el lado dorado de la rejilla se humedezca durante los pasos 3.13-3.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Guía de solución de problemas para superar los desafíos comúnmente experimentados que se encuentran durante la fabricación fallida de la rejilla de afinidad de la estreptavidina. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Archivo de codificación suplementario 9: WriteMRC.m Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 10: WriteMRCHeader.m Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Nuestro protocolo describe cómo hacer y utilizar las rejillas de afinidad de la estreptavidina y cómo procesar los datos que contienen la señal de difracción de la estreptavidina. Hay varios pasos críticos en el protocolo que requieren una atención especial.
Los lotes de cuadrícula fallidos se remontan a varios errores comunes. La fuente más común de error proviene del uso de reactivos obsoletos o de mala calidad. Es especialmente importante preparar la solución lipídica biotinilada exactamente como se describe en el protocolo. Además, cualquier impureza, como residuos de detergente en el material de laboratorio o aceites presentes de forma natural en la piel, puede afectar a la calidad de los cristales de estreptavidina y, por tanto, a la calidad de las imágenes resultantes. Por lo tanto, se recomienda realizar tres ciclos de lavado de las rejillas antes de la primera evaporación de carbón para eliminar la posible contaminación por tensioactivos del fabricante de la rejilla (paso 2.1). Además, se ha observado que la contaminación o impureza del aceite de ricino dificulta la formación de cristales en la rejilla.
Hacer y recoger la monocapa lipídica es una tarea que debe practicarse varias veces para tener una idea de los pequeños volúmenes de lípidos. No es inusual que este paso falle las primeras dos o tres veces antes de que se pueda producir una monocapa lipídica adecuada, como se refleja en última instancia en la calidad de los cristales de estreptavidina que se observan en las rejillas teñidas negativamente (Figura 4C).
Es importante no dejar nunca que la parte trasera (lado dorado, lado lipídico) de la rejilla se moje durante el proceso de fabricación de la rejilla (pasos 3.12-3.20). En el caso de que la parte trasera se moje, se recomienda desechar la rejilla. Esto puede dar lugar a la aparición de grandes vesículas lipídicas que alteran la calidad de la imagen (Figura 5D) (Fila 3, Tabla 1). También se pueden observar vesículas lipídicas debido a un lavado insuficiente después de aplicar la monocapa lipídica (paso 3.13). Se recomiendan tres lavados posteriores con tampón de cristalización después de tocar la monocapa lipídica antes de agregar estreptavidina.
Después de que una fina capa de carbono se haya evaporado en las rejillas incrustadas en trehalosa, la parte posterior de la rejilla se puede mojar sin dañar la calidad de la celosía. Por ejemplo, la humectación de la parte posterior se observa con frecuencia cuando el tampón de muestra contiene incluso cantidades mínimas de detergente. La humectación de la parte posterior por parte de la muestra puede dar lugar a una unión inespecífica de las muestras a la fina película de carbono de la parte posterior, lo que disminuye la eficacia de evitar que las partículas se difundan a la interfaz aire-agua o el uso de la unión por afinidad para las estrategias de purificación en la red. Si es posible, agregue la muestra a la cuadrícula en ausencia de detergente. El detergente y otros aditivos pueden añadirse posteriormente durante los pasos de lavado de la rejilla o añadirse en un paso final antes de la vitrificación. Esta es una limitación para el uso de rejillas de afinidad por estreptavidina; Sin embargo, si el objetivo es mejorar la orientación preferencial, la preparación de la muestra con tampones, incluido el detergente, se ha realizado con éxito11.
Una fuente común de error puede rastrearse a la edad de las rejillas en relación con ambos pasos de evaporación de carbono (paso 2.3 y paso 3.21). En este protocolo, el período de espera recomendado es de 5 a 7 días después de la evaporación del carbono en la parte posterior antes de usar rejillas de estreptavidina para crio-EM. Cuando las rejillas se utilizan demasiado pronto después de la fabricación, se ha observado que la red y la monocapa lipídica se movilizan fuera de los orificios de la rejilla. Se puede hacer una observación similar cuando las rejillas son demasiado viejas y se utilizan después de seis meses (Figura 5A) (Fila 1, Tabla 1). Nuestra hipótesis es que esta observación se explica por los cambios en la hidrofobicidad del soporte de carbono que se aplica para estabilizar la monocapa lipídica y los cristales de estreptavidina. Además, las redes de estreptavidina pueden aparecer en mosaico (Figura 5B) (Fila 3, Tabla 1) y rotas tanto en tinción negativa como en crio-EM si la monocapa se aplica a rejillas donde la primera capa de evaporación de carbono (paso 2.3) no ha envejecido lo suficiente.
