Summary
En trin-for-trin protokol til fremstilling af streptavidinaffinitetsgitter er tilvejebragt til brug i strukturelle undersøgelser af udfordrende makromolekylære prøver ved kryo-elektronmikroskopi.
Abstract
Streptavidin-affinitetsgitter giver strategier til at overvinde mange almindeligt forekommende kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) prøveforberedelsesudfordringer, herunder prøvedenaturering og præferenceorienteringer, der kan opstå på grund af luft-vand-grænsefladen. Streptavidin affinitetsgitter anvendes imidlertid i øjeblikket af få cryo-EM-laboratorier, fordi de ikke er kommercielt tilgængelige og kræver en omhyggelig fabrikationsproces. Todimensionelle streptavidinkrystaller dyrkes på et biotinyleret lipidmonolag, der påføres direkte på standard hul-kulstof kryo-EM-gitter. Højaffinitetsinteraktionen mellem streptavidin og biotin muliggør efterfølgende binding af biotinylerede prøver, der er beskyttet mod luft-vand-grænsefladen under kryo-EM-prøveforberedelse. Derudover giver disse gitre en strategi for koncentrering af tilgængelige prøver i begrænsede mængder og rensning af proteinkomplekser af interesse direkte på gitterene. Her leveres en trin-for-trin, optimeret protokol til robust fremstilling af streptavidin-affinitetsgitter til brug i kryo-EM og negative pleteksperimenter. Derudover er en fejlfindingsguide inkluderet til almindeligt oplevede udfordringer for at gøre brugen af streptavidin-affinitetsgitre mere tilgængelig for det større cryo-EM-samfund.
Introduction
Elektronkryomikroskopi (cryo-EM) har revolutioneret området strukturel biologi ved at muliggøre makromolekylær strukturbestemmelse af store, fleksible og heterogene prøver, der tidligere var utilgængelige ved røntgenkrystallografi eller kernemagnetisk resonans1. Denne metode virker ved at flashfryse makromolekyler i opløsning for at skabe et tyndt lag glasagtig is, der efterfølgende kan afbildes ved hjælp af et elektronmikroskop. I de senere år har betydelige fremskridt inden for både mikroskophardware og billedbehandlingssoftware yderligere udvidet de typer prøver, der er egnede til højopløsningsstrukturbestemmelse ved cryo-EM.
Ikke desto mindre er fremstillingen af tynde, forglasede prøver fortsat et af de mest kritiske trin i makromolekylær strukturbestemmelse ved kryo-EM. Biologiske prøver er ofte dynamiske, skrøbelige, tilbøjelige til denaturering og er undertiden kun tilgængelige i små mængder til kryo-EM-undersøgelser. Under blottingsprocessen interagerer disse partikler med den hydrofobe luft-vand-grænseflade, hvilket kan resultere i partikelforetrukne orienteringer, demontering af skrøbelige komplekser, delvis eller fuldstændig prøvedenaturering og aggregering 2,3,4. Brug af vaskemidler eller andre overfladeaktive stoffer, kemisk tværbinding og adsorption af prøver til støtte for lag er almindelige strategier til bevarelse af biologiske prøver under fryseprocessen. Støttelag såsom grafenoxid 5,6,7 eller amorft kulstof8 fungerer også til at koncentrere partikler på gitteret ved adsorption, når prøven er tilgængelig i begrænsede mængder. Disse metoder er dog ikke generelle eller pålidelige, og optimering af netforberedelse kan være ekstremt tidskrævende eller mislykkes helt.
Streptavidin-affinitetsgitter 9,10 blev udviklet for at overvinde disse mangler og for at give en mild og generelt anvendelig metode til at sekvestre komplekset af interesse og beskytte det mod luft-vand-grænsefladen. Disse gitter udnytter et todimensionelt (2D) streptavidinkrystalgitter dyrket på et monolag af biotinylerede lipider på gitteret. Efter at prøverne selv er biotinyleret (ofte sparsomt og tilfældigt, hvilket betyder en biotin pr. kompleks i gennemsnit), kan de påføres det streptavidinbelagte gitter. Fordi prøveadsorption er afhængig af den ekstremt høje affinitet mellem streptavidin og biotin, kan prøvekoncentrationer så lave som 10 nM anvendes med disse gitre. Kommercielt tilgængelige biotinyleringssæt til proteiner og biotinylerede primere til DNA-holdige komplekser gør det relativt nemt at vedhæfte de nødvendige biotindele til de fleste prøver af interesse. Ud over at koncentrere prøven og holde den væk fra den skadelige luft-vand-grænseflade under blotting, kan tilfældig biotinylering af en eller blot nogle få lysinrester betydeligt forbedre orienteringsområdet for molekylet af interesse på cryo-EM-gitteret, som demonstreret i en række undersøgelser11. Mens signalet fra den underliggende streptavidinkrystal er til stede i de rå billeder, kan databehandlingsordninger, der involverer Fourier-filtrering af de skarpe Bragg-refleksioner fra krystallen, let fjernes under tidlig databehandling, hvilket i sidste ende muliggør rekonstruktioner i høj opløsning af prøven af interesse 11,12,13. Her leveres en optimeret, trin-for-trin protokol til robust produktion af streptavidinaffinitetsgitter og efterfølgende anvendelse i kryo-EM-eksperimenter. Den leverede protokol forventes afsluttet over en 2-ugers periode (figur 1A). De første dele af protokollen beskriver fremstillingen af reagenser, forbehandlingen af gitter og de første kulstoffordampningstrin. Dernæst beskrives instruktioner til fremstilling af lipidmonolaget og væksten af streptavidinkrystaller på EM-gitter. Derudover gives instruktioner til brug af streptavidinaffinitetsgitter i negative plet EM- og kryo-EM-eksperimenter. Endelig er der fastsat procedurer for fjernelse af streptavidin-signal fra mikrografier, når kryo-EM-data er opnået.
