Summary
Kriyo-elektron mikroskobu ile zorlu makromoleküler numunelerin yapısal çalışmalarında kullanılmak üzere streptavidin afinite ızgaralarının üretilmesi için adım adım bir protokol sağlanmıştır.
Abstract
Streptavidin afinite ızgaraları, numune denatürasyonu ve hava-su arayüzü nedeniyle meydana gelebilecek tercihli yönelimler dahil olmak üzere, yaygın olarak karşılaşılan birçok kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) numune hazırlama zorluğunun üstesinden gelmek için stratejiler sağlar. Bununla birlikte, Streptavidin afinite ızgaraları şu anda birkaç kriyo-EM laboratuvarı tarafından kullanılmaktadır, çünkü ticari olarak mevcut değildirler ve dikkatli bir üretim süreci gerektirirler. İki boyutlu streptavidin kristalleri, doğrudan standart delikli karbon kriyo-EM ızgaralarına uygulanan biyotinillenmiş bir lipid tek tabakası üzerinde büyütülür. Streptavidin ve biyotin arasındaki yüksek afiniteli etkileşim, kriyo-EM numune hazırlama sırasında hava-su arayüzünden korunan biyotinillenmiş numunelerin daha sonra bağlanmasına izin verir. Ek olarak, bu ızgaralar, sınırlı miktarlarda bulunan numuneleri konsantre etmek ve ilgilenilen protein komplekslerini doğrudan ızgaralar üzerinde saflaştırmak için bir strateji sağlar. Burada, kriyo-EM ve negatif leke deneylerinde kullanılmak üzere streptavidin afinite ızgaralarının sağlam üretimi için adım adım, optimize edilmiş bir protokol sağlanmıştır. Ek olarak, streptavidin afinite ızgaralarının kullanımını daha büyük kriyo-EM topluluğu için daha erişilebilir hale getirmek için yaygın olarak karşılaşılan zorluklar için bir sorun giderme kılavuzu dahil edilmiştir.
Introduction
Elektron kriyo-mikroskobu (kriyo-EM), daha önce X-ışını kristalografisi veya nükleer manyetik rezonans1 ile erişilemeyen büyük, esnek ve heterojen numunelerin makromoleküler yapı tayinini sağlayarak yapısal biyoloji alanında devrim yaratmıştır. Bu yöntem, daha sonra bir elektron mikroskobu kullanılarak görüntülenebilen ince bir camsı buz tabakası oluşturmak için makromolekülleri çözelti içinde hızlı dondurarak çalışır. Son yıllarda, hem mikroskop donanımı hem de görüntü işleme yazılımındaki önemli gelişmeler, kriyo-EM ile yüksek çözünürlüklü yapı tayini için uygun numune türlerini daha da genişletmiştir.
Bununla birlikte, ince, vitrifiye numunelerin hazırlanması, kriyo-EM ile makromoleküler yapı tayininde en kritik adımlardan biri olmaya devam etmektedir. Biyolojik numuneler genellikle dinamiktir, kırılgandır, denatürasyona eğilimlidir ve bazen kriyo-EM çalışmaları için sadece küçük miktarlarda bulunur. Lekeleme işlemi sırasında, bu parçacıklar hidrofobik hava-su arayüzü ile etkileşime girer, bu da parçacık tarafından tercih edilen oryantasyonlara, kırılgan komplekslerin sökülmesine, kısmi veya tam numune denatürasyonuna ve agregasyonaneden olabilir 2,3,4. Deterjanların veya diğer yüzey aktif maddelerin kullanımı, kimyasal çapraz bağlama ve katmanları desteklemek için numunelerin adsorpsiyonu, dondurma işlemi sırasında biyolojik numuneleri korumak için yaygın stratejilerdir. Grafen oksit 5,6,7 veya amorf karbon8 gibi destek katmanları, numune sınırlı miktarlarda mevcut olduğunda, partikülleri adsorpsiyon yoluyla ızgara üzerinde konsantre etme işlevi de görür. Bununla birlikte, bu yöntemler genel veya güvenilir değildir ve şebeke hazırlığının optimizasyonu son derece zaman alıcı olabilir veya tamamen başarısız olabilir.
Streptavidin afinite ızgaraları 9,10, bu eksikliklerin üstesinden gelmek ve ilgilenilen kompleksi tecrit etmek ve onu hava-su arayüzünden korumak için hafif ve genel olarak uygulanabilir bir yöntem sağlamak için geliştirilmiştir. Bu ızgaralar, ızgara üzerinde tek bir biyotinillenmiş lipit tabakası üzerinde büyütülen iki boyutlu (2D) bir streptavidin kristal kafesi kullanır. Numunelerin kendileri biyotinillendikten sonra (genellikle seyrek ve rastgele, ortalama olarak kompleks başına bir biyotin anlamına gelir), streptavidin kaplı ızgaraya uygulanabilirler. Numune adsorpsiyonu, streptavidin ve biotin arasındaki son derece yüksek afiniteye dayandığından, bu ızgaralarla 10 nM kadar düşük numune konsantrasyonları kullanılabilir. Proteinler için ticari olarak temin edilebilen biyotinilasyon kitleri ve DNA içeren kompleksler için biyotinillenmiş primerler, ilgilenilen çoğu örneğe gerekli biyotin kısımlarının eklenmesini nispeten kolaylaştırır. Numuneyi konsantre etmenin ve lekeleme sırasında zararlı hava-su arayüzünden uzak tutmanın yanı sıra, bir veya sadece birkaç lizin kalıntısının rastgele biyotinilasyonu, bir dizi çalışmada gösterildiği gibi, kriyo-EM ızgarası üzerindeki ilgilenilen molekülün oryantasyon aralığını önemli ölçüde iyileştirebilir11. Altta yatan streptavidin kristalinden gelen sinyal ham görüntülerde mevcut olsa da, kristalden gelen keskin Bragg yansımalarının Fourier filtrasyonunu içeren veri işleme şemaları, erken veri işleme sırasında kolayca çıkarılabilir ve sonuçta ilgilenilen numunenin yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonlarını mümkün kılar 11,12,13. Burada, streptavidin afinite ızgaralarının sağlam üretimi ve daha sonra kriyo-EM deneylerinde kullanılması için optimize edilmiş, adım adım bir protokol sağlanmıştır. Sağlanan protokolün 2 haftalık bir süre içinde tamamlanması beklenmektedir (Şekil 1A). Protokolün ilk bölümleri, reaktiflerin hazırlanmasını, ızgaraların ön işlemini ve ilk karbon buharlaştırma adımlarını açıklar. Daha sonra, lipid tek tabakasının hazırlanması ve EM ızgaralarında streptavidin kristallerinin büyümesi için talimatlar açıklanmaktadır. Ek olarak, negatif leke EM ve kriyo-EM deneylerinde streptavidin afinite ızgaralarının kullanımı için talimatlar verilmiştir. Son olarak, kriyo-EM verileri elde edildikten sonra streptavidin sinyalinin mikrograflardan çıkarılması için prosedürler sağlanmıştır.
