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Summary
为了研究恐惧环境中的飞行行为，我们引入了一种改进的恐惧条件反射协议。该协议确保小鼠在恐惧条件反射的线索呈现期间始终表现出飞行行为。
Abstract
在威胁情况下，防御行为的适当表现对于生存至关重要。流行的理论认为，主动防御行为，如跳跃或快速飞奔，是在高威胁迫在眉睫或实际威胁下表达的，而被动防御行为，如冻结，是在预测威胁时表达的，但威胁迫在眉睫相对较低。在经典的恐惧条件反射中，受试者通常表现出冻结作为条件反射的防御反应，在大多数情况下几乎没有主动防御行为的表达。在这里，我们为小鼠引入了一种改进的恐惧条件反射程序，以观察从冻结到飞行的转变，反之亦然，涉及五对重复的条件刺激（CS;连续音调，8 kHz，95 dB SPL（声压级））和无条件刺激（US;脚电击，0.9 mA，1.0 s）在两天内。这种改良的恐惧调节程序需要相对大量的调节课程和调节日，但不需要高强度的足部电击来适度表达飞行行为。使用相同的上下文进行条件反射和突出的 CS 演示对于引发飞行行为至关重要。这种改良的恐惧条件反射程序是观察小鼠积极防御行为的可靠方法，为阐明恐惧环境中此类行为的精细机制和特征提供了机会。
Introduction
在威胁情况下适当选择防御行为对于所有动物的生存至关重要。防御行为根据威胁接近程度逐渐从一种转变为另一种，例如冻结和飞行行为之间的过渡 1,2,3。在各种精神障碍中经常观察到这些行为的失调4.创伤后应激障碍 （PTSD） 是一种以夸张的防御行为为特征的疾病，例如对非威胁性刺激的恐慌反应4.
啮齿动物的经典恐惧条件通常用作 PTSD5、6、7 的模型，但啮齿动物在此模型中不表达逃跑（恐慌样）行为8。因此，经典的恐惧条件反射模型，通常被称为“啮齿动物创伤后应激障碍模型”，对人类创伤后应激障碍缺乏面部有效性，特别是在捕捉逃跑或恐慌样症状方面，这些症状尚未得到充分研究。
最近，几种改进的恐惧调节方案已成功证明啮齿动物受试者在这些过程中表现出飞行行为。例如，条件刺激 （CS） 和无条件刺激 （US） 在一天内重复关联 7 次，使雌性大鼠表现出类似于飞行行为的飞奔行为9。在使用连续复合刺激（SCS;由音调和噪音组成）的为期两天的恐惧条件反射中，小鼠在SCS演示的噪音部分开始表现出飞行行为10,11,12。SCS方法的详细说明在协议报告13中提供。用SCS进行为期三天的恐惧调节也对大鼠诱导飞行行为起作用14。但是，这些新协议有一些局限性。例如，使用串行提示表示不允许排除接近估计对防御行为的影响。在大鼠中CS-US关联七次的情况下，大多数飞行反应是在雌性而不是雄性中观察到的。
鉴于这些考虑，我们为小鼠引入了一种改进的恐惧条件反射方案，以研究恐惧环境中的飞行行为。雄性小鼠在我们改良的恐惧条件反射期间始终表现出飞行行为。在此协议中，突出音调用作 CS 而不是 SCS。此外，每天至少需要五对 CS-US，持续至少两天，以及条件环境的恐惧增强。该协议为研究飞行行为提供了另一种选择，根据研究目的补充了以前的协议。
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Protocol
该协议是根据日本生理学会的指导原则进行的，并获得了金泽医科大学动物护理委员会（2021-32）的批准。所有程序均按照ARRIVE指南进行。该研究使用了成年雄性 C57BL/6J 小鼠（3-6 个月大），并且先前证实这些小鼠表现出本手稿中描述的飞行行为15.