Protocol
1. Fremstilling af reagenser
- Fortynd kommercielt købt streptavidin til en slutkoncentration på 0,5 mg/ml i krystallisationsbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose). Sørg for, at den endelige trehalosekoncentration er 10%. Flash-fryse alikvoter på 25-50 μL i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
- 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(biotinyl)natriumsalt opløses i 65:35:8 v/v/v chloroform/methanol/vandopløsningsmiddel til en endelig lipidkoncentration på 1 mg/ml. Opbevar alikvoter til engangsbrug på 20-30 μL ved -80 °C i hætteglas af glas.
BEMÆRK: Fremstilling af opløsningsmiddel er mere nøjagtig, hvis den udføres efter vægt. Først kombineres 1,85 g ultrarent vand med 6,41 g højtydende methanol af væskekromatografi (HPLC) og tilsættes til 22,42 g chloroform for at forberede opløsningsmidlet.
FORSIGTIG: Læs og forstå producenternes sikkerhedsdatablade og anbefalede instruktioner til håndtering og bortskaffelse af organiske opløsningsmidler i chloroform og methanol, inden du begynder denne protokol. Undgå direkte kontakt med methanol med huden.
2. Forbehandling af gitre
- Vask kulfolie på guldnetgitter ved at dyppe to gange i 100% chloroform og en gang i 100% ethanol. Anbring gitre på rent filterpapir for at tørre. Gentag vaskeprocessen i alt tre cyklusser.
BEMÆRK: Reproducerbar succes er opnået med kommercielt tilgængelige kulfibergitter, der har en kulstoffilm på 10-12 nm tykt kulstof (se materialeliste) med hulstørrelser fra 0,6-2 μm. Kommercielt tilgængelige guldfoliegitter og hjemmelavede hulkulstofgitter fremstillet efter Rubinstein Laboratory's nanofabrikationsprotokol14 er også blevet anvendt med succes. Mindre reproducerbare resultater er opnået med kommercielt tilgængelige gitre, der har tyndere kulstoffilm. Brug ikke kobbergitter, da kobber reagerer med eventuelle organiske aminer, der kan være i prøven. - Når gitterene er tørre, fordampes et 2,5-5 nm tykt lag kulstof på kulstofsiden af de hullede kulstofgitter. Kulstoftykkelse styres med måling af kvartskrystalfilmtykkelse, der er indbygget i kulstoffordamperen, der er angivet i filen Materialetabel .
- Lad det nyligt fordampede kulstof ældes (dvs. blive mere hydrofobt) i 1 uge.
3. Fremstilling af streptavidingitter
BEMÆRK: For at dyrke 2D-streptavidinkrystaller på de hullede kulstof-EM-gitter påføres først et biotinyleret lipidmonolag på hullerne i carbonfilmen (figur 1B) ved Langmuir-Schaefer-overførsel. Lipidmonolaget dannes efter de efterfølgende trin (figur 2). Talkum skaber en grænse mellem ricinusolie og petriskål, og et tyndt lag ricinusolie hjælper med at opretholde konstant overfladetryk, når lipidmonolaget dannes. Den side, der indeholder det fordampede kulstof fra trin 2.2, bruges til at opsamle monolaget, overskydende lipider vaskes væk med krystallisationsbuffer, og streptavidinopløsning inkuberes på gitteret til krystallisation.
- Rengør bænkområdet med 70% ethanol.
- Skyl en 5 μL glassprøjte flere gange med chloroform for at rengøre. Lad sprøjten tørre helt før brug.
- Vask kulstoffordampede gitter igen, dvs. lige før brug, ved at dyppe dem i 100% ethanol. Lad ristene tørre på rent filterpapir.
- Mens gitterene tørrer, vaskes hver antikapillær pincet med 100% chloroform og 100% ethanol. Lad pincetten tørre helt.
- På den rene side af parafilm skal du forberede tre 50 μL dråber krystallisationsbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose) for hvert gitter, der skal fremstilles.
- Fyld låget på en 35 mm ubelagt petriskål med krystallisationsbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose). Rengør overfladen med linsepapir.
- Drys talkum af videnskabelig kvalitet rundt om petriskålen. Dette tjener efterfølgende som en indikator i næste trin for, hvor langt ricinusolien har spredt sig. Tilsæt nok talkum til at skabe en barriere, der beskytter ricinusolien mod at røre kanten af petriskålen. Tilsætning af for meget talkum begrænser den tilgængelige plads til at gøre lipidmonolaget.
- Dyp en 200 μL pipettespids i ricinusolien for at opnå en mellemstor dråbe (ca. 20 μL), der hænger fra pipettespidsen. Berør denne dråbe til overfladen af bufferen i petriskålen, hvor den spredes for at danne en ensartet film. Den resulterende tynde film af olie tjener som et stempel15, som opretholder et konstant overfladetryk, når der dannes et lipidmonolag (trin 3.10).