Protocol
1. Reaktiflerin hazırlanması
- Ticari olarak satın alınan streptavidini kristalizasyon tamponunda (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA,% 10 trehaloz) 0.5 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Son trehaloz konsantrasyonunun% 10 olduğundan emin olun. 25-50 μL'lik alikotları sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve -80 °C'de saklayın.
- 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(biyotinil) sodyum tuzunu 65:35:8 v/v/v kloroform/metanol/su çözücü içinde 1 mg/mL'lik bir nihai lipit konsantrasyonu için çözün. 20-30 μL'lik tek kullanımlık alikotları -80 °C'de cam şişelerde saklayın.
NOT: Çözücünün hazırlanması ağırlıkça yapılırsa daha doğrudur. İlk olarak, 1.85 g ultra saf suyu 6.41 g yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sınıfı metanol ile birleştirin ve çözücüyü hazırlamak için bunu 22.42 g kloroforma ekleyin.
DİKKAT: Bu protokole başlamadan önce lütfen üreticilerin güvenlik bilgi formlarını ve kloroform ve metanol organik çözücülerin taşınması ve atılması için önerilen talimatları okuyun ve anlayın. Metanolün cilt ile doğrudan temasından kaçının.
2. Izgaraların ön işlemi
- Karbon folyoyu iki kez% 100 kloroforma ve bir kez% 100 etanole batırarak altın örgü ızgaralarda yıkayın. Izgaraları kuruması için temiz filtre kağıdına yerleştirin. Yıkama işlemini toplam üç döngü boyunca tekrarlayın.
NOT: 0,6-2 μm arasında değişen delik boyutlarına sahip 10-12 nm kalınlığında karbondan bir karbon filme (malzeme listesine bakın) sahip ticari olarak temin edilebilen karbon folyo ızgaralarla tekrarlanabilir başarı elde edilmiştir. Rubinstein Laboratuvarı'nın nanofabrikasyon protokolü14'e göre hazırlanan ticari olarak temin edilebilen altın folyo ızgaralar ve ev yapımı delikli karbon ızgaralar da başarıyla kullanılmıştır. Daha ince karbon filmlere sahip ticari olarak temin edilebilen ızgaralarla daha az tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmiştir. Bakır, numunede bulunabilecek herhangi bir organik aminle reaksiyona girdiğinden bakır ızgaralar kullanmayın. - Izgaralar kuruduktan sonra, delikli karbon ızgaraların karbon tarafına 2.5-5 nm kalınlığında bir karbon tabakası buharlaştırın. Karbon kalınlığı, Malzeme Tablosu dosyasında sağlanan karbon buharlaştırıcıya yerleştirilmiş kuvars kristal film kalınlığı ölçümü ile kontrol edilir.
- Yeni buharlaşan karbonun 1 hafta boyunca yaşlanmasına (yani daha hidrofobik olmasına) izin verin.
3. Streptavidin kafesinin hazırlanması
NOT: Deley-karbon EM ızgaraları üzerinde 2D streptavidin kristalleri yetiştirmek için, önce Langmuir-Schaefer transferi ile karbon filmin deliklerine (Şekil 1B) biyotinillenmiş bir lipid tek tabakası uygulanır. Lipid tek tabakası, sonraki adımları takiben oluşturulur (Şekil 2). Talk pudrası, hint yağı ile Petri kabı arasında bir sınır oluşturur ve ince bir hint yağı tabakası, lipit tek tabakası oluştuğunda sabit yüzey basıncının korunmasına yardımcı olur. Adım 2.2'den buharlaştırılmış karbonu içeren taraf, tek tabakayı almak için kullanılır, fazla lipitler kristalizasyon tamponu ile yıkanır ve streptavidin çözeltisi kristalizasyon için ızgara üzerinde inkübe edilir.
- Tezgah alanını %70 etanol ile temizleyin.
- Temizlemek için 5 μL'lik bir cam şırıngayı kloroform ile birkaç kez durulayın. Kullanmadan önce şırınganın tamamen kurumasını bekleyin.
- Karbonla buharlaştırılmış ızgaraları tekrar, yani kullanımdan hemen önce %100 etanole batırarak yıkayın. Izgaraları temiz filtre kağıdı üzerinde kurumaya bırakın.
- Izgaralar kururken, her bir kılcal cımbızı %100 kloroform ve %100 etanol ile yıkayın. Cımbızın tamamen kurumasını bekleyin.
- Parafilmin temiz tarafında, yapılacak her ızgara için üç adet 50 μL damla kristalizasyon tamponu (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, %10 trehaloz) hazırlayın.
- 35 mm'lik kaplamasız Petri kabının kapağını kristalizasyon tamponu (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, %10 trehaloz) ile doldurun. Yüzeyi lens kağıdı ile temizleyin.
- Petri kabının çevresine bilimsel düzeyde talk pudrası serpin. Bu daha sonra, bir sonraki adımda, hint yağının ne kadar yayıldığının bir göstergesi olarak hizmet eder. Hint yağının Petri kabının kenarına temas etmesini önleyen bir bariyer oluşturmak için yeterince talk pudrası ekleyin. Çok fazla talk pudrası eklemek, lipit tek tabakasını oluşturmak için mevcut alanı sınırlar.
- Pipet ucundan sarkan orta büyüklükte bir damla (yaklaşık 20 μL) elde etmek için 200 μL'lik bir pipet ucunu hint yağına batırın. Bu damlayı Petri kabındaki tamponun yüzeyine dokundurun, burada düzgün bir film oluşturmak için yayılacaktır. Elde edilen ince yağ filmi, bir lipit tek tabakası oluştuğunda sabit bir yüzey basıncını koruyan bir piston15 görevi görür (adım 3.10).
