Summary
Kolonisering av växttillväxtfrämjande rhizobakterier (PGPR) i rhizosfären är avgörande för dess tillväxtfrämjande effekt. Det är nödvändigt att standardisera metoden för detektion av bakteriell rhizosfärkolonisering. Här beskriver vi en reproducerbar metod för att kvantifiera bakteriell kolonisering på rotytan.
Abstract
Att mäta bakteriell kolonisering på Arabidopsis thaliana-rot är ett av de vanligaste experimenten i studier av växt-mikrobinteraktion. En standardiserad metod för att mäta bakteriekolonisering i rhizosfären är nödvändig för att förbättra reproducerbarheten. Vi odlade först steril A.thaliana under hydroponiska förhållanden och inokulerade sedan bakteriecellerna i rhizosfären vid en slutlig koncentration av OD600 på 0,01. 2 dagar efter inokuleringen skördades rotvävnaden och tvättades tre gånger i sterilt vatten för att avlägsna de okoloniserade bakteriecellerna. Rötterna vägdes sedan och de bakterieceller som koloniserades på roten samlades in av virveln. Cellsuspensionen späddes ut i en gradient med en fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) buffert, följt av plätering på ett Luria-Bertani (LB) agarmedium. Plattorna inkuberades vid 37 °C i 10 timmar, och sedan räknades och normaliserades de enskilda kolonierna på LB-plattorna för att indikera vilka bakterieceller som koloniserats på rötterna. Denna metod används för att detektera bakteriell kolonisering i rhizosfären under monointeraktionsförhållanden, med god reproducerbarhet.
Introduction
Det finns kvantitativa och kvalitativa metoder för att detektera rhizosfärkolonisering av en enda bakteriestam. För den kvalitativa metoden bör en stam som konstitutivt uttrycker fluorescens användas, och fluorescensfördelningen och intensiteten bör undersökas med fluorescensmikroskopi eller laserkonfokala instrument 1,2. Dessa strategier kan mycket väl återspegla bakteriell kolonisering in situ3, men de är inte lika exakta som traditionella platträkningsmetoder i kvantifiering. Dessutom, på grund av begränsningen att endast visa partiella rotzoner under mikroskopet, kan det ibland påverkas av subjektiv bias.
Här beskriver vi en kvantitativ metod, som innebär att man samlar in de koloniserade bakteriecellerna och räknar de bakteriella CFU:erna på en platta. Denna metod är baserad på utspädning och plätering genom vilken de koloniserade stammar som avlägsnats från växtrötter kan räknas, och det totala antalet koloniserade bakterier på roten kan beräknas som 4,5.
Först odlades A. thaliana under hydroponiska förhållanden, och sedan inokulerades bakterieceller i rhizosfären vid en slutlig koncentration av 0,01 OD600. De infekterade rotvävnaderna skördades 2 dagar efter inokulering och tvättades i sterilt vatten för att avlägsna de okoloniserade bakteriecellerna. Vidare samlades bakterieceller koloniserade på roten, späddes ut i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert och pläterades på ett Luria-Bertani (LB) agarmedium. Efter inkubation vid 37 °C i 10 timmar räknades och normaliserades enstaka kolonier på LB-plattor för att bestämma vilka bakterieceller som koloniserades på rötterna.
Denna metod är mycket användbar, har god repeterbarhet och är mer lämplig för noggrann bestämning av bakteriell kolonisering av rhizosfären.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Steril hydroponisk odling av A. thaliana
- Förbered A. thaliana plantor.
- Förbered odling A. thaliana plantmedium som består av 1/2 MS-medium (Murashige och Skoog) med 2 % (vikt/volym) sackaros och 0,9 % (vikt/volym) agar.
- Häll det förberedda steriliseringsmediet i sterila fyrkantiga petriskålar (13 cm x 13 cm) innan det stelnar. Undvik lufttorkning för att bibehålla luftfuktigheten.