1.动物准备
- 群居小鼠（每个笼子3-4只;保持在23-27°C;在12小时的光/暗循环下;提供自由获取食物和水）直到实验开始。
- 在进行这种改良的恐惧调节之前，将每只小鼠单独饲养在有机玻璃笼子（14 cm × 21 cm × 12 cm）中至少 3 天。
2. 设置工具/设备
- 恐惧调节箱（图1A）
- 使用封闭在消音盒（67 厘米× 53 厘米× 55 厘米）中的恐惧调节室（25 厘米× 25 厘米× 25 厘米）（见 材料表）。
- 需要两个上下文（A 和 B）。对于上下文 A，通过将白色塑料纸板与黑色胶带（3 厘米宽，一块板上有 4 个）连接在墙上创建黑白条纹。地板使用白色光滑的塑料板。
- 每次疗程前用庚醇（1%）擦拭墙壁和地板。
注意： 不使用主动通风系统。在疗程结束时用酒精清洁可减少庚醇气味。 - 对于上下文 B，通过移除上下文 A 中使用的板，使墙壁的外观完全黑色。地板是网格地板。
注意： 除了用于清洁的轻微酒精气味外，没有特定的气味。 - 使用头顶白色发光二极管（LED，240勒克斯）照亮实验箱（见 材料表）。
- 令人 震惊
- 将扰频减震器（见材料表）连接到由不锈钢棒组成的网格地板。这用于提供脚部震动。足部电击强度设定为0.9 mA，遵循常见的恐惧调节方法10,11,12,13。
- 音频发生器
- 在天花板上放置一个扬声器（参见 材料表）。所有声学刺激都被放大。
- 使用 1/4 英寸麦克风对每个刺激的整体振幅进行数字修改和校准，以产生声压级 （SPL，re： 20 μ Pa）。通过此扬声器呈现连续的音调爆发。
注意：校准声音扬声器对于检查声音刺激在这种改良的恐惧条件反射期间对防御行为的良好影响至关重要。
- 传感器
- 将测试室的地板放在传感器上（参见 材料表）以检测振动。来自换能器的信号被传输到采样频率为 8 kHz 的声卡，以记录行为振动。
- 摄像机
- 将CMOS相机（见 材料表）放置在天花板上，以跟踪拍摄对象的运动并将声音记录在调节箱中。
- 触发系统
- 使用声音软件（见 材料表）在预定的时间触发音调或脚震。
注意：任何市售的刺激器都适用于此。
- 使用声音软件（见 材料表）在预定的时间触发音调或脚震。
3.行为实验
- 计划为期四天的恐惧调节程序：习惯化（1 天，5 次试验）、条件反射（2 天，每次 5 次试验）和测试/灭绝课程（1 天、5 或 15 次试验）。试验间隔在60-75秒之间变化（图1B）。
注意：优选地，在一组中包括十个或更多受试者，以获得可靠的行为倾向。根据研究的目的，需要两组或三组。- 在调节会话期间，在条件刺激 （CS） 终止后立即呈现无条件刺激 （US） （1 s， 0.9 mA）（连续音调突发，8 kHz，20 s，95 dB SPL），如 图 1B 所示。在调理日内提供五对 CS-US。
- 在第 5 次脚电击结束后，将对象留在上下文中 1 分钟，然后将其放回主笼。每次行为测试后，用 70% 酒精擦拭腔室进行清洁。
注意：CS 和 US 强度可以根据研究目的进行修改。以前的报告表明，较强的 CS 强度比较软的 CS 强度触发更积极的防御行为15。调理天数也可以延长。
- 按照下面提到的时间表在 CS 演示期间诱导飞行行为。
注意：本实验中使用了CS（95 dB SPL）和US（0.9 mA）。- 在第 1 天，让受试者在上下文 A 中接受 5 项单独 CS 试验。
- 在第 2 天和第 3 天，在上下文 B 中对受试者进行 5 项 CS-US 关联试验。
- 在第 4 天，让受试者在上下文 B 中接受 5 次单独 CS 试验以进行召回会议。在测试记忆消退的情况下，让受试者单独进行 15 次 CS 试验。
注意：要测试内存稳定性，将消光会话延长 2-3 天会有所帮助。此外，在一周后而不是在第 4 天测试内存可以进一步确认内存稳定性。
4. 防御行为分析
注意：分析了 CS 演示期间的运动、冻结百分比和跳跃次数。详情如下所述。如果可能的话，以双盲方式进行分析会更好。
- 使用视频中记录的音调开始同步视频中事件的时间和刺激的时间（CS 和 US）。
- 利用自定义代码根据帧中主体轮廓的质心差异来计算小鼠的平均运动和总运动。
注意：由于运动速度取决于短片的采样率，因此此测量使用任意单位。 - 要测量冻结百分比，请及时使用换能器信号。
- 使用 20-500 Hz 带通滤波器对传感器信号进行预处理。
- 及时计算每个 50 ms bin的传感器信号的均方根幅度。
- 设置信号幅度的阈值以检测不动时间。不动的持续时间是低于阈值超过 1 秒的信号周期。
- 通过观看视频手动测量冻结的持续时间。
- 通过比较手动测量的冻结百分比和从换能器信号计算的百分比来调整冻结信号幅度的阈值。
- 计算从视频文件中手动跳转的次数。