NOT: Çok az değil, yeterli miktarda hint yağı eklemek önemlidir ve tek bir damla olarak eklemek daha iyidir. Lipid tek tabakasını yapmadan önce hint yağının tamamen yayılmasına izin verin. - Kullanmak için bir alikot almadan önce 5 μL'lik cam şırıngayı çözünmüş lipid ile bir veya iki kez durulayın. Şırıngayı dolduran lipitte hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
NOT: Cam şırınga, adım 3.2'den itibaren herhangi bir kloroform kalıntısı kalması durumunda çözünmüş lipid ile durulanır. Artık kloroform, elde edilen tek tabakanın kalitesini etkileyebilir. - Şırıngadan mümkün olan en küçük hacmi (~ 0.5 μL) lipit dağıtın ve asılı damlacığı hint yağı filminin yüzeyine hafifçe dokundurun. Lipid çözeltisinin temas noktasında hint yağı filmini kırdığına ve ortaya çıkan lipid tek tabakasının ince hint yağı filminin merkezinde bir daire oluşturduğuna dikkat edin.
- Sırayla birkaç damla lipit ekleyin veya bazı ızgaralar yaptıktan sonra daha fazla lipit ekleyin, ancak çok fazla eklenirse, lipit hint yağının sınırını geçecek ve talk pudrası ve herhangi bir kirletici yüzey aktif maddenin tutulduğu çevreye yayılacaktır. Böyle bir durumda, işlemin yeniden başlatılması gerekir.
- Kılcal cımbız önleyici bir cımbızla bir ızgara alın, böylece cımbızın düz kolu ve ızgaranın karbonla buharlaşan tarafı tek katmana bakar.
- Izgaranın karbonla buharlaşan tarafına 1-2 saniye boyunca tek katmana dokundurarak tek katmanın bir kısmını delikli karbona aktarın.
NOT: Başarılı aktarım, ızgaranın yüzeyinin hidrofilik hale gelmesiyle gösterilir ve Petri kabından kaldırıldıktan sonra ince, küresel bir tampon kapağının tüm ızgarayı kaplamasına neden olur. - Şimdi ızgaraya yapışan tamponun küresel kapağına, her biri 1 saniye boyunca, adım 3.5'te parafilm üzerinde hazırlanan üç adet 50 μL damla kristalizasyon tamponuna dokunun.
NOT: Bu adım, numuneler elektron mikroskobunda görüntülendiğinde lipid veziküllerinin oluşumunu önlemek için küresel başlığın yüzeyini (eski hidrofobik karbon filmi yerine) kaplayan fazla lipidi mümkün olduğunca çıkarmaya çalışır. - Izgarada kalan küresel kristalizasyon tamponu kapağına dikkatlice 4 μL 0.5 mg / mL streptavidin ekleyin.
- Izgarayı bir nem odasına yerleştirin. Tüm ızgara grubu için 3.11-3.14 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Buharlaşmayı önlemek için ızgaraları oda sıcaklığında (RT) bir nem odası içinde 2 saat inkübe edin.
NOT: Izgaranın altın tarafının, tek katman uygulandıktan sonra herhangi bir noktada ıslanmaması önemlidir. - 2 saatlik inkübasyondan sonra, parafilmin temiz tarafındaki her ızgara için 300 μL'lik bir damla durulama tamponu (10 mM HEPES, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, %10 trehaloz) hazırlayın.
NOT: Durulama tamponu, 3.5-3.6 adımları için kullanılan kristalizasyon tamponunda bulunan 150 mM KCl yerine 50 mM KCl içerir. - Izgarayı 300 μL'lik durulama tamponuna yerleştirerek fazla (bağlanmamış) streptavidini yıkayın. Bir kerede bir ızgara için 3.18-3.20 adımlarını gerçekleştirin. Izgaraları 300 μL durulama tamponu damlasında uzun süre bırakmaktan kaçının.
NOT: Streptavidin kristali/tek tabakası bu noktada kırılgan olduğu için sadece bir yıkama yapılır. Bir ızgara, bir damla yıkama tamponunun yüzeyinden her kaldırıldığında, ızgara ile yıkama damlası arasındaki sıvı köprü yırtılır. Kopma anında, karbon filmin açık deliklerini kaplayan kendinden destekli tek katmanlı kristallere geçici bir basınç gradyanı (emme basıncı) uygulanır. Bu emme basıncının, kristallerin kapladığı alanın genişlemesiyle birlikte tek tabakalı kristalin geçici kubbesine neden olması beklenir. Alandaki artış kristalin elastik sınırını aşarsa, kristal kırılabilir veya düzensiz hale gelebilir. - Bir sonraki adımda ızgaranın filtre kağıdına bırakılmasını kolaylaştırmak için kılcal cımbızları tüy bırakmayan bir bezle hemen kurulayın. Kılcal cımbızın bükülmüş kolunu damlaya sokarak durulama tamponu damlası üzerinde yüzen ızgarayı alın.
- Fazla tamponu filtre kağıdıyla yandan nazikçe kurulayın. Izgarayı altın tarafı aşağı bakacak şekilde filtre kağıdına yerleştirin, her ızgara için 3.18-3.20 adımlarını tekrarlayın ve ızgaraların 15-20 dakika kurumasını bekleyin.
- Izgaralar kuruduktan sonra, altın tarafı yukarı bakacak şekilde ters çevirin. İnce bir karbon tabakasını (yaklaşık 0.5-2 nm kalınlığında) ızgaraların altın tarafına buharlaştırın.
NOT: Izgaraları, değeri önemli görünmeyen sabit bir nemde saklayın, bağıl nemdeki birden fazla değişikliğin genleşme ve büzülme döngülerine neden olmasının beklendiğine dikkat edin. En iyi sonuçlar için cryo-EM kullanımından önce ızgaraların 1 hafta yaşlanmasına izin verin çünkü ızgaranın arka tarafının hidrofobikliği tek katmanlı stabilite için önemli olabilir. Izgaralar uzun süre stabildir, ancak 3 ay sonra arka taraftaki karbon daha az hidrofobik hale gelebilir.