BEMÆRK: Det er vigtigt at tilføje nok ricinusolie snarere end for lidt, og det er bedre at tilføje som en enkelt dråbe. Lad ricinusolien sprede sig fuldt ud, før lipidmonolaget fremstilles. - Skyl 5 μL glassprøjten en eller to gange med det opløste lipid, før du tager en prøve op til brug. Undgå at skabe luftbobler i lipidet, der fylder sprøjten.
BEMÆRK: Glassprøjten skylles med opløst lipid, hvis der er rester af chloroform tilbage fra trin 3.2. Resterende chloroform kan påvirke kvaliteten af det resulterende monolag. - Dispenser det mindst mulige volumen (~ 0,5 μL) lipid fra sprøjten og rør forsigtigt den hængende dråbe til overfladen af ricinusoliefilmen. Bemærk, at lipidopløsningen bryder gennem ricinusoliefilmen ved kontaktpunktet, og at det resulterende lipidmonolag danner en cirkel i midten af den tynde film af ricinusolie.
- Tilsæt flere dråber lipid sekventielt eller tilsæt mere lipid efter at have lavet nogle gitter, men hvis der tilsættes for meget, spredes lipidet forbi grænsen for ricinusolien og ind i omkredsen, hvor talkumpulveret og ethvert forurenende overfladeaktivt middel er blevet sekvestreret. Hvis dette sker, skal processen genstartes.
- Tag et gitter op med en antikapillær pincet, så pincettens lige arm og den kulstoffordampede side af gitteret begge vender mod monolaget.
- Overfør en del af monolaget til det hulede kulstof ved at berøre den kulstoffordampede side af gitteret til monolaget i 1-2 s.
BEMÆRK: Vellykket overførsel indikeres ved, at gitterets overflade bliver hydrofil, hvilket får en tynd, sfærisk bufferhætte til at dække hele gitteret, efter at det er blevet løftet væk fra petriskålen. - Berør den sfæriske hætte på bufferen, der nu klæber til gitteret, sekventielt i 1 s hver, til de tre 50 μL dråber krystallisationsbuffer, der blev fremstillet på parafilm i trin 3.5.
BEMÆRK: Dette trin forsøger at fjerne så meget som muligt af det overskydende lipid, som dækker overfladen af den sfæriske hætte (snarere end den tidligere hydrofobe carbonfilm) for at undgå dannelse af lipidvesikler, når prøver ses i elektronmikroskopet. - Der tilsættes forsigtigt 4 μL 0,5 mg/ml streptavidin i den resterende sfæriske hætte af krystallisationsbuffer på gitteret.
- Placer gitteret i et fugtighedskammer. Gentag trin 3.11-3.14 for hele batchen af gitre.
- Inkuber ristene ved stuetemperatur (RT) i 2 timer inde i et fugtighedskammer for at undgå fordampning.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at gitterets guldside ikke bliver våd på noget tidspunkt, efter at monolaget er påført. - Efter 2 timers inkubation fremstilles en 300 μL dråbe skyllebuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose) til hvert gitter på den rene side af parafilmen.
BEMÆRK: Skyllebufferen indeholder 50 mM KCl i stedet for 150 mM KCl, som er i krystallisationsbufferen, der anvendes til trin 3.5-3.6. - Den overskydende (ubundne) streptavidin vaskes ved at placere risten på den 300 μL dråbe skyllebuffer. Udfør trin 3.18-3.20 for ét gitter ad gangen. Undgå at efterlade ristene på 300 μL skyllebufferfaldet i længere tid.
BEMÆRK: Der udføres kun én vask, fordi streptavidinkrystal/monolaget er skrøbeligt på dette tidspunkt. Hver gang et gitter løftes væk fra overfladen af en dråbe vaskebuffer, bristes væskebroen mellem gitteret og vaskedråben. På brudtidspunktet påføres en forbigående trykgradient (sugetryk) på de selvunderstøttede monolagskrystaller, der spænder over de åbne huller i kulstoffilmen. Dette sugetryk forventes at forårsage forbigående dominans af enkeltlagskrystallen ledsaget af udvidelse af det område, der er dækket af krystallerne. Hvis stigningen i området overstiger krystalets elastiske grænse, kan krystallen bryde eller blive uordnet. - Tør straks antikapillærpincetten med en fnugfri serviet for at lette frigivelsen af gitteret på filterpapir i følgende trin. Tag gitteret, der flyder på dråben skyllebuffer, op ved at stikke den knækkede arm på antikapillærpincetten ind i dråben.
- Tør forsigtigt den overskydende buffer væk fra siden med filterpapir. Placer risten på filtrerpapir med guldsiden nedad, gentag trin 3.18-3.20 for hvert gitter, og lad ristene tørre i 15-20 minutter.
- Når gitterene er tørre, skal du vende dem om, så guldsiden nu vender opad. Fordamp et tyndt lag kulstof (ca. 0,5-2 nm tykt) på guldsiden af gitterne.
BEMÆRK: Opbevar net ved konstant fugtighed, hvis værdi ikke synes at have betydning, idet det bemærkes, at flere ændringer i relativ luftfugtighed forventes at resultere i cyklusser med ekspansion og sammentrækning. Lad gitre ældes i 1 uge før brug af cryo-EM for de bedste resultater, fordi hydrofobicitet af bagsiden af gitteret kan være vigtig for monolagsstabilitet. Nettene er stabile i lange perioder, men efter 3 måneder kan kulstoffet på bagsiden blive mindre hydrofobt.