注意：计算飞镖的数量也有助于评估飞行响应。
5. 统计分析
- 将统计显著性设置为 p < 0.05。
- 对于多组和多个因素之间的比较，请进行多因素方差分析，然后进行事后检验。如果测试了调节计划的特定日期，请执行多个比较测试或排列测试。
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Representative Results
按照 图1C所示的时间表，在雄性小鼠（C57BL / 6J;3-6个月大）中用改良的恐惧条件获得的结果。该实验旨在研究条件环境如何影响飞行行为的表达。分配了两组：第 1 组 （n = 10） 和第 2 组 （n = 10）。本实验中使用了 CS （95 dB SPL） 和 US （0.9 mA）。
在第 1 天，所有小鼠在上下文 A 中单独暴露于 5 项条件刺激 （CS） 试验。在此之后，所有小鼠在第 2 天和第 3 天在上下文 B 中接受 5 次 CS 无条件刺激 （US） 试验。在第 4 天，第 1 组在上下文 B 中进行了 5 次单独 CS 的召回试验，而第 2 组在上下文 A 中进行了测试。
第 1 组的受试者表现出明显的飞行行为，例如跳跃或短距离飞奔，尤其是在第 3 天和第 4 天的 CS 演示期间（见 图 2A、B）。CS 演示期间的总动作和跳跃次数都随着条件反射的进展而增加（图 2A、B）。CS演示期间的冷冻在第2天显示增加，并在随后的试验中保持相对恒定（图2B）。受试者在 CS 演示开始时表现出增强的运动，并在整个 CS 演示过程中始终表现出飞行行为（图 2A）。
第 2 组的受试者在第 2 天和第 3 天表现出与第 1 组几乎相同的强大飞行行为（见 图 2A）。然而，在第 4 天的情境 B 中，即无条件情境，第 2 组的受试者在 CS 演示期间没有表现出任何飞行行为（图 2A、B）。第 4 天 CS 期间的运动比较表明，第 1 组的运动量明显多于第 2 组（见 图 2C; 排列测试;G1 vs. G2，p = 0.014）。此外，第4天CS期间冷冻的比较显示两组之间有统计学上的显着差异（见 图2D;G1 vs.G2， 第 < 0.000）。关于第4天的跳跃，第1组比第2组表现出更多的跳跃（见 图2E;排列测试;G1 vs.G2，p = 0.034）。这些发现表明，在恐惧条件反射期间由音调触发的飞行行为是依赖于上下文的。
图1：改良恐惧条件反射实验的设计。 （A） 显示了实验背景 A 和 B 的示意图。（B） CS 和 US 演示文稿的组成。CS 是 8 kHz 连续音调突发（20 秒），US（脚震，1 秒）在 CS 终止后立即传递。试验间隔为60-75秒。 （C）改良的恐惧条件反射实验的时间表。该图修改自Furuyama et al.15。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：表达飞行行为的基本上下文。 （A） 显示了每个条件在白天围绕 CS 演示的平均运动。灰色阴影的句点表示 CS 演示，红色线表示美国演示。灰线表示每条迹线均值的标准误差。在第 3 天，在 G1 和 G2 的 CS 演示期间动作增加。在第 4 天，在 G1 的 CS 演示期间增加了运动。（B，议案）绘制了每个试验的 CS 演示期间的平均总运动。（B，冻结）绘制了每个试验的CS演示期间的平均冷冻百分比。（B，跳跃）绘制了每个试验的 CS 演示期间的平均跳跃。G1 在第 4 天的 CS 演示中跳跃。（C） 第4天动议的比较。G1 比 G2 移动得更多。（D） 第 4 天冷冻百分比的比较。G2 比 G1 表现出更多的冻结。（E） 比较第 4 天的跳跃总数。G1 比 G2 跳得更多。水平红色条表示平均值，垂直红色条表示面板 （CE） 中每组的 SEM。*p < 0.05。该图修改自Furuyama et al.15。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
本文介绍的改进的恐惧条件协议是一种在恐惧环境中研究飞行行为的稳定方法。通过采用这种协议，我们发现小鼠在恐惧环境中的飞行行为是由显着刺激触发的，并且取决于上下文。飞行行为的特征没有得到很好的研究，因为没有合适的协议来观察飞行行为。该协议将是研究恐惧环境中积极防御行为的合适方法之一。
