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Conditionnement de peur modifié pour induire des comportements de fuite chez la souris

Published: December 15, 2023 doi: 10.3791/66266
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Pour étudier les comportements de vol dans un contexte de peur, nous introduisons un protocole de conditionnement de peur modifié. Ce protocole garantit que les souris présentent systématiquement des comportements de vol lors de la présentation des signaux dans le conditionnement de la peur.

Abstract

La manifestation appropriée d’un comportement défensif dans une situation menaçante est essentielle à la survie. La théorie dominante suggère qu’un comportement défensif actif, tel que sauter ou s’élancer rapidement, s’exprime sous une menace élevée ou une menace réelle, tandis qu’un comportement défensif passif, tel que le gel, est exprimé lorsque la menace est prédite, mais que l’imminence de la menace est relativement faible. Dans le conditionnement classique de la peur, les sujets présentent généralement le gel comme une réponse défensive conditionnée, avec peu d’expression de comportement défensif actif dans la plupart des cas. Ici, nous introduisons une procédure modifiée de conditionnement de la peur pour que les souris observent la transition du gel au vol et vice versa, impliquant cinq appariements répétitifs de stimuli conditionnés (CS ; tonalité continue, 8 kHz, 95 dB SPL (niveaux de pression acoustique)) et de stimuli non conditionnés (US ; choc du pied, 0,9 mA, 1,0 s) sur deux jours. Cette procédure modifiée de conditionnement de la peur nécessite un nombre relativement important de séances de conditionnement et de jours de conditionnement, mais ne nécessite pas de choc du pied de haute intensité pour une expression modeste du comportement de vol. L’utilisation du même contexte pour le conditionnement et les présentations CS saillantes est essentielle pour susciter des comportements de vol. Cette procédure de conditionnement de la peur modifiée est une méthode fiable pour observer les comportements défensifs actifs chez la souris, offrant l’occasion d’élucider les mécanismes fins et les caractéristiques de ces comportements dans un contexte craintif.

Introduction

La sélection appropriée des comportements défensifs dans des circonstances menaçantes est cruciale pour la survie de tous les animaux. Les comportements défensifs passent progressivement de l’un à l’autre en fonction de la proximité de la menace, comme la transition entre les comportements de gel et de fuite 1,2,3. La dérégulation de ces comportements est souvent observée dans divers troubles mentaux4. Le trouble de stress post-traumatique (SSPT) est l’un de ces troubles caractérisés par des comportements défensifs exagérés, comme des réponses de panique à des stimuli non menaçants4.

Le conditionnement classique de la peur chez les rongeurs est couramment utilisé comme modèle pour le SSPT 5,6,7, mais les rongeurs n’expriment pas de comportements de fuite (de panique) dans ce modèle8. Par conséquent, le modèle classique de conditionnement de la peur, souvent appelé « modèle de SSPT chez les rongeurs », manque de validité apparente pour le SSPT chez l’homme, en particulier pour capturer les symptômes de fuite ou de panique, qui n’ont pas été bien étudiés.

Récemment, plusieurs protocoles modifiés de conditionnement de la peur ont démontré avec succès que les sujets rongeurs présentent un comportement de vol pendant ces procédures. Par exemple, les associations répétitives d’un stimulus conditionné (CS) et d’un stimulus inconditionné (US) sept fois par jour ont permis aux rats femelles de présenter des comportements de dardage similaires aux comportements de vol9. Dans des conditionnements de peur de deux jours utilisant des stimuli composés en série (SCS ; composé de tonalité suivie de bruit), les souris ont commencé à montrer des comportements de vol pendant la partie bruit des présentations SCS 10,11,12. La description détaillée de la méthode SCS est fournie dans un rapport de protocole13. Un conditionnement de peur de trois jours avec SCS a également fonctionné chez les rats pour induire des comportements de fuite14. Cependant, ces nouveaux protocoles ont certaines limites. Par exemple, l’utilisation de la présentation d’indices en série ne permet pas d’exclure l’influence de l’estimation de la proximité sur le comportement défensif. Dans le cas d’une association sept fois plus importante de CS-US chez le rat, la majorité des réponses de fuite ont été observées chez les femelles plutôt que chez les mâles.