4. Kontrol af streptavidin-affinitetsgitterbatchkvalitet ved negativ plet
- Forbered to dråber på 50 μL og en dråbe 100 μL prøvebuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) på den rene side af parafilmen.
- Trehalosen fjernes og streptavidinristene rehydreres ved at røre ved de to 50 μL dråber, og lad gitteret flyde på 100 μL dråben prøvebuffer i 10 minutter.
BEMÆRK: Det er bedst at undgå at bruge vaskemiddel under rehydrering og efterfølgende prøvebindende inkubationer. Bufferen spredes til guldsiden af gitterene og begrænser effektiviteten af vaske for at fjerne overskydende prøver. - Efter rehydrering skal du tage gitteret op med en anti-kapillær pincet, så den knækkede arm på anti-kapillær pincet er i dråben.
- Tør forsigtigt den overskydende buffer væk fra siden, og påfør hurtigt 4 μL 75-100 nM prøve igen (valgfrit).
BEMÆRK: Undgå at lade gitteret tørre efter rehydrering. - Inkuber prøven i et fugtighedskammer i 1-5 min.
BEMÆRK: Koncentrations- og inkubationstider vil være prøveafhængige og bør optimeres. Den angivne prøvekoncentration og inkubationstid er foreslåede udgangspunkter. - På den rene side af parafilm opsættes fire dråber på 30 μL hver af både prøvebuffer og 1% uranylformiat (UF) plet.
BEMÆRK: Læs og forstå producenternes sikkerhedsdatablade og anbefalede instruktioner til håndtering og bortskaffelse af uranylformimedi, før du udfører dette trin. Uranylformiat er en giftig og radioaktiv forbindelse. Sørg for at indhente forudgående institutionel godkendelse til brug af radioaktivt materiale. - Den ubundne prøve vaskes væk ved at berøre hver af de fire dråber prøvebuffer.
- Plet prøven ved hjælp af standard negative pletprocedurer med UF. Tør forsigtigt UF-pletten væk fra siden, og efterlad et meget tykt lag plet på gitteret. Yderligere 0,5 μL plet kan påføres gitteret efter blotting for at gøre pletten tykkere, hvis det er nødvendigt. Lad gitteret lufttørre.
BEMÆRK: Da streptavidingitterene er meget hydrofile, har negativ plet tendens til at danne en meget ensartet film overalt, i modsætning til hvad der almindeligvis ses, når man bruger glødudladningsbehandlede, kontinuerlige kulstofgitter. Som følge heraf anbefales det at efterlade en tykkere film af pletopløsning.
5. Frysning af streptavidinaffinitetsgitter med biotinylerede prøver
BEMÆRK: Følgende procedure er beregnet til et ensidigt automatisk stempel, der indeholder en intern blottingsensor (ensidig manuel blotting i andre automatiserede kasteapparater er også mulig)
- Forbered to dråber 50 μL og en dråbe 100 μL prøvebuffer (f.eks. 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) på den rene side af parafilmen.
- Rehydrer streptavidingitter ved at røre ved de to 50 μL dråber og lad gitteret flyde på 100 μL dråbe prøvebuffer i 10 minutter.
- Efter rehydrering skal du tage gitteret op med en anti-kapillær pincet, så den knækkede arm på anti-kapillær pincet er i dråben.
- Tør forsigtigt den overskydende buffer væk fra siden, og påfør hurtigt 4 μL 75-100 nM prøve.
- Prøven inkuberes i et fugtighedskammer i 1-5 min.
BEMÆRK: Igen vil koncentrations- og inkubationstider være prøveafhængige og bør optimeres. Den angivne prøvekoncentration og inkubationstid er foreslåede udgangspunkter. For prøver ved lave koncentrationer kan man inkubere i længere perioder og/eller binde prøven til ristene flere gange. - Forbered to 10 μL dråber frysebuffer (f.eks. 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% trehalose, 0,01% NP40) på den rene side af parafilm. Efter inkubation vaskes den ubundne prøve ved at berøre gitteret med den første dråbe frysebuffer. Slip gitteret på den anden dråbe af frysebufferen.
- Tag hurtigt fat i kanten af gitteret med pincetten fastgjort til det ensidige automatiske stempel. Tør forsigtigt overskydende buffer væk, og påfør hurtigt 4 μL frysebuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% trehalose, 0,01% NP40) på gitteret.
- Fastgør pincet til det ensidige automatiske stempel. De bedste resultater er opnået ved hjælp af en blotsensor, der registrerer væskefaldet på gitteret med blottider mellem 4-6 s. Betingelserne varierer afhængigt af den anvendte prøve og buffer.
6. Databehandling af cryo-EM-film indsamlet fra streptavidin-affinitetsgitre
Dataindsamling på streptavidinaffinitetsgitter kan udføres som med standardgitter, og ingen specielle mikroskopjusteringer er nødvendige. Imidlertid fjerner proceduren beskrevet her streptavidinsignalet først efter bevægelseskorrektion af mikrografen. Derfor kan databehandlingstrin såsom partikelpolering, der er afhængige af originale filmrammer, ikke udføres pålideligt. Streptavidinsignalsubtraktionen (kræves til al standard downstream-behandling undtagen CTF-estimering) kræver her Matlab version R2014b eller nyere, der kører på et Linux-miljø. Signalsubtraktion er afhængig af streptavidinlagets krystallinske natur, hvilket muliggør topmaskering og dermed signalfjernelse fra Fourier-transformationen af hver mikrograf.