Otra fuente común de error puede rastrearse en la fragilidad de la monocapa cristalina de estreptavidina (la monocapa lipídica es en sí misma fluida y puede expandirse o comprimirse reversiblemente). La evaporación de carbono en la parte posterior (paso 3.21) proporciona una estabilidad crítica tanto a la red monocapa como a la red de estreptavidina durante el proceso de adsorción de muestras, lavado y transferencia crio-EM. En ausencia de suficiente evaporación de carbono en la parte posterior de la rejilla, las redes de estreptavidina a menudo aparecerán fragmentadas después de la transferencia/congelación (Figura 5C) (Fila 2, Tabla 1). En este protocolo, sugerimos el uso de un congelador de inmersión automatizado de un solo lado para la transferencia de un solo lado. Este método produce condiciones de transferencia altamente reproducibles que preservan la red de estreptavidina durante el proceso de congelación y permiten una optimización optimizada de la aplicación de la muestra y los parámetros de transferencia. Alternativamente, se han utilizado otros aparatos automatizados de congelación por inmersión en combinación con la transferencia manual. Para hacer esto, la función de transferencia real está deshabilitada en la configuración del dispositivo y, en su lugar, la cuadrícula se seca alcanzando con un par de pinzas que sostienen papel secante a través de la entrada lateral. Este método puede lograr resultados de alta calidad para los laboratorios sin un dispositivo de transferencia y congelación por inmersión de un solo lado; Sin embargo, la reproducibilidad de red a red es un desafío.
Si bien el uso de rejillas de afinidad por estreptavidina tiene muchas ventajas, se deben tener en cuenta algunas limitaciones de este método. Debido a la naturaleza del procedimiento, por lo general no es posible evaluar la calidad de la red de estreptavidina hasta que se haya completado todo el proceso. Se sugiere examinar rápidamente la calidad de cada lote mediante una tinción negativa antes de congelar las muestras. Debido a la señal aportada por la red de estreptavidina a las imágenes en bruto, en algunos casos puede ser difícil evaluar, solo a partir de las imágenes, si hay un número suficiente de partículas intactas y dispersas. Por la misma razón, el procesamiento sobre la marcha de los datos de crio-EM durante la adquisición de datos no es posible a menos que el procedimiento de sustracción de la señal de estreptavidina se haya incluido en la canalización de preprocesamiento de datos. Debido a que la señal de estreptavidina generalmente se resta de las imágenes corregidas por movimiento y no de los fotogramas en sí, el pulido bayesiano, tal como se implementa en las suites de software populares, puede fallar cuando se utilizan los procedimientos de sustracción como se describe. Por lo tanto, se recomienda realizar la corrección de movimiento en varios parches para minimizar el movimiento de partículas desde el inicio del procesamiento de datos16.
A pesar de estas limitaciones, las rejillas de afinidad de estreptavidina ofrecen muchas ventajas. Dos de las principales ventajas que proporcionan las rejillas de afinidad de estreptavidina sobre las rejillas crio-EM estándar de agujero abierto son un medio para proteger las muestras de la interfaz aire-agua y concentrar muestras de baja abundancia (10-100 nM) en la rejilla. Otras capas de soporte, como el carbono y el óxido de grafeno, también se pueden utilizar como estrategias para superar estos cuellos de botella en la preparación de muestras. En un ejemplo, las rejillas de afinidad de estreptavidina fueron la única solución para obtener una reconstrucción intacta de una interacción proteína-ácido nucleico que era incompatible con los enfoques de reticulación. 12
Otra gran ventaja que proporcionan las rejillas de afinidad de estreptavidina es una solución a muestras que se adsorben a otras capas de soporte, como el carbono o el óxido de grafeno, con orientaciones preferidas que dificultan la capacidad de obtener una reconstrucción 3D de la muestra de interés. La biotinilación aleatoria de muestras utilizando kits disponibles en el mercado permite la unión aleatoria de la muestra de interés a la monocapa de estreptavidina para obtener más vistas potenciales para superar este desafío.
Además, las rejillas de afinidad de estreptavidina ofrecen ventajas que son exclusivas de las rejillas basadas en afinidad. La alta afinidad y especificidad de la interacción estreptavidina-biotina permite el acoplamiento de las rejillas de afinidad de estreptavidina con otros flujos de trabajo que involucran biotina para purificar complejos de interés. En un ejemplo publicado, los autores inmovilizaron un complejo en rejillas de afinidad de estreptavidina e incubaron un compañero de unión de estequiometría desconocida en gran exceso. Después de lavar cualquier proteína no unida, se obtuvo el supercomplejo correctamente ensamblado y se pudo analizar inmediatamente con crio-EM11. Una posible aplicación futura puede ser la combinación de marcadores de proteínas de unión a estreptavidina, el sistema Avi-tag o enfoques de marcaje de proximidad con rejillas de afinidad de estreptavidina para extraer proteínas individuales y/o complejos proteicos directamente de fuentes recombinantes o endógenas sin esquemas de purificación estándar elaborados.
Al proporcionar este protocolo, los laboratorios deberían ser capaces de reproducir fácilmente la fabricación de rejillas de afinidad de estreptavidina y establecerlas como una herramienta más utilizada para el análisis estructural de complejos proteicos mediante crio-EM.
Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
T.C. contó con el apoyo de la beca de capacitación en biofísica molecular GM-08295 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales y la beca de investigación de posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención DGE 2146752. R.G. y B.H. recibieron el apoyo de la subvención R21-GM135666 del Instituto Nacional de Salud otorgada a R.G. y B.H. Este trabajo fue parcialmente financiado a través de la subvención R35-GM127018 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales otorgada a E.N. E.N. es un investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
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