À la lumière de ces considérations, nous introduisons un protocole modifié de conditionnement de la peur pour les souris afin d’étudier les comportements de vol dans un contexte de peur. Les souris mâles présentent systématiquement un comportement de vol pendant notre conditionnement de peur modifié. Dans ce protocole, le ton saillant est utilisé comme CS au lieu de SCS. De plus, un minimum de cinq paires de CS-US en une journée pendant au moins deux jours, ainsi qu’une potentialisation de la peur par le contexte conditionné, est nécessaire. Le protocole offre une autre option pour étudier les comportements de vol, en complément des protocoles précédents, en fonction de l’objectif de la recherche.

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Protocol

Ce protocole a été mené conformément aux principes directeurs de la Société de physiologie du Japon et a reçu l’approbation du Comité de protection des animaux de l’Université médicale de Kanazawa (2021-32). Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives ARRIVE. Des souris C57BL/6J mâles adultes (âgées de 3 à 6 mois) ont été utilisées pour l’étude, et il a été précédemment confirmé que ces souris présentaient les comportements de vol décrits dans ce manuscrit15.

1. Préparation des animaux

  1. Souris domestiques de groupe (3-4 par cage ; maintenue à 23-27 °C ; sous un cycle lumière/obscurité de 12 heures ; accès ad libitum à la nourriture et à l’eau) jusqu’au début des expériences.
  2. Hébergez individuellement chaque souris dans une cage en plexiglas (14 cm × 21 cm × 12 cm) pendant au moins 3 jours avant de subir ce conditionnement de peur modifié.

2. Mise en place des outils/équipements

  1. Boîte de conditionnement de la peur (Figure 1A)
    1. Utilisez une chambre de conditionnement de la peur (25 cm × 25 cm × 25 cm) enfermée dans une boîte insonorisée (67 cm × 53 cm × 55 cm) (voir la table des matières).
    2. Deux contextes (A et B) sont requis. Pour le contexte A, créez des bandes noires et blanches sur les murs en attachant du carton plastique blanc avec des rubans noirs (3 cm de largeur, 4 sur une planche). Utilisez un panneau en plastique lisse blanc pour le sol.
    3. Essuyez les murs et le sol avec de l’Heptanol (1%) avant chaque séance.
      REMARQUE : Aucun système de ventilation actif n’est utilisé. Le nettoyage à l’alcool à la fin de la séance diminue l’odeur d’heptanol.
    4. Pour le contexte B, rendez l’apparence des murs entièrement noire en enlevant la planche utilisée dans le contexte A. Le sol est un sol en grille.
      REMARQUE : Aucune odeur spécifique n’est présentée autre qu’une légère odeur d’alcool pour le nettoyage.
    5. Éclairer la boîte expérimentale à l’aide d’une diode électroluminescente blanche (DEL, 240 lux) (voir tableau des matériaux).
  2. Shocker
    1. Connectez un amortisseur de brouillage (voir Tableau des matériaux) à un plancher grillagé composé de tiges en acier inoxydable. Ceci est utilisé pour fournir des chocs au pied. L’intensité du choc du pied a été fixée à 0,9 mA en suivant les méthodes courantes de conditionnement de la peur 10,11,12,13.
  3. Générateur audio
    1. Placez un haut-parleur (voir Tableau des matériaux) au plafond. Tous les stimuli acoustiques sont amplifiés.
    2. Modifiez et calibrez numériquement les amplitudes globales de chaque stimulus pour obtenir des niveaux de pression acoustique (SPL, re : 20 μ Pa) à l’avant de 5 cm de l’enceinte avec un microphone de 1/4 de pouce. Présentez une tonalité continue éclater à travers ce haut-parleur.
      REMARQUE : Le calibrage du haut-parleur sonore est crucial pour examiner l’impact fin du stimulus sonore sur les comportements défensifs pendant ce conditionnement de peur modifié.
  4. Transducteur
    1. Placez le sol de la chambre d’essai sur un transducteur (voir Tableau des matériaux) pour la détection des vibrations. Le signal du transducteur est transmis à une carte son avec une fréquence d’échantillonnage de 8 kHz pour enregistrer les vibrations comportementales.
  5. Caméra vidéo
    1. Placez une caméra CMOS (voir Tableau des matériaux) au plafond pour suivre les mouvements du sujet et enregistrer le son dans la boîte de conditionnement.
  6. Système de déclenchement
    1. Utilisez un logiciel de sonorisation (voir Tableau des matériaux) pour déclencher des tonalités ou des chocs de pied à des moments programmés.
      REMARQUE : N’importe quel stimulateur disponible dans le commerce fonctionnera pour cela.