最近，除了本协议之外，还引入了一些协议。在小鼠和大鼠的线索呈现期间，用SCS进行多天的调节稳定地诱导飞行行为10,11,12,13,14。此外，一天内七次重复的CS-US关联让雌性大鼠表现出飞奔，这是一种飞行行为9。这些方案都是可靠的，与这里介绍的方案相同，尽管这些方案（包括目前的方案）根据每项研究的目的各有优缺点。例如，受试者可以通过 SCS 演示来估计威胁的接近程度，SCS 演示由两个连续刺激和足部电击组成。如果一项研究旨在调查 CS 特征对飞行行为表达的纯粹影响，那么 SCS 协议并不是最好的。但是，使用 SCS 协议，冻结和飞行之间的过渡总是发生在短时间内（20 秒）。因此，对于一项专注于从被动防御行为到主动防御行为过渡的研究，反之亦然，SCS协议效果最好。使用七次CS-US关联的方案最适合研究雌性大鼠的主动防御行为，而对于雄性大鼠，则需要进行一些修改。
该协议使用突出的纯音呈现而不是 SCS;因此，该协议适用于研究各种CS（具有各种包络的音调或音调形状，如斜坡/阻尼）对触发飞行行为的影响。我们已经证明，至少音调强度（CS 字符之一）对飞行行为的表达有关键影响15.然后，预计各种 CS 特征会对飞行行为产生不同的影响。我们协议中最重要的一点是校准扬声器以呈现音调刺激。通常，恐惧调节盒中的市售扬声器没有经过很好的校准，参数也不可靠。强烈建议使用经过精细校准的可靠扬声器进行此实验。关于调理天数，可以通过减少一天的试验次数来延长训练天数。例如，这里介绍的方案使用每天五次试验的时间表，持续两天。取而代之的是，每天四次试验，持续三天也有效。时间表可以根据每项研究的目的进行修改。
最后，这些协议中引入的主动防御行为与主动回避（shuttle avoidance）实验中观察到的主动防御行为不同。主动回避时的逃跑行为更像是习惯，一旦被学习，受试者就会继续逃跑3,16,17，而该协议中的飞行看起来像是恐慌行为，一旦它注意到没有美国遵循CS 10,11,12,13,14,15，受试者就会停止表现出飞行行为.此外，这些类似恐慌的逃跑行为与恐惧环境中舔舐抑制中报告的行为抑制不同18,19，而两者都是恐惧诱发的防御行为。这些类似恐慌的飞行行为被忽视，也没有得到很好的研究。通过使用新协议9、10、11、12、13、14、15（包括目前的协议），将阐明恐慌行为的神经相关性。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了 KAKENHI Grants JP22K15795（T.F.）、JP22K09734（N.K.）、JP21K07489（R.Y.）、金泽医科大学（C2022-3、D2021-4，R.Y.）和内藤基金会（T.F.）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Audio speaker | Fostex | FT17H | |
| Amplifier | Sony | TA-F500 | |
| CMOS camera | Sanwa Supply Inc. | CMS-V43BK | |
| Fear conditioning chamber | Panlab S.L.U. | LE116 | |
| Food pellets | Nosan | Labo MR standard | |
| LED | Yamazen | LT-B05N | |
| Microphone | ACO | type 4156N | |
| Scramble shocker | Panlab S.L.U. | LE 100-26 | |
| Sound card | Behringer | UMC202 | |
| Sound software | Syntrillium Software | Cool Edit 2000 | |
| Transducer | Panlab S.L.U. | LE 111 |
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本月在JoVE第202期，Erratum
Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 05/17/2024.
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An erratum was issued for: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice. The Abstract section was updated from:
The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.4 or 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.
to:
The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.