4. Streptavidin afinite ızgarası parti kalitesinin negatif leke ile kontrol edilmesi
- Parafilmin temiz tarafında iki damla 50 μL ve bir damla 100 μL numune tamponu (50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP) hazırlayın.
- İki 50 μL'lik damlaya dokunarak trehalozu çıkarın ve streptavidin ızgaralarını rehidre edin ve ızgarayı 100 μL'lik numune tamponu damlası üzerinde 10 dakika yüzdürün.
NOT: Rehidrasyon ve müteakip numune bağlama inkübasyonları sırasında deterjan kullanmaktan kaçınmak en iyisidir. Tampon, ızgaraların altın tarafına dağılacak ve fazla numuneleri çıkarmak için yıkamaların verimliliğini sınırlayacaktır. - Yeniden sulandırdıktan sonra, kılcal cımbızın bükülmüş kolu damlada olacak şekilde ızgarayı kılcal bir cımbızla alın.
- Fazla tamponu yandan nazikçe kurulayın ve 4 μL 75-100 nM numuneyi (isteğe bağlı) hızla yeniden uygulayın.
NOT: Rehidrasyondan sonra ızgaranın kurumasına izin vermeyin. - Numuneyi bir nem odasında 1-5 dakika inkübe edin.
NOT: Konsantrasyon ve inkübasyon süreleri numuneye bağlı olacaktır ve optimize edilmelidir. Sağlanan numune konsantrasyonu ve inkübasyon süresi önerilen başlangıç noktalarıdır. - Parafilmin temiz tarafında, her biri 30 μL'lik dört damla hem numune tamponu hem de %1 uranil format (UF) boyası ayarlayın.
NOT: Bu adımı gerçekleştirmeden önce lütfen üreticilerin güvenlik veri sayfalarını ve uranil formatın taşınması ve atılması için önerilen talimatları okuyun ve anlayın. Uranil format toksik ve radyoaktif bir bileşiktir. Radyoaktif malzeme kullanımı için önceden kurumsal onay aldığınızdan emin olun. - Bağlanmamış numuneyi, dört damla numune tamponunun her birine dokunarak yıkayın.
- UF ile standart negatif boyama prosedürlerini kullanarak numuneyi boyayın. UF lekesini yandan nazikçe kurulayın ve ızgara üzerinde çok kalın bir leke tabakası bırakın. Gerekirse lekeyi kalınlaştırmak için lekelemeden sonra ızgaraya ek 0,5 μL leke uygulanabilir. Izgaranın kurumasını bekleyin.
NOT: Streptavidin ızgaraları çok hidrofilik olduğundan, negatif leke, kızdırma deşarjı ile işlenmiş, sürekli karbon ızgaraları kullanıldığında yaygın olarak görülenin aksine, her yerde çok düzgün bir film oluşturma eğilimindedir. Sonuç olarak, daha kalın bir leke çözeltisi filmi bırakılması önerilir.
5. Streptavidin afinite ızgaralarının biyotinillenmiş örneklerle dondurulması
NOT: Aşağıdaki prosedür, dahili bir lekeleme sensörü içeren tek taraflı otomatik bir piston için tasarlanmıştır (diğer otomatik dalma aparatlarında tek taraflı manuel lekeleme de mümkündür)
- Parafilmin temiz tarafında iki damla 50 μL ve bir damla 100 μL numune tamponu hazırlayın (örneğin, 50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP).
- İki 50 μL'lik damlaya dokunarak streptavidin ızgaralarını rehidre edin ve ızgaranın 100 μL'lik numune tamponu damlası üzerinde 10 dakika boyunca yüzmesine izin verin.
- Yeniden sulandırdıktan sonra, kılcal cımbızın bükülmüş kolu damlada olacak şekilde ızgarayı kılcal bir cımbızla alın.
- Fazla tamponu kenardan nazikçe kurulayın ve hızlı bir şekilde 4 μL 75-100 nM numune uygulayın.
- Numuneyi bir nem odasında 1-5 dakika inkübe edin.
NOT: Yine, konsantrasyon ve inkübasyon süreleri numuneye bağlı olacaktır ve optimize edilmelidir. Sağlanan numune konsantrasyonu ve inkübasyon süresi önerilen başlangıç noktalarıdır. Düşük konsantrasyonlardaki numuneler için, daha uzun süreler boyunca inkübe edilebilir ve/veya numune ızgaralara birkaç kez bağlanabilir. - Parafilmin temiz tarafında iki adet 10 μL damla dondurma tamponu (örneğin, 50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP, %3 trehaloz, %0.01 NP40) hazırlayın. İnkübasyondan sonra, bağlanmamış numuneyi ızgaraya donma tamponunun ilk damlasına dokunarak yıkayın. Izgarayı dondurma tamponunun ikinci damlasına bırakın.
- Tek taraflı otomatik pistona takılı cımbızla ızgaranın kenarını hızla kavrayın. Fazla tamponu nazikçe kurulayın ve ızgaraya hızlı bir şekilde 4 μL dondurma tamponu (50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP, %3 trehaloz, %0.01 NP40) uygulayın.
- Cımbızı tek taraflı otomatik pistona takın. En iyi sonuçlar, 4-6 s arasındaki leke süreleriyle ızgaradaki sıvı damlasını algılayan bir leke sensörü kullanılarak elde edilmiştir. Koşullar, kullanılan numuneye ve tampona bağlı olarak değişecektir.
6. Streptavidin afinite ızgaralarından toplanan kriyo-EM filmlerinin veri işlemesi
Streptavidin afinite ızgaraları üzerinde veri toplama, standart ızgaralarda olduğu gibi gerçekleştirilebilir ve özel mikroskop ayarlamalarına gerek yoktur. Bununla birlikte, burada ayrıntılı olarak açıklanan prosedür, streptavidin sinyalini yalnızca mikrografın hareket düzeltmesinden sonra kaldırır. Bu nedenle, orijinal film karelerine dayanan parçacık parlatma gibi veri işleme adımları güvenilir bir şekilde gerçekleştirilemez. Buradaki streptavidin sinyal çıkarma (CTF tahmini hariç tüm standart aşağı akış işlemleri için gereklidir), bir Linux ortamında çalışan Matlab sürüm R2014b veya daha yenisini gerektirir. Sinyal çıkarma, streptavidin tabakasının kristal doğasına dayanır, bu da tepe maskelemesine ve dolayısıyla her mikrografın Fourier dönüşümünden sinyal çıkarılmasına izin verir.