3. Expérience comportementale

  1. Prévoyez quatre jours de procédures de conditionnement de la peur : habituation (1 jour, 5 essais), conditionnement (2 jours, 5 essais chacun) et séances de test/extinction (1 jour, 5 ou 15 essais). Les intervalles entre les essais variaient entre 60 et 75 s (figure 1B).
    REMARQUE : De préférence, incluez dix sujets ou plus dans un groupe pour obtenir des tendances comportementales fiables. Deux ou trois groupes sont nécessaires selon l’objectif de l’étude.
    1. Pendant la séance de conditionnement, présentez le stimulus non conditionné (US) (1 s, 0,9 mA) immédiatement après la fin du stimulus conditionné (CS) (rafale de tonalité continue, 8 kHz, 20 s, 95 dB SPL) comme indiqué à la figure 1B. Livrez cinq paires CS-US en une journée de conditionnement.
    2. Après la fin du 5ème choc au pied, laissez le sujet dans le contexte pendant 1 min avant de le remettre dans la cage d’origine. Essuyez la chambre avec de l’alcool à 70 % pour le nettoyer après chaque test comportemental.
      REMARQUE : L’intensité de la CS et de l’échographie peut être modifiée en fonction de l’objectif de l’étude. Des rapports antérieurs ont montré qu’une intensité plus forte de CS déclenche des comportements défensifs plus actifs que des comportements plus doux15. Les journées de conditionnement peuvent également être prolongées.
  2. Induire des comportements de vol lors des présentations CS en suivant le calendrier mentionné ci-dessous.
    NOTE : UN CS (95 dB SPL) et un US (0,9 mA) sont utilisés dans cette expérience.
    1. Le jour 1, exposer les sujets à 5 essais de CS seul dans le contexte A.
    2. Les jours 2 et 3, conditionner les sujets avec 5 essais d’association CS-US dans le contexte B.
    3. Le jour 4, exposer les sujets à 5 essais de CS seuls pour la séance de rappel dans le contexte B. En cas de test d’extinction de la mémoire, exposer les sujets à 15 essais de CS seuls.
      REMARQUE : Pour tester la stabilité de la mémoire, prolonger les sessions d’extinction de 2 à 3 jours sera utile. De plus, tester la mémoire une semaine plus tard au lieu du jour 4 peut fournir une confirmation supplémentaire de la stabilité de la mémoire.

4. Analyse des comportements défensifs

REMARQUE : Le mouvement, le pourcentage de gel et le nombre de sauts pendant les présentations CS sont analysés. Les détails sont décrits ci-dessous. Si possible, il serait préférable d’analyser en double aveugle.

  1. Synchronisez les timings des événements dans la vidéo et les timings des stimuli (CS et US) en utilisant le début du ton enregistré dans la vidéo.
  2. Utilisez un code personnalisé pour calculer les mouvements moyens et totaux des souris en fonction de la différence du centre de masse de la silhouette du sujet à travers les images.
    REMARQUE : Une unité arbitraire est utilisée pour cette mesure car la vitesse de mouvement dépend de la fréquence d’échantillonnage du film.
  3. Pour mesurer le pourcentage de gel, utilisez le signal du transducteur dans le temps.
    1. Prétraiter les signaux du transducteur à l’aide d’un filtre passe-bande 20-500 Hz.
    2. Calculez l’amplitude quadratique moyenne du signal de la sonde dans le temps pour chaque intervalle de 50 ms.
    3. Définissez un seuil pour l’amplitude du signal afin de détecter la période d’immobilité. La durée de l’immobilité est la période du signal inférieure au seuil pendant plus de 1 s.
    4. Mesurez manuellement la durée du gel en regardant la vidéo.
    5. Ajustez le seuil d’amplitude du signal pour le gel en comparant le pourcentage de gel mesuré manuellement et le pourcentage calculé à partir du signal du transducteur.
  4. Comptez manuellement le nombre de sauts à partir de fichiers vidéo.
    REMARQUE : Le comptage du nombre de fléchettes sera également utile pour évaluer la réponse en vol.

5. Analyse statistique

  1. Fixez la signification statistique à p < 0,05.
  2. Pour les comparaisons entre plusieurs groupes et plusieurs facteurs, effectuez une ANOVA multidirectionnelle suivie de tests post-hoc. Si un jour spécifique du programme de conditionnement est testé, effectuez plusieurs tests de comparaison ou tests de permutation.