- Sänk ner A. thaliana-frön i ett 2 ml mikrocentrifugrör fyllt med 1 ml sterilt vatten vid 4 °C i över 12 timmar, och sterilisera sedan fröna med 1 ml 2 % (vol/vol) NaClO i 2 minuter.
- Tvätta fröna noggrant med sterilt vatten sex gånger för att avlägsna NaClO-lösningen. Så fröna på petriskålar med MS-agar medium med en steril spets på 1 ml.
- Försegla petriskålarna med medicinsk tejp som andas och placera dem vertikalt i en lätt inkubator för att växa i 1 vecka. Ställ in ljusinkubatorns dag/natt-förhållande på 16 h/8 h, håll temperaturen på 23 °C och luftfuktigheten på 40%-60%.
- Transplantation A. thaliana.
- Skär 5 mm hål på cellfärgning med en porstorlek på 40 μm och sterilisera dem.
- Transplantera tre 7 dagar gamla A. thaliana-växter genom hålen i en cellsil och lägg dem i en 6-hålsplatta som innehåller 3 ml steril flytande 1/2 MS-medium med 0,5 % sackaros.
- Placera plattorna med 6 brunnar i en lätt inkubator (figur 1A) och inkubera i 10 dagar.
2. Odling och inokulering av bakterier
- Förbered bakteriesuspension för inokulering.
- För Bacillus velezensis, inokulera bakterieceller i ett sterilt LB-medium och inkubera vid 37 °C med skakning vid 170 rpm tills det når OD600 på 0,8-1,2.
- Samla in bakteriecellerna genom centrifugering vid 6000 x g i 2 minuter och återsuspendera cellerna i PBS-buffert (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Upprepa centrifugeringen och resuspenderandet 3 gånger för att avlägsna LB-mediet och de bakteriella metaboliterna.
- Suspendera bakteriecellerna i ett nytt 1/2 MS-medium vid en slutlig koncentration av OD600 0,01. Inokulera bakteriesuspensionerna på 6-brunnsplattorna som växer A. thaliana-plantor , placera 6-hålsplattorna i ljusinkubatorn och odla dem i 2 dagar.
3. Mätning av bakterier koloniserade på rötter
- Skörda rotvävnaden och platta de koloniserade cellerna.
OBS: Alla steg bör utföras under gnotobiotiskt tillstånd- Väg de 2 ml rören och registrera vikten som W0.
- Skörda de samodlade rotvävnaderna från A. thaliana och tvätta dem i sterilt vatten 3 gånger. Placera roten på filterpapper för att ta bort överflödigt vatten.
- Lägg roten i det vägda mikrocentrifugröret, väg rötterna tillsammans med röret och registrera det som W1.
- Tillsätt 1 ml PBS till varje rör och virvla rören i 8 minuter vid maximal hastighet.
- Späd suspensionerna med de insamlade rotkoloniserade bakteriecellerna till 1 x 10-1-1 x 10-4 (beroende på bakteriernas koloniseringsförmåga). Sprid ut de utspädda bakteriesuspensionerna på plattor som innehåller LB-agarmedium och inkubera vid 37 °C i 10 timmar.
- Räkna kolonierna och normalisera data.
- Räkna bakteriekolonierna på LB-plattor.
- Beräkna CFU:erna enligt motsvarande utspädning och normalisera data med färskvikt rot (W1-W 0). De slutliga resultaten indikerar antalet bakterieceller som koloniserats per gram rot 2 dagar efter inokulering (Figur 1B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att testa noggrannheten i bakteriekoloniseringsförmågan som detekteras med denna metod i A. thaliana rhizosfären, inokulerade vi Bacillus velezensis SQR9 WT och en härledd mutant Δ8mcp i A. thaliana rhizosfär separat. Δ8mcp är en mutant som saknar alla kemoreceptorkodande gener, och den har en signifikant minskad kolonisering6. Vi mätte deras kolonisering 2 dagar efter inokulering med den nuvarande rotkoloniseringsanalysen. Resultaten visade en signifikant rotkoloniseringsreduktion av Δ8mcp, vilket indikerar att detta tillstånd och denna metod effektivt mäter bakteriekolonisationen (Figur 1C).