- İşleme komut dosyalarını ayarlama
- Ek Dosyalar'daki tüm dosyaları proje dizini içindeki özel bir klasöre kopyalayın
- Aşağıdaki dosyaları içeren processing_scripts adlı bir dizin hazırlayın:
lsub.m (Ek Kodlama Dosyası 1; çıkarma komut dosyası)
process_subtration.sh (Ek Kodlama Dosyası 2; mevcut tüm mikrograflar üzerinde döngü yapan, paralel işler ortaya çıkaran ve giriş ve çıktıyı izleyen sarmalayıcı komut dosyası)
process_subtraction.cfg (Ek Kodlama Dosyası 3; çıkarma işinin parametrelerini içeren yapılandırma dosyası, bkz. 6.2) - Aşağıdaki dosyaları içeren support_scripts adlı bir dizin hazırlayın:
bg_drill_hole.m (Ek Kodlama Dosyası 4)
bg_FastSubtract_standard.m (Ek Kodlama Dosyası 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (Ek Kodlama Dosyası 6)
bg_push_by_rot.m (Ek Kodlama Dosyası 7)
ReadMRC.m (Ek Kodlama Dosyası 8)
WriteMRC.m (Ek Kodlama Dosyası 9)
WriteMRCHeader.m (Ek Kodlama Dosyası 10)
- Yapılandırma dosyasını gerektiği gibi ayarlayın (process_subtraction.cfg, ( bkz. Şekil 3):
- Giriş: mrc formatında hareket düzeltmeli mikrografları içeren dizinin yolu. Joker karakterler (?, *) içeren bir dizin veya desen kullanın.
Örnek:
input="/path/to/project_directory/micrographs/"
veya
input="/path/to/project_directory/micrographs/*.mrc" - output_dir: Kafes çıkarılan mikrografların yazılması gereken dizinin yolu.
- only_do_unfinished: Önceden var olan çıkarılmış mikrografların üzerine yazılması veya atlanması gerekip gerekmediğini belirtin (doğru|yanlış). Bu parametre, bir mikroskop oturumunun ortasında kafes çıkarma komut dosyasını başlatmak için kullanışlıdır (varsayılan: true).
- num_parallel_jobs: Paralel işlerin sayısını belirtin. Bu sayı, işleme için kullanılan donanım özelliklerine bağlıdır ve mevcut çekirdek sayısından daha yüksek olmamalıdır. 32 çekirdeğe ve bir ağ dosya sistemine sahip sistemlerde, 14 paralel işle optimum performans elde edildi. En iyi performans için, bu değeri bir mikrograf alt kümesiyle optimize edin.
- Pad_Origin_X: Dikey yönde (görüntü genişliği < görüntü yüksekliği) veya kare dedektör kullanırken (Falcon III, Falcon IV, K2) K200, yatay yönde (görüntü genişliği > görüntü yüksekliği) bir K3 dedektörü için 1000. FFT kare kutularda gerçekleştirilir ve dedektörün kare olmayan boyutları varsa dolgu gereklidir.
- Pad_Origin_Y: Dikey yönde (görüntü genişliği < görüntü yüksekliği) bir K3 dedektörü için 1000, kare dedektör (Falcon III, Falcon IV, K2) veya yatay yönde (görüntü genişliği > görüntü yüksekliği) bir K3 dedektörü kullanıldığında 200.
- Inside_Radius_Ang (90) ve Outside_Radius_Ang (3.0) değiştirmeyin. Kafes çıkarma işlemi iki çözünürlük arasında gerçekleştirilir (birim angstrom cinsindendir).
- Pixel_Ang: Piksel boyutunu kayan nokta değeri olarak sağlayın.
- Eşik: Fourier uzayında kafesi arka planla değiştirmek için çıkarma eşiği kesme değeri. Başarıyla kullanılan değerler 1.4-1.6 arasındadır. Başlangıç noktası olarak 1.42'yi kullanın.
- (10) ve pad_out_opt (0) expand_pixel değiştirmeyin. expand_pixel, eşik sınırından daha yüksek değerlere sahip piksellerin etrafını maskelemek için kullanılan bir çap değeridir. pad_out_opt, yastıklı bir alanın çıktıya dahil edilip edilmeyeceğine karar veren bir seçenektir.
- addpath_m: Destek betiklerinin yolu.
- path_to_matlab_bin: Sistemin Matlab kurulum bin dizininin yolu.
- path_matlab_script: Yukarıda 6.1.2 adımında kopyalanan matlab çıkarma betiğine (lsub.m) giden yol.
- Giriş: mrc formatında hareket düzeltmeli mikrografları içeren dizinin yolu. Joker karakterler (?, *) içeren bir dizin veya desen kullanın.
- Değiştirilen komut dosyasını kaydettikten sonra, streptavidin sinyalini giriş mikrograflarından çıkarmak için komut dosyasını (bash ./process_subtraction.sh ) çalıştırın. only_do_unfinished parametresi true olarak ayarlanırsa komut dosyası kesintiye uğratılabilir ve/veya yeniden başlatılabilir (bkz. adım 6.2.3). Bir hata oluşursa, bash betiğinde belirtilen parametreleri gözden geçirin. Parametre değişkenleri ile atanmış değerleri arasında istenmeyen boşluklar olmadığından emin olun, çünkü bu yaygın bir hata kaynağıdır.
- Standart cryo-EM görüntü işleme için kafes çıkarılmış görüntüleri kullanın.