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Representative Results

Les résultats obtenus avec le conditionnement de peur modifié chez les souris mâles (C57BL/6J ; 3-6 mois) sont présentés, en suivant le calendrier indiqué à la figure 1C. L’expérience a été conçue pour étudier comment le contexte conditionné influence l’expression des comportements de vol. Deux groupes ont été affectés : le groupe 1 (n = 10) et le groupe 2 (n = 10). Un CS (95 dB SPL) et un US (0,9 mA) ont été utilisés dans cette expérience.

Le jour 1, toutes les souris ont été exposées à 5 essais de stimulus conditionnés (CS) seuls dans le contexte A. Ensuite, toutes les souris ont été conditionnées avec 5 essais de stimulus non conditionnés par CS (US) dans le contexte B les jours 2 et 3. Le jour 4, le groupe 1 a subi 5 essais de CS seul pour la session de rappel dans le contexte B, tandis que le groupe 2 a été testé dans le contexte A.

Les sujets du groupe 1 ont montré des comportements de vol prononcés, tels que des sauts ou des dards courts, en particulier lors des présentations CS des jours 3 et 4 (voir Figure 2A,B). Le nombre total de mouvements et le nombre de sauts pendant les présentations CS augmentaient avec la progression du conditionnement (Figure 2A,B). La congélation pendant les présentations de CS a montré une augmentation au jour 2 et est restée relativement constante dans les essais ultérieurs (Figure 2B). Les sujets ont montré des mouvements accrus au début de la présentation de la CS et ont constamment démontré des comportements de vol tout au long de la présentation de la CS (Figure 2A).

Les sujets du groupe 2 ont montré des comportements de vol robustes presque identiques à ceux du groupe 1 les jours 2 et 3 (voir figure 2A). Cependant, dans le contexte B du jour 4, qui était le contexte inconditionné, les sujets du groupe 2 n’ont montré aucun comportement de vol lors des présentations CS (Figure 2A, B). Les comparaisons des mouvements pendant la CS le jour 4 ont montré que le groupe 1 possédait une quantité de mouvement significativement plus importante que le groupe 2 (voir Figure 2C ; test de permutation ; G1 contre G2, p = 0,014). De plus, les comparaisons de la congélation pendant la CS au jour 4 ont montré des différences statistiquement significatives entre les deux groupes (voir Figure 2D ; test de permutation ; G1 contre G2, p < 0,000). En ce qui concerne les sauts du jour 4, le groupe 1 a présenté plus de sauts que le groupe 2 (voir figure 2E ; test de permutation ; G1 contre G2, p = 0,034). Ces résultats suggèrent que les comportements de fuite déclenchés par le ton pendant le conditionnement de la peur dépendent du contexte.

Figure 1
Figure 1 : La conception des expériences de conditionnement de la peur modifiées. (A) Des représentations schématiques des contextes expérimentaux A et B sont présentées. (B) La composition des présentations CS et américaines. Le CS était une rafale de tonalité continue de 8 kHz (20 s) et l’US (choc au pied, 1 s) était délivré immédiatement après la terminaison du CS. Les intervalles entre les essais étaient de 60 à 75 s. (C) Le calendrier des expériences de conditionnement de la peur modifiée. La figure est modifiée à partir de Furuyama et al.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Les contextes essentiels à l’expression des comportements de vol. (A) Les mouvements moyens de chaque condition autour de la présentation CS par jour sont montrés. Les points grisés représentent les présentations CS et les lignes rouges indiquent les présentations américaines. Les lignes grises indiquent l’erreur type des moyennes de chaque trace. Le jour 3, les motions ont augmenté lors des présentations CS en G1 et G2. Le jour 4, le mouvement a été augmenté lors des présentations CS en G1. (B, Motions) La moyenne du nombre total de mouvements pendant la présentation CS de chaque procès est tracée. (B, Congélation) Les pourcentages moyens de congélation pendant la présentation CS de chaque essai sont tracés. (B, sauts) Les sauts moyens lors de la présentation CS de chaque essai sont tracés. G1 a sauté lors des présentations CS le jour 4. (C) Comparaison des motions du jour 4. G1 a bougé plus que G2. (D) Comparaison du pourcentage de gel au jour 4. G2 a montré plus de congélation que G1. (E) Comparaison du nombre total de sauts du jour 4. G1 a sauté plus que G2. Les barres rouges horizontales indiquent les moyennes, et les barres rouges verticales indiquent le MEB de chaque groupe dans les panneaux (C-E). *p < 0,05. La figure est modifiée à partir de Furuyama et al.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le protocole modifié de conditionnement de la peur présenté dans cet article est une méthode stable pour étudier les comportements