Figur 1: Odling av A. thaliana och rotkolonisering av Bacillus velezensis SQR9 och Δ8mcp. (A) Ovanifrån av den 7 dagar gamla A. thaliana som växer i plattor med 6 brunnar med cellfärgning i hydroponiskt tillstånd. (B) Sidovy av 7 dagar gamla A. thaliana som växer i plattor med 6 brunnar, där varje brunn innehåller 3 plantor. (C) Kolonisering av B. velezensis vildtyp SQR9 och Δ8mcp mätt med hjälp av den presenterade analysen. Sex replikat inkluderades, och datan presenteras som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att uppnå god reproducerbarhet finns det fyra kritiska steg för koloniseringsdetekteringsprocessen för detta protokoll. För det första är det nödvändigt att se till att antalet inokulerade bakterieceller är exakt detsamma i varje experiment. För det andra är det också nödvändigt att kontrollera rengöringsintensiteten för de icke-koloniserade bakterierna med sterilt vatten. För det tredje måste varje provutspädningsprocess virvlas innan den utförs för att låta provet vara i ett fullständigt blandningstillstånd för att undvika absorptionsfel på grund av bakteriernas egenskaper som är lätta att sjunka in i mikrocentrifugröret. Därför rekommenderar vi att du använder ett virvelinstrument för att blanda den bakteriella suspensionen före varje absorption. För det fjärde bör aseptik strikt säkerställas under alla operationer som använder denna metod för att undvika risk för kontaminering.
Denna metod används för att bestämma vilka bakterier som koloniserats på rotytan. Förutom att rotytebakterier, endofytiska bakterier och svampar också koloniserar växtens rhizosfär7. Koloniseringsförmågan hos endofytiska bakterier kan fortfarande detekteras med hjälp av protokollet som beskrivs i detta dokument, men rotvävnaden bör malas för att frigöra endofytiska bakterier. De endofytiska svamparna skiljer sig dock från bakterier. De flesta av de vanliga metoderna använder transmissionselektronmikroskopi (TEM) för att observera tillväxten av hyfer, vilket är en kvalitativ detektionsmetod som liknar fluorescerande märkningsbakterier för visualisering8.
Vid jämförelse av kolonisationen av olika stammar bör de inte inokuleras i en 6-håls platta för att undvika påverkan av de bakteriella flyktiga föreningarna9 och växtflyktiga föreningarna10,11. Vi valde 2-dagars postinokulering för att detektera rot eftersom kolonisationen av SQR9 nådde maximum mellan 2 och 4 dagar; Tiden för att upptäcka bakteriekolonisationen kan justeras enligt stammarna.
Jämfört med andra beskrivna metoder är denna metod exakt och lätt att använda. Till exempel har metoden som beskrivs av Noam et al. den fastväxande arabidopsis inokuleras med bakterier omedelbart när den transplanteras till hydroponiskt tillstånd12,13. Här föreslår vi att bakterierna bör inokuleras till rhizosfären efter flera dagars transplantation för att undvika påverkan av växtens anpassning till den förändrade tillväxtmiljön. Metoden som beskrivs i denna studie är också bra för växter att frisätta rotexsudat, vilket påverkar kolonisationen.
För att låta växtskotten växa separat i luften och helt borta från vätskenedsänkningen gjorde vi några mindre modifieringar och bearbetning på cellfärgningsmedlet för att göra dem tillgängliga för denna hydroponiska metod. Dessutom är denna metod mer lämplig för noggrann bestämning av bakteriekolonisering i små mängder men inte för stora mängder rotexsudat som samlats in i hydrokultur14. Det är viktigt att notera att denna metod är modifierad baserat på tidigare publicerade studier 12,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter med innehållet i denna artikel.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Natural Science Foundation of China (32370135), innovationsprogrammet för den kinesiska akademin för jordbruksvetenskap (CAAS-CSAL-202302), vetenskaps- och teknikprojektet vid Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M.
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -E., Won, M. -H., Jeong, M. -I., Oh, K. -K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