- Opsætning af behandlingsscripts
- Kopier alle filer fra supplerende filer til en dedikeret mappe i projektmappen
- Forbered en mappe kaldet processing_scripts, der indeholder følgende filer:
lsub.m (supplerende kodningsfil 1; subtraktionsscriptet)
process_subtration.sh (supplerende kodningsfil 2; wrapper-script, der løber over alle tilgængelige mikrografier, afføder parallelle job og holder styr på input og output)
process_subtraction.cfg (supplerende kodningsfil 3; konfigurationsfil, der indeholder parametrene for subtraktionsjobbet, se 6.2) - Forbered en mappe kaldet support_scripts, der indeholder følgende filer:
bg_drill_hole.m (supplerende kodningsfil 4)
bg_FastSubtract_standard.m (supplerende kodningsfil 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (supplerende kodningsfil 6)
bg_push_by_rot.m (supplerende kodningsfil 7)
ReadMRC.m (supplerende kodningsfil 8)
WriteMRC.m (supplerende kodningsfil 9)
WriteMRCHeader.m (supplerende kodningsfil 10)
- Juster konfigurationsfilen efter behov (process_subtraction.cfg, (se figur 3) efter behov:
- Input: Sti til den mappe, der indeholder de bevægelseskorrigerede mikrografier i mrc-format. Brug enten en mappe eller et mønster, der indeholder jokertegn (?, *).
Eksempel:
input = "/ sti / til / project_directory / mikrografer /"
eller
input = "/ sti / til / project_directory / mikrografer / *.mrc" - output_dir: Sti til den mappe, som gitteret trak mikrografier til.
- only_do_unfinished: Angiv (true|false), om allerede eksisterende subtraherede mikrografier skal overskrives eller springes over. Denne parameter er nyttig til at starte gittersubtraktionsscriptet midt i en mikroskopsession (standard: sand).
- num_parallel_jobs: Angiv antallet af parallelle job. Dette antal afhænger af de hardwarespecifikationer, der bruges til behandling, og bør ikke være højere end antallet af tilgængelige kerner. På systemer med 32 kerner og et netværksfilsystem blev der opnået optimal ydeevne med 14 parallelle job. For at opnå den bedste ydeevne skal du optimere denne værdi med et undersæt af mikrografier.
- Pad_Origin_X: 200 for en K3-detektor i stående retning (billedbredde < billedhøjde) eller ved brug af en firkantet detektor (Falcon III, Falcon IV, K2), 1000 for en K3-detektor i liggende retning (billedbredde > billedhøjde). FFT udføres i firkantede kasser, og polstring er påkrævet, hvis detektoren har ikke-kvadratiske dimensioner.
- Pad_Origin_Y: 1000 for en K3-detektor i stående retning (billedbredde < billedhøjde), 200 ved brug af en firkantet detektor (Falcon III, Falcon IV, K2) eller hvis du bruger en K3-detektor i liggende retning (billedbredde > billedhøjde).
- Du må ikke ændre Inside_Radius_Ang (90) og Outside_Radius_Ang (3.0). Gittersubtraktionen udføres mellem to opløsninger (enheden er i angstrom).
- Pixel_Ang: Angiv pixelstørrelsen som en flydende punktværdi.
- Tærskel: Afskæringsværdi for subtraktionstærskel for at erstatte gitteret med baggrunden i Fourier-rummet. Korrekt anvendte værdier er mellem 1,4-1,6. Brug 1.42 som udgangspunkt.
- Du må ikke ændre expand_pixel (10) og pad_out_opt (0). expand_pixel er en diameterværdi, der bruges til maskering omkring pixel med værdier, der er højere end tærskelafskæringen. pad_out_opt er en mulighed, der bestemmer, om et polstret område er inkluderet i outputtet.
- addpath_m: Sti til supportscripts.
- path_to_matlab_bin: Sti til systemets Matlab-installationsbin-mappe.
- path_matlab_script: Sti til matlab-substraktionsscriptet (lsub.m), der er kopieret ovenfor under trin 6.1.2.
- Input: Sti til den mappe, der indeholder de bevægelseskorrigerede mikrografier i mrc-format. Brug enten en mappe eller et mønster, der indeholder jokertegn (?, *).
- Når du har gemt det ændrede script, skal du køre scriptet (bash ./process_subtraction.sh ) for at trække streptavidinsignalet fra inputmikrografierne. Scriptet kan afbrydes og/eller genstartes, hvis parameteren only_do_unfinished er indstillet til true (se i trin 6.2.3). Hvis der opstår en fejl, skal du gennemgå de parametre, der er angivet i bash-scriptet. Sørg for, at der ikke er utilsigtede mellemrum mellem parametervariabler og deres tildelte værdier, da dette er en almindelig kilde til fejl.
- Brug gittersubtraherede billeder til standard cryo-EM-billedbehandling.
