Summary
Kolonisatie van plantengroeibevorderende rhizobacteriën (PGPR) in de rhizosfeer is essentieel voor de groeibevorderende werking. Het is noodzakelijk om de detectiemethode van bacteriële rhizosfeerkolonisatie te standaardiseren. Hier beschrijven we een reproduceerbare methode voor het kwantificeren van bacteriële kolonisatie op het worteloppervlak.
Abstract
Het meten van bacteriële kolonisatie op de wortel van Arabidopsis thaliana is een van de meest voorkomende experimenten in onderzoeken naar plant-microbe-interacties. Een gestandaardiseerde methode voor het meten van bacteriële kolonisatie in de rhizosfeer is nodig om de reproduceerbaarheid te verbeteren. We kweekten eerst steriele A. thaliana in hydrocultuuromstandigheden en inoculeerden vervolgens de bacteriële cellen in de rhizosfeer met een eindconcentratie van OD600 van 0,01. 2 dagen na inoculatie werd het wortelweefsel geoogst en drie keer gewassen in steriel water om de niet-gekoloniseerde bacteriecellen te verwijderen. De wortels werden vervolgens gewogen en de bacteriële cellen die op de wortel waren gekoloniseerd, werden verzameld door een draaikolk. De celsuspensie werd verdund in een gradiënt met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door plating op een Luria-Bertani (LB) agarmedium. De platen werden gedurende 10 uur bij 37 °C geïncubeerd, en vervolgens werden de enkele kolonies op LB-platen geteld en genormaliseerd om de bacteriële cellen aan te geven die op de wortels waren gekoloniseerd. Deze methode wordt gebruikt om bacteriële kolonisatie in de rhizosfeer te detecteren in mono-interactieomstandigheden, met een goede reproduceerbaarheid.
Introduction
Er zijn kwantitatieve en kwalitatieve methoden voor het detecteren van kolonisatie van de rhizosfeer door een enkele bacteriestam. Voor de kwalitatieve methode moet een rek worden gebruikt die constitutief fluorescentie tot expressie brengt, en de fluorescentieverdeling en -intensiteit moeten worden onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie of confocale laserinstrumenten 1,2. Die strategieën kunnen bacteriële kolonisatie in situ3 heel goed weerspiegelen, maar ze zijn niet zo nauwkeurig als traditionele methoden voor het tellen van platen in kwantificering. Bovendien kan het, vanwege de beperking van het weergeven van slechts gedeeltelijke wortelzones onder de microscoop, soms worden beïnvloed door subjectieve vooringenomenheid.
Hier beschrijven we een kwantitatieve methode, waaronder het verzamelen van de gekoloniseerde bacteriecellen en het tellen van de bacteriële CFU's op een plaat. Deze methode is gebaseerd op verdunning en plating waarbij de gekoloniseerde stammen die van plantenwortels zijn gestript, kunnen worden geteld en het totale aantal gekoloniseerde bacteriën op de wortel kan worden berekend op 4,5.
Eerst werd A. thaliana gekweekt in hydrocultuuromstandigheden en vervolgens werden bacteriële cellen geïnoculeerd in de rhizosfeer met een eindconcentratie van 0,01 OD600. De geïnfecteerde wortelweefsels werden 2 dagen na inoculatie geoogst en in steriel water gewassen om de niet-gekoloniseerde bacteriële cellen te verwijderen. Verder werden bacteriële cellen die op de wortel waren gekoloniseerd, verzameld, verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en geplateerd op een Luria-Bertani (LB) agar-medium. Na incubatie bij 37 °C gedurende 10 uur werden enkele kolonies op LB-platen geteld en genormaliseerd om de bacteriecellen te bepalen die op de wortels waren gekoloniseerd.
Deze methode is zeer toepasbaar, heeft een goede herhaalbaarheid en is meer geschikt voor nauwkeurige bepaling van bacteriële kolonisatie in de rhizosfeer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Steriele hydrocultuur van A. thaliana
- Bereid A. thaliana zaailingen voor.
- Bereid cultuur A. thaliana zaailingen medium voor, dat bestaat uit 1/2 MS medium (Murashige en Skoog) met 2% (wt/vol) sucrose en 0,9% (wt/vol) agar.
- Giet het bereide sterilisatiemedium in steriele vierkante petrischaaltjes (13 cm x 13 cm) voordat u stolt. Vermijd drogen aan de lucht om de luchtvochtigheid op peil te houden.