Representative Results
Adım 3.21'deki karbon buharlaşmasından sonra (genellikle bir hafta sonra), streptavidin afinite ızgaraları, adım 4 ve 5'te açıklanan prosedürleri izleyerek kriyo-EM veya negatif leke numunesi hazırlama için kullanılabilir. Streptavidin afinite ızgaraları ile donmuş biyotinillenmiş bir numunenin 1.05 şpiksel boyutuna sahip 81.000X büyütmede bir titan Krios üzerinde bir K3 dedektörü kullanılarak yakalanan temsili bir mikrograf Şekil 4A'da gösterilmektedir. Başarılı kafes oluşumu, görüntünün arka planında görünen sürekli ızgara deseni ile gözlemlenir. Bu, Şekil 4A'da (sağda) gösterilen hızlı Fourier dönüşümünde (FFT) görünen kırınım modeli ile daha kolay gözlemlenebilir. Veri toplandıktan sonra, bu protokolün 6. adımında özetlenen prosedürü izleyerek, streptavidin kafesi tarafından görüntüye katkıda bulunan sinyal, sonraki veri işleme adımları için kullanılabilecek çıkarılmış bir mikrograf (Şekil 4B) üretmek için hesaplamalı olarak maskelenebilir. Şekil 4B'deki (sağda) FFT, Şekil 4A'da (sağda) gözlemlenen kırınım modelinin orijinal görüntüden başarıyla kaldırıldığını göstermektedir.
Şekil 4C , streptavidin afinite ızgaralarına bağlı ve uranil format kullanılarak negatif olarak boyanmış biyotinillenmiş bir numunenin 1.6 şpiksel boyutuna sahip 49.000x büyütmede bir Tecnai 12 mikroskobunda alınan örnek bir mikrografı göstermektedir. Izgaralar, bu protokolün 4. adımında belirtilen prosedür izlenerek hazırlandı ve daha kalın bir leke filmi bırakıldı.
Streptavidin ızgara üretim prosedürü başarısız olduğunda, tartışma bölümünde ve Tablo 1'de daha ayrıntılı olarak açıklanan birkaç yaygın gözlem vardır . Şekil 5 bu gözlemlerin birkaç örneğini göstermektedir. Şekil 5A , altı aydan daha eski bir partiden kullanılan negatif lekeli bir streptavidin afinite ızgarasının bir mikrografını göstermektedir. Tek tabaka, kuantifon ızgaraların karbon folyosundaki deliklerden hareketlenmiştir ve ızgaradaki deliklere benzer boyutlarda gözlenir. Şekil 5B , numune hazırlama prosedürleri sırasında kolayca bozulan yüksek mozaikliğe sahip streptavidin kristallerinin bir örneğini göstermektedir. Şekil 5C , adım 3.21'deki karbon buharlaşmasının çok ince olduğu veya ihmal edildiği bir streptavidin afinite ızgarasından temsili bir mikrografı göstermektedir. Streptavidin kafesi, kriyo-EM numune hazırlama işlemi sırasında parçalanmıştır. Şekil 5D , muhtemelen adım 3.13 sırasında yetersiz yıkama veya ızgaranın altın tarafının 3.13-3.20 adımlarında ıslanması nedeniyle lipid veziküllerinden kontaminasyona sahip negatif lekeli bir streptavidin afinite ızgarasını göstermektedir. Bu yaygın sorunların üstesinden gelmeye yönelik stratejiler için lütfen tartışma bölümüne ve Tablo 1'e bakın.
Şekil 1: Streptavidin afinite ızgarası üretim prosedürünün şeması. (A) Streptavidin afinite ızgarası üretim prosedürünün genel bakış zaman çizelgesi. Tüm prosedür, karbonun yeterince yaşlanmasına izin vermek için iki karbon buharlaştırma adımı ve her birinden bir hafta sonra iki hafta boyunca tamamlanabilir. (B) Altın külçeler ve delikli karbon filmli standart kriyo-EM ızgarası, ilk buharlaştırılmış karbon tabakası, lipid tek tabakası, 2D-streptavidin kristali ve arka taraf buharlaştırılmış karbon destek tabakası dahil olmak üzere, imalat sürecinin tamamlanmasından sonra ızgarayı oluşturan katmanları gösteren bir streptavidin afinite ızgarasının ızgara karesi görünümünde yakınlaştırılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lipid tek tabakası ve streptavidin kristalizasyonu (A) Lipid tek tabakasını oluştururken sabit yüzey basıncı oluşturan hint yağı için bir sınır oluşturmak için talk pudrası kullanan küçük Petri kabı içinde lipid tek tabakasının nasıl başarılı bir şekilde oluşturulacağını gösteren resimler. (B) Streptavidin kristallerinin kriyo-EM ızgaralarında nasıl büyütüleceğini gösteren resimler. İlk olarak, ızgaraların karbon tarafı lipit tek tabakasına dokundurulur ve ardından kristalizasyon tamponunda art arda üç yıkama yapılır. Streptavidin eklenir ve ızgaralar 2 saat boyunca bir nem odasında inkübe edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikrograflardan streptavidin kafes çıkarma işlemini gerçekleştirmek için process_subtraction.cfg dosyası için örnek parametreler (adım 6). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Başarılı streptavidin afinite ızgarası üretiminin temsili sonuçları. (A) Ev yapımı streptavidin afinite ızgaraları ile hazırlanan biyotinillenmiş protein / nükleozom komplekslerinin Cryo-EM mikrografı. FFT sağda gösterilmiştir ve streptavidin kristal kırınım modelini gösterir. (B) Panel A'dakiyle aynı mikrograf, orijinal görüntüden 2D streptavidin kristalinden gelen sinyali çıkarmak için kafes çıkarma prosedürünü takiben gösterilir. (C) Streptavidin afinite ızgaralarına bağlı biyotinillenmiş bir numunenin negatif boyanmasından elde edilen bir mikrograf örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Başarısız streptavidin afinite ızgarası imalatının temsili sonuçları. (A) Izgaralar altı aydan eski olduğunda streptavidin tek tabakasının ızgara deliklerinden mobilizasyonunu gösteren mikrograf. (B) Hem kriyo-EM hem de negatif leke numune hazırlama prosedürleri sırasında kolayca zarar gören yüksek mozaikliğe sahip streptavidin kafeslerini gösteren mikrograf. (C) Adım 3.21'deki karbon buharlaşma tabakası çok ince olduğunda veya ihmal edildiğinde, kriyo-EM numune hazırlama sırasında streptavidin kafesinin parçalanmasını gösteren mikrograf. (D) Adım 3.13 sırasında yetersiz yıkama veya adım 3.13-3.20 sırasında ızgaranın altın tarafının ıslanması nedeniyle lipid vezikülleri ile kontamine olmuş temsili mikrograf. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Başarısız streptavidin afinite ızgarası üretimi sırasında karşılaşılan yaygın olarak karşılaşılan zorlukların üstesinden gelmek için sorun giderme kılavuzu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 1: lsub.m Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 2: process_subtration.sh Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 3: process_subtraction.cfg Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 4: bg_drill_hole.m Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 5: bg_FastSubtract_standard.m Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 7: bg_push_by_rot.m Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 8: ReadMRC.m Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 9: WriteMRC.m Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 10: WriteMRCHeader.m Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Protokolümüz, streptavidin afinite ızgaralarının nasıl yapılacağını ve kullanılacağını ve streptavidin kırınım sinyalini içeren verilerin nasıl işleneceğini açıklar. Protokolde özel dikkat gerektiren birkaç kritik adım vardır.