Representative Results
Efter kulstoffordampningen i trin 3.21 (normalt efter en uge) kan streptavidinaffinitetsgitter anvendes til forberedelse af kryo-EM eller negativ pletprøve efter procedurerne beskrevet i trin 4 og 5. Figur 4A viser en repræsentativ mikrografi taget ved hjælp af en K3-detektor på en titan Krios ved 81.000X-forstørrelse med en pixelstørrelse på 1,05 Å af en biotinyleret prøve frosset med streptavidin-affinitetsgitter. Vellykket gitterdannelse observeres af det kontinuerlige gittermønster, der vises i baggrunden af billedet. Dette kan lettere observeres ved diffraktionsmønsteret, der vises i den hurtige Fouriertransformation (FFT) vist i figur 4A (højre). Efter dataindsamling, efter proceduren beskrevet i trin 6 i denne protokol, kan signalet, der bidrager til billedet af streptavidingitteret, beregningsmæssigt maskeres for at producere en trukket mikrograf (figur 4B), der kan bruges til efterfølgende databehandlingstrin. FFT i figur 4B (højre) viser, at diffraktionsmønsteret observeret i figur 4A (højre) er blevet fjernet fra det originale billede.
Figur 4C viser et eksempel på mikrografi taget på et Tecnai 12-mikroskop ved en forstørrelse på 49.000x med en pixelstørrelse på 1,6 Å af en biotinyleret prøve bundet til streptavidin-affinitetsgitter og negativt farvet ved hjælp af uranylformiat. Gitre blev udarbejdet efter proceduren beskrevet i trin 4 i denne protokol, hvilket efterlod en tykkere film af plet.
Der er flere almindelige observationer, når streptavidingitterfabrikationsproceduren ikke lykkes, som er beskrevet yderligere i diskussionsafsnittet og tabel 1. Figur 5 viser flere eksempler på disse observationer. Figur 5A viser en mikrografi af et negativt farvet streptavidinaffinitetsgitter, der anvendes fra et parti, der er fremstillet over seks måneder gammelt. Monolaget har mobiliseret sig fra hullerne i kvantifoliegitterets kulstoffolie og observeres med lignende dimensioner som hullerne i gitteret. Figur 5B viser et eksempel på streptavidinkrystaller, der har høj mosaikitet, der let forstyrres under prøveforberedelsesprocedurer. Figur 5C viser en repræsentativ mikrografi fra et streptavidinaffinitetsgitter, hvor kulstoffordampningen i trin 3.21 er for tynd eller udeladt. Streptavidingitteret er blevet fragmenteret under kryo-EM-prøveforberedelsesprocessen. Figur 5D viser et negativt farvet streptavidinaffinitetsgitter, der har forurening fra lipidvesikler, sandsynligvis på grund af utilstrækkelige vaske under trin 3.13 eller guldsiden af gitteret, der bliver våd under trin 3.13-3.20. Se diskussionsafsnittet og tabel 1 for strategier til at overvinde disse almindelige problemer.
Figur 1: Skematisk oversigt over fremstillingsproceduren for streptavidinaffinitetsgitter. (A) Oversigt over tidslinjen for proceduren for fremstilling af streptavidinaffinitetsgitter. Hele proceduren kan gennemføres over to uger, der kræver to kulstoffordampningstrin og en uge efter hver for at give kulstoffet mulighed for at ældes tilstrækkeligt. (B) Zoomet med henblik på et gitterkvadrat af et streptavidin-affinitetsgitter, der viser de lag, der udgør gitteret efter afslutningen af fremstillingsprocessen, herunder standardkryo-EM-gitteret med guldbarrer og hul-kulstoffilm, det første fordampede kulstoflag, lipidmonolag, 2D-streptavidinkrystal og bagsiden af det fordampede kulstofstøttelag. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Lipidmonolag og streptavidinkrystallisation (A) Billeder, der viser, hvordan man med succes danner lipidmonolaget i den lille petriskål ved hjælp af talkum til at skabe en grænse for ricinusolien, der skaber konstant overfladetryk, mens lipidmonolaget dannes. (B) Billeder, der viser, hvordan man dyrker streptavidinkrystaller på kryo-EM-gitre. Først berøres kulstofsiden af gitterene til lipidmonolaget og efterfølges af tre på hinanden følgende vaske i krystallisationsbufferen. Streptavidin tilsættes, og gitter inkuberes i et fugtighedskammer i 2 timer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempelparametre for process_subtraction.cfg-filen til udførelse af streptavidingittersubtraktion fra mikrografier (trin 6). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater af vellykket fremstilling af streptavidinaffinitetsgitter. (A) Kryo-EM-mikrografi af biotinylerede protein-/nukleosomkomplekser fremstillet med hjemmelavede streptavidinaffinitetsgitter. FFT er vist til højre og viser streptavidinkrystaldiffraktionsmønsteret. (B) Samme mikrografi som i panel A vises efter gittersubtraktionsproceduren for at fjerne signalet fra 2D-streptavidinkrystallen fra det originale billede. C) Et eksempel på en mikrografi opnået ved negativfarvning af en biotinyleret prøve bundet til streptavidin-affinitetsgitter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative resultater af mislykket fremstilling af streptavidinaffinitetsgitter. (A) Mikrografi, der viser mobiliseringen af streptavidinmonolaget fra gitterhullerne, når gitterene er ældre end seks måneder. (B) Mikrografi, der viser streptavidingitter med høj mosaikitet, der let beskadiges under både kryo-EM og procedurer til forberedelse af prøver med negativ plet. C) Mikrografi, der viser fragmentering af streptavidingitteret under forberedelse af kryo-EM-prøver, når kulstoffordampningslaget i trin 3.21 er for tyndt eller udeladt. (D) Repræsentativ mikrografi, der er forurenet med lipidvesikler, sandsynligvis på grund af utilstrækkelig vask under trin 3.13 eller guldsiden af gitteret, der bliver våd under trin 3.13-3.20. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Fejlfindingsvejledning til at overvinde almindeligt oplevede udfordringer, der opstår under mislykket streptavidin-affinitetsgitterfabrikation. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende kodningsfil 1: lsub.m Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 2: process_subtration.sh Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 3: process_subtraction.cfg Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 4: bg_drill_hole.m Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 5: bg_FastSubtract_standard.m Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 7: bg_push_by_rot.m Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 8: ReadMRC.m Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 9: WriteMRC.m Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 10: WriteMRCHeader.m Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Vores protokol beskriver, hvordan man laver og bruger streptavidin-affinitetsgitter, og hvordan man behandler de data, der indeholder streptavidindiffraktionssignalet. Der er flere kritiske trin i protokollen, der kræver særlig opmærksomhed.