- Dompel A. thaliana zaden onder in een microcentrifugebuis van 2 ml gevuld met 1 ml steriel water bij 4 °C gedurende 12 uur, en steriliseer de zaden vervolgens gedurende 2 minuten met 1 ml 2% (vol/vol) NaClO.
- Was de zaden zes keer grondig met steriel water om de NaClO-oplossing te verwijderen. Zaai de zaden op petrischaaltjes met MS agar medium met een steriel tipje van 1 ml.
- Sluit de petrischaaltjes af met ademende medische tape en plaats ze verticaal in een lichte incubator om 1 week te groeien. Stel de dag/nachtverhouding van de lichtincubator in op 16 uur/8 uur, houd de temperatuur op 23 °C en de luchtvochtigheid op 40%-60%.
- Transplantatie A. thaliana.
- Snijd gaten van 5 mm op de 40 μm poriëngrootte celkleurer en steriliel ze.
- Transplanteer drie 7 dagen oude A. thaliana planten door de gaten van een celzeef en doe ze in een plaat met 6 putjes met 3 ml steriele vloeibare 1/2 MS medium met 0,5% sucrose.
- Plaats de 6-wells platen in een lichte incubator (Figuur 1A) en incubeer gedurende 10 dagen.
2. Bacterieteelt en inoculatie
- Bereid bacteriële suspensie voor op inoculatie.
- Voor Bacillus velezensis inoculeert u de bacteriecellen in een steriel LB-medium en incubeert u bij 37 °C met schudden bij 170 tpm totdat de OD600 van 0,8-1,2 is bereikt.
- Verzamel de bacteriecellen door centrifugatie bij 6000 x g gedurende 2 minuten en resuspendeer de cellen in PBS-buffer (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Herhaal de stappen voor centrifugeren en resuspenderen 3 keer om het LB-medium en de bacteriële metabolieten te verwijderen.
- Suspendeer de bacteriecellen in een vers 1/2 MS-medium bij een eindconcentratie van OD600 0,01. Inoculeer de bacteriesuspensies op de 6-putjes platen waarop A. thaliana zaailingen groeien, plaats de 6-putjes platen in de lichte incubator en kweek ze gedurende 2 dagen.
3. Het meten van bacteriën die op wortels zijn gekoloniseerd
- Oogst het wortelweefsel en leg de gekoloniseerde cellen op een plaat.
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder gnotobiotische omstandigheden- Weeg de buisjes van 2 ml en noteer het gewicht als W0.
- Oogst de co-gekweekte A. thaliana wortelweefsels en was ze 3 keer in steriel water. Leg de wortel op filtreerpapier om het overtollige water te verwijderen.
- Plaats de wortel in de gewogen microcentrifugebuis, weeg de wortels samen met de buis en noteer deze als W1.
- Voeg 1 ml PBS toe aan elke buis en draai de buizen gedurende 8 minuten op de maximale snelheid.
- Verdun de suspensies met de verzamelde wortelgekoloniseerde bacteriecellen tot 1 x 10-1-1 x 10-4 (afhankelijk van het vermogen van de bacteriekolonisatie). Verdeel de verdunde bacteriële suspensies over platen met LB-agarmedium en incubeer gedurende 10 uur bij 37 °C.
- Tel de kolonies en normaliseer de gegevens.
- Tel de bacteriekolonies op LB-platen.
- Bereken de kve's op basis van de overeenkomstige verdunning en normaliseer de gegevens met het verse gewicht van de wortel (W1-W 0). De definitieve resultaten geven het aantal gekoloniseerde bacteriële cellen per gram wortel aan 2 dagen na inoculatie (Figuur 1B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de nauwkeurigheid van het kolonisatievermogen van bacteriën te testen dat met deze methode in de A. thaliana rhizosfeer wordt gedetecteerd, hebben we Bacillus velezensis SQR9 WT en een afgeleide mutant Δ8mcp afzonderlijk in de rhizosfeer van A. thaliana geïnoculeerd. De Δ8mcp is een mutant die alle chemoreceptorcoderende genen mist en heeft een aanzienlijk verminderde kolonisatie6. We hebben hun kolonisatie 2 dagen na inoculatie gemeten met behulp van de huidige wortelkolonisatietest. De resultaten toonden een significante vermindering van de wortelkolonisatie van Δ8mcp, wat aangeeft dat deze aandoening en methode de bacteriekolonisatie effectief meten (Figuur 1C).