Başarısız ızgara grupları, birkaç yaygın hataya kadar izlenebilir. En yaygın hata kaynağı, eski veya düşük kaliteli reaktiflerin kullanılmasından kaynaklanmaktadır. Biyotinillenmiş lipid çözeltisinin tam olarak protokolde tarif edildiği gibi hazırlanması özellikle önemlidir. Ayrıca, laboratuvar gereçleri üzerindeki deterjan kalıntısı veya ciltte doğal olarak bulunan yağlar gibi herhangi bir kirlilik, streptavidin kristallerinin kalitesini ve dolayısıyla ortaya çıkan görüntülerin kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, ızgara üreticisinden olası yüzey aktif madde kontaminasyonunu gidermek için ilk karbon buharlaştırmadan önce ızgaralar için üç yıkama döngüsü gerçekleştirilmesi önerilir (adım 2.1). Ek olarak, hint yağının kirlenmesinin veya safsızlığının ızgarada kristal oluşumunu engellediği gözlemlenmiştir.
Lipid tek tabakasını yapmak ve almak, küçük lipid hacimleri hakkında bir fikir edinmek için birkaç kez uygulanması gereken bir görevdir. Bu adımın, negatif lekeli ızgaralarda görülen streptavidin kristallerinin kalitesine yansıdığı gibi, yeterli bir lipit tek tabakası üretilmeden önce ilk iki veya üç kez başarısız olması alışılmadık bir durum değildir (Şekil 4C).
Izgara üretim işlemi sırasında ızgaranın arka tarafının (altın tarafı, lipid tarafı) ıslanmasına asla izin vermemek önemlidir (adım 3.12-3.20). Arka tarafın ıslanması durumunda, ızgaranın atılması önerilir. Bu, görüntü kalitesini bozan büyük lipid veziküllerinin ortaya çıkmasına neden olabilir (Şekil 5D) (Satır 3, Tablo 1). Lipid tek tabakası uygulandıktan sonra yetersiz yıkama nedeniyle lipit vezikülleri de gözlenebilir (adım 3.13). Streptavidin eklenmeden önce lipid tek tabakasına dokunduktan sonra kristalizasyon tamponu kullanılarak üç müteakip yıkama önerilir.
İnce bir karbon tabakası trehaloz gömülü ızgaralar üzerinde buharlaştırıldıktan sonra, ızgaranın arka tarafı kafes kalitesine zarar vermeden ıslanabilir. Örneğin, numune tamponu minimum miktarda deterjan içerdiğinde arka tarafın ıslanması sıklıkla gözlenir. Arka tarafın numune tarafından ıslatılması, numunelerin arka taraftaki ince karbon filme spesifik olmayan bağlanmasına neden olabilir, bu da partiküllerin hava-su arayüzüne yayılmasını önlemenin etkinliğini veya şebeke üzerinde saflaştırma stratejileri için afinite bağlamasının kullanımını azaltır. Mümkünse, deterjan yokluğunda numuneyi ızgaraya ekleyin. Deterjan ve diğer katkı maddeleri daha sonra ızgara yıkama adımları sırasında eklenebilir veya vitrifikasyondan önceki son adımda eklenebilir. Bu, streptavidin afinite ızgaralarının kullanımına ilişkin bir sınırlamadır; Bununla birlikte, amaç tercihli yönelimi iyileştirmekse, deterjan da dahil olmak üzere tamponlarla numune hazırlama başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir11.
Yaygın bir hata kaynağı, her iki karbon buharlaşma adımına göre ızgaraların yaşına kadar izlenebilir (adım 2.3 ve adım 3.21). Bu protokolde, kriyo-EM için streptavidin ızgaraları kullanılmadan önce önerilen bekleme süresi, arka taraftaki karbon buharlaşmasından sonra 5-7 gündür. İmalattan çok kısa bir süre sonra ızgaralar kullanıldığında, kafes ve lipid tek tabakasının ızgara deliklerinden dışarı hareket ettiği gözlemlenmiştir. Benzer bir gözlem, ızgaralar çok eski olduğunda ve altı ay sonra kullanıldığında yapılabilir (Şekil 5A) (Satır 1, Tablo 1). Bu gözlemin, lipid tek tabakasını ve streptavidin kristallerini stabilize etmek için uygulanan karbon desteğinin hidrofobikliğindeki değişikliklerle açıklandığını varsayıyoruz. Ek olarak, streptavidin kafesleri mozaik görünebilir (Şekil 5B) (Satır 3, Tablo 1) ve tek tabaka ilk karbon buharlaşma tabakasının (adım 2.3) yeterince yaşlanmadığı ızgaralara uygulanırsa hem negatif leke hem de kriyo-EM'de kırılabilir.