Mislykkede gitterbatches kan spores tilbage til flere almindelige fejl. Den mest almindelige fejlkilde kommer fra brug af forældede reagenser eller reagenser af dårlig kvalitet. Det er især vigtigt at forberede den biotinylerede lipidopløsning nøjagtigt som beskrevet i protokollen. Endvidere kan eventuelle urenheder, såsom rester af vaskemiddel på labware eller naturligt tilstedeværende olier på huden, påvirke kvaliteten af streptavidinkrystallerne og dermed kvaliteten af de resulterende billeder. Det anbefales derfor at udføre tre vaskecyklusser for ristene forud for den første kulstoffordampning for at fjerne eventuel forurening med overfladeaktive stoffer fra netproducenten (trin 2.1). Derudover er forurening eller urenhed af ricinusolien blevet observeret for at hindre krystaldannelse på gitteret.
At lave og samle lipidmonolaget op er en opgave, der skal øves et par gange for at få en fornemmelse for de små lipidvolumener. Det er ikke usædvanligt, at dette trin mislykkes de første to eller tre gange, før et passende lipidmonolag kan produceres, hvilket i sidste ende afspejles i kvaliteten af streptavidinkrystaller, der ses i negativt farvede gitter (figur 4C).
Det er vigtigt aldrig at lade bagsiden (guldsiden, lipidsiden) af gitteret blive våd under gitterfremstillingsprocessen (trin 3.12-3.20). Hvis bagsiden bliver våd, anbefales det at kassere gitteret. Dette kan resultere i udseendet af store lipidvesikler, der forstyrrer billedkvaliteten (figur 5D) (række 3, tabel 1). Lipidvesikler kan også observeres på grund af utilstrækkelig vask, efter at lipidmonolaget er påført (trin 3.13). Tre efterfølgende vaske ved hjælp af krystalliseringsbuffer anbefales efter berøring af lipidmonolaget inden tilsætning af streptavidin.
Efter at et tyndt lag kulstof er blevet fordampet på trehalose-indlejrede gitter, kan bagsiden af gitteret være vådt uden at skade gitterkvaliteten. For eksempel observeres ofte befugtning af bagsiden, når prøvebufferen indeholder selv minimale mængder vaskemiddel. Befugtning af bagsiden af prøven kan resultere i uspecifik binding af prøver til den tynde kulstoffilm på bagsiden, hvilket reducerer effektiviteten af at forhindre partikler i at diffundere til luft-vand-grænsefladen eller brugen af affinitetsbinding til rensningsstrategier på nettet. Hvis det er muligt, tilsættes prøven til gitteret, hvis der ikke er vaskemiddel. Vaskemiddel og andre tilsætningsstoffer kan efterfølgende tilsættes under gittervasketrinnene eller tilsættes i et sidste trin før forglasning. Dette er en begrænsning for brugen af streptavidin-affinitetsgitter; Men hvis målet er at forbedre præferenceorienteringen, er prøveforberedelsen med buffere, herunder vaskemiddel, blevet udført med succes11.
En almindelig fejlkilde kan spores tilbage til nettenes alder i forhold til begge kulstoffordampningstrin (trin 2.3 og trin 3.21). I denne protokol er den anbefalede ventetid 5-7 dage efter bagsidens kulstoffordampning, før streptavidingitter anvendes til cryo-EM. Når gitter bruges for hurtigt efter fremstilling, er gitteret og lipidmonolaget blevet observeret at mobilisere ud af gitterhullerne. En lignende observation kan gøres, når nettene er for gamle og anvendes efter seks måneder (figur 5A) (række 1, tabel 1). Vi antager, at denne observation forklares af ændringer i hydrofobicitet af kulstofunderlaget, der påføres for at stabilisere lipidmonolaget og streptavidinkrystallerne. Derudover kan streptavidingitter forekomme mosaik (figur 5B) (række 3, tabel 1) og brudt i både negativ plet og kryo-EM, hvis monolaget påføres gitter, hvor det første kulstoffordampningslag (trin 2.3) ikke er tilstrækkeligt ældet.