Figuur 1: Teelt van A. thaliana en de wortelkolonisatie van Bacillus velezensis SQR9 en Δ8mcp. (A) Het bovenaanzicht van de 7 dagen oude A. thaliana die groeit in platen met 6 putjes met celkleurer in hydrocultuurtoestand. (B) Het zijaanzicht van de 7 dagen oude A. thaliana die groeit in platen met 6 putjes, elk putje met 3 zaailingen. (C) Kolonisatie van B. velezensis wildtype SQR9 en Δ8mcp gemeten met behulp van de gepresenteerde test. Zes replicaten werden opgenomen en de gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om een goede reproduceerbaarheid te bereiken, zijn er vier cruciale stappen voor het kolonisatiedetectieproces van dit protocol. Ten eerste is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het aantal geïnoculeerde bacteriecellen in elk experiment precies hetzelfde is. Ten tweede is het ook noodzakelijk om de reinigingsintensiteit van de niet-gekoloniseerde bacteriën met steriel water te beheersen. Ten derde moet elk monsterverdunningsproces worden gewerveld voordat het wordt uitgevoerd om het monster in een volledige mengtoestand te laten zijn om de absorptiefouten te voorkomen die te wijten zijn aan de kenmerken van bacteriën die gemakkelijk in de microcentrifugebuis kunnen zinken. Daarom raden we aan om een vortexinstrument te gebruiken om de bacteriële suspensie voor elke absorptie te mengen. Ten vierde moet asepsis strikt worden gewaarborgd tijdens alle operaties waarbij deze methode wordt gebruikt om elke mogelijkheid van besmetting te voorkomen.
Deze methode wordt gebruikt om de bacteriën te bepalen die op het worteloppervlak zijn gekoloniseerd. Behalve bacteriën op het worteloppervlak koloniseren ook endofytische bacteriën en schimmels de rhizosfeer van de plant7. Het kolonisatievermogen van endofytische bacteriën kan nog steeds worden gedetecteerd met behulp van het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, maar het wortelweefsel moet worden vermalen om endofytische bacteriën vrij te geven. De endofytische schimmels zijn echter anders dan bacteriën. De meeste reguliere methoden maken gebruik van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om de groei van hyfen te observeren, wat een kwalitatieve detectiemethode is die vergelijkbaar is met fluorescerende etiketteringsbacteriën voor visualisatie8.
Bij het vergelijken van de kolonisatie van verschillende stammen, mogen ze niet worden geënt in één plaat met 6 putjes om de invloed van de bacteriële vluchtige stoffen9 en plantaardige vluchtige stoffen10,11 te vermijden. We kozen voor 2 dagen na inoculatie voor het detecteren van wortel omdat de kolonisatie van SQR9 het maximum bereikte tussen 2 en 4 dagen; De tijd voor het detecteren van de bacteriële kolonisatie kan worden aangepast aan de stammen.
In vergelijking met andere beschreven methoden is deze methode nauwkeurig en eenvoudig te bedienen. Bijvoorbeeld, de methode beschreven door Noam et al. laat de vast gekweekte arabidopsis onmiddellijk met bacteriën worden geënt wanneer deze wordt getransplanteerd naar hydrocultuurtoestand12,13. Hier stellen we voor dat de bacteriën na enkele dagen verplanten in de rhizosfeer moeten worden geënt om de invloed van de aanpassing van de plant aan de veranderde groeiomgeving te voorkomen. De methode die in deze studie wordt beschreven, is ook goed voor planten om wortelexsudaat af te geven, wat de kolonisatie beïnvloedt.
Om de scheuten van de plant apart in de lucht te laten groeien en volledig weg van de vloeibare onderdompeling, hebben we enkele kleine aanpassingen en bewerkingen aan de celkleuraar gedaan om ze beschikbaar te maken voor deze hydrocultuurmethode. Bovendien is deze methode meer geschikt voor nauwkeurige bepaling van bacteriële kolonisatie in kleine hoeveelheden, maar niet voor grote hoeveelheden wortelexsudaten die in hydrocultuur zijn verzameld14. Het is belangrijk op te merken dat deze methode is gewijzigd op basis van eerder gepubliceerde studies 12,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben met de inhoud van dit artikel.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (32370135), het innovatieprogramma van de Chinese Academie voor Landbouwwetenschappen (CAAS-CSAL-202302), het Science and Technology Project van het Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M.
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -E., Won, M. -H., Jeong, M. -I., Oh, K. -K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