Ek bir yaygın hata kaynağı, streptavidin kristalinin tek tabakasının kırılganlığına kadar izlenebilir (lipid tek tabakasının kendisi sıvıdır ve geri dönüşümlü olarak genişleyebilir veya sıkışabilir). Arka taraftaki karbon buharlaşması (adım 3.21), numune adsorpsiyonu, yıkama ve kriyo-EM lekeleme işlemi sırasında hem tek tabaka hem de streptavidin kafesi için kritik stabilite sağlar. Izgaranın arka tarafında yeterli karbon buharlaşmasının olmaması durumunda, streptavidin kafesleri genellikle lekelenme/donma işleminden sonra parçalanmış görünecektir (Şekil 5C) (Satır 2, Tablo 1). Bu protokolde, tek taraflı lekeleme için tek taraflı otomatik dalma dondurucu kullanılmasını öneriyoruz. Bu yöntem, dondurma işlemi sırasında streptavidin kafesini koruyan ve numune uygulamasının ve lekeleme parametrelerinin kolaylaştırılmış optimizasyonuna izin veren, yüksek oranda tekrarlanabilir lekeleme koşulları sağlar. Alternatif olarak, manuel lekeleme ile birlikte diğer otomatik daldırmalı dondurma aparatları kullanılmıştır. Bunu yapmak için, cihaz ayarlarında gerçek lekeleme işlevi devre dışı bırakılır ve bunun yerine ızgara, yan girişten kurutma kağıdı tutan bir cımbızla ulaşılarak lekelenir. Bu yöntem, tek taraflı lekeleme ve daldırmalı dondurma cihazı olmayan laboratuvarlar için yüksek kaliteli sonuçlar elde edebilir; Bununla birlikte, şebekeden şebekeye tekrarlanabilirlik zordur.
Streptavidin afinite ızgaralarının kullanılması birçok avantaja sahip olsa da, bu yöntemin bazı sınırlamalarının dikkate alınması gerekir. Prosedürün doğası gereği, tüm süreç tamamlanana kadar streptavidin kafesinin kalitesini değerlendirmek genellikle mümkün değildir. Numuneleri dondurmadan önce her partinin kalitesinin negatif leke ile hızlı bir şekilde taranması önerilir. Streptavidin kafesinin ham görüntülere katkıda bulunduğu sinyal nedeniyle, bazı durumlarda, yalnızca görüntülerden, yeterli sayıda bozulmamış, dağılmış parçacık olup olmadığını değerlendirmek zor olabilir. Aynı nedenden ötürü, veri toplama sırasında kriyo-EM verilerinin anında işlenmesi, streptavidin sinyal çıkarma prosedürü veri ön işleme hattına dahil edilmedikçe mümkün değildir. Streptavidin sinyali genellikle çerçevelerin kendisinden değil, hareket düzeltmeli görüntülerden çıkarıldığından, popüler yazılım paketlerinde uygulandığı gibi Bayes parlatma, açıklandığı gibi çıkarma prosedürleri kullanılırken başarısız olabilir. Bu nedenle, veri işlemenin başlangıcından itibaren parçacık hareketini en aza indirmek için birden fazla yamada hareket düzeltmesi yapılması önerilir16.
Bu sınırlamalara rağmen, streptavidin afinite ızgaraları birçok avantaj sunar. Streptavidin afinite ızgaralarının standart açık delikli kriyo-EM ızgaralarına göre sağladığı iki büyük avantaj, numuneleri hava-su arayüzünden korumak ve düşük bolluktaki (10-100 nM) numuneleri ızgara üzerinde konsantre etmek için bir araçtır. Karbon ve grafen oksit gibi diğer destek katmanları da bu numune hazırlama darboğazlarının üstesinden gelmek için stratejiler olarak kullanılabilir. Bir örnekte, streptavidin afinite ızgaraları, çapraz bağlama yaklaşımlarıyla uyumsuz olan bir protein-nükleik asit etkileşiminin bozulmamış bir yeniden inşasını elde etmek için tek çözümdü. 12
Streptavidin afinite ızgaralarının sağladığı bir diğer önemli avantaj, karbon veya grafen oksit gibi diğer destek katmanlarına adsorbe olan numunelere, ilgilenilen numunenin 3D rekonstrüksiyonunu elde etme yeteneğini engelleyen tercih edilen oryantasyonlara sahip bir çözümdür. Ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak numunelerin rastgele biyotinilasyonu, bu zorluğun üstesinden gelmek için daha fazla potansiyel görünüm elde etmek için ilgilenilen numunenin streptavidin tek tabakasına rastgele bağlanmasına izin verir.
Ek olarak, streptavidin afinite ızgaraları, afinite tabanlı ızgaralara özgü avantajlar sunar. Streptavidin-biyotin etkileşiminin yüksek afinitesi ve özgüllüğü, ilgilenilen kompleksleri saflaştırmak için streptavidin afinite ızgaralarının biyotin içeren diğer iş akışlarıyla birleştirilmesine izin verir. Yayınlanmış bir örnekte, yazarlar streptavidin afinite ızgaraları üzerinde bir kompleksi hareketsiz hale getirdiler ve bilinmeyen stokiyometrinin bağlayıcı bir partnerini büyük ölçüde inkübe ettiler. Herhangi bir bağlanmamış proteini yıkadıktan sonra, doğru şekilde bir araya getirilmiş süper kompleks elde edildi ve hemen cryo-EM11 ile analiz edilebildi. Gelecekteki olası bir uygulama, streptavidin bağlayıcı protein etiketlerini, Avi-tag sistemini veya yakınlık etiketleme yaklaşımlarını, standart ayrıntılı saflaştırma şemaları olmadan doğrudan rekombinant veya endojen kaynaklardan tek proteinleri ve / veya protein komplekslerini çıkarmak için streptavidin afinite ızgaraları ile birleştirmek olabilir.
Bu protokolü sağlayarak, laboratuvarlar streptavidin afinite ızgaralarının imalatını kolayca yeniden üretebilmeli ve bunları kriyo-EM ile protein komplekslerinin yapısal analizi için daha yaygın olarak kullanılan bir araç olarak kurabilmelidir.
Disclosures
Hiç kimse.
Acknowledgments
T.C., Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü moleküler biyofizik eğitim hibesi GM-08295 ve Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursu tarafından DGE 2146752 hibe numarası altında desteklenmiştir. R.G. ve B.H., R.G. ve B.H.'ye verilen Ulusal Sağlık Enstitüsü hibesi R21-GM135666 tarafından desteklendi. Bu çalışma kısmen Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü hibesi R35-GM127018 tarafından finanse edildi ve EN'ye verildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
- Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Williams, R. C., Glaeser, R. M. Ultrathin carbon support films for electron microscopy. Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).
- Han, B. -G., et al. Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).
- Han, B. -G., et al. Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals. Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).
- Domínguez-Martín, M. A., et al. Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states. Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).
- Kasinath, V., et al. JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications. Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).
- Lahiri, I., et al. 3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids. Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Levine, M. J., Schwarz, J. A. Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques. Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