En yderligere almindelig fejlkilde kan spores til skrøbeligheden af streptavidin krystallinsk monolag (lipidmonolaget er selv flydende og kan reversibelt udvide eller komprimere). Bagsiden af kulstoffordampningen (trin 3.21) giver kritisk stabilitet til både monolaget og streptavidingitteret under prøveadsorption, vask og kryo-EM-blottingprocessen. I mangel af tilstrækkelig kulstoffordampning til bagsiden af nettet vil streptavidingitter ofte forekomme fragmenterede efter blotting/frysning (figur 5C) (række 2, tabel 1). I denne protokol foreslår vi brugen af en ensidig automatiseret dykfryser til ensidig blotting. Denne metode giver meget reproducerbare blottingbetingelser, der bevarer streptavidingitteret under fryseprocessen og muliggør strømlinet optimering af prøveapplikationen og blottingparametrene. Alternativt er andre automatiske dykfrysningsapparater blevet anvendt i kombination med manuel blotting. For at gøre dette er den faktiske blotting-funktion deaktiveret i enhedens indstillinger, og gitteret slettes i stedet ved at nå med en pincet, der holder blottingpapir gennem sideindgangen. Denne metode kan opnå resultater af høj kvalitet for laboratorier uden en ensidig blotting og dykfrysningsanordning; Imidlertid er grid-to-grid reproducerbarhed udfordrende.
Mens brug af streptavidin-affinitetsgitter har mange fordele, skal der tages hensyn til nogle begrænsninger ved denne metode. På grund af procedurens art er det normalt ikke muligt at vurdere kvaliteten af streptavidingitteret, før hele processen er afsluttet. Det foreslås hurtigt at screene kvaliteten af hver batch med negativ plet inden frysning af prøver. På grund af det signal, som streptavidingitteret bidrager med til de rå billeder, kan det i nogle tilfælde være udfordrende at vurdere, ud fra billederne alene, om der er et tilstrækkeligt antal intakte, spredte partikler. Af samme grund er on-the-fly behandling af cryo-EM-data under dataindsamling ikke mulig, medmindre streptavidinsignalsubtraktionsproceduren er inkluderet i dataforbehandlingspipelinen. Fordi streptavidinsignalet normalt trækkes fra de bevægelseskorrigerede billeder og ikke selve rammerne, kan bayesiansk polering, som implementeret i populære softwarepakker, mislykkes, når du bruger subtraktionsprocedurerne som beskrevet. Det anbefales derfor at udføre bevægelseskorrektion i flere plastre for at minimere partikelbevægelse fra begyndelsen af databehandlingen16.
På trods af disse begrænsninger tilbyder streptavidin-affinitetsgitter mange fordele. To store fordele, som streptavidin-affinitetsgitter giver i forhold til standard kryo-EM-gitter med åbent hul, er et middel til at beskytte prøver mod luft-vand-grænsefladen og koncentrere prøver med lav forekomst (10-100 nM) på nettet. Andre støttelag, såsom kulstof og grafenoxid, kan også bruges som strategier til at overvinde disse flaskehalse i prøveforberedelsen. I et eksempel var streptavidin-affinitetsgitter den eneste løsning til opnåelse af en intakt rekonstruktion af en protein-nukleinsyreinteraktion, der var uforenelig med tværbindingsmetoder. 12
En anden stor fordel, som streptavidin-affinitetsgitter giver, er en løsning på prøver, der adsorberer til andre støttelag, såsom kulstof eller grafenoxid, med foretrukne orienteringer, der forhindrer evnen til at opnå en 3D-rekonstruktion af prøven af interesse. Tilfældig biotinylering af prøver ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits muliggør tilfældig vedhæftning af prøven af interesse for streptavidinmonolaget for at opnå flere potentielle synspunkter for at overvinde denne udfordring.
Derudover tilbyder streptavidin-affinitetsgitre fordele, der er unikke for affinitetsbaserede gitre. Den høje affinitet og specificitet af streptavidin-biotininteraktionen tillader kobling af streptavidinaffinitetsgitter med andre arbejdsgange, der involverer biotin for at rense komplekser af interesse. I et offentliggjort eksempel immobiliserede forfatterne et kompleks på streptavidinaffinitetsgitter og inkuberede en bindingspartner med ukendt støkiometri i stort overskud. Efter vask af ethvert ubundet protein blev det korrekt monterede superkompleks opnået og kunne straks analyseres med cryo-EM11. En mulig fremtidig anvendelse kan være at kombinere streptavidinbindende proteinmærker, Avi-tag-systemet eller nærhedsmærkningsmetoder med streptavidin-affinitetsgitter for at ekstrahere enkeltproteiner og / eller proteinkomplekser direkte fra rekombinante eller endogene kilder uden standard udførlige oprensningsordninger.
Ved at levere denne protokol bør laboratorier være i stand til let at reproducere fremstillingen af streptavidinaffinitetsgitter og etablere dem som et mere almindeligt anvendt værktøj til strukturel analyse af proteinkomplekser ved kryo-EM.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
TC blev støttet af National Institute of General Medical Sciences molekylær biofysik uddannelsestilskud GM-08295 og National Science Foundation graduate research fellowship under bevillingsnummer DGE 2146752. R.G. og B.H. blev støttet af National Institute of Health-tilskuddet R21-GM135666 tildelt R.G. og B.H. Dette arbejde blev delvist finansieret gennem National Institute of General Medical Sciences bevilling R35-GM127018 tildelt E.N. E.N. er en Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
- Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Williams, R. C., Glaeser, R. M. Ultrathin carbon support films for electron microscopy. Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).
- Han, B. -G., et al. Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).
- Han, B. -G., et al. Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals. Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).
- Domínguez-Martín, M. A., et al. Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states. Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).
- Kasinath, V., et al. JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications. Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).
- Lahiri, I., et al. 3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids. Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Levine, M. J., Schwarz, J. A. Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques. Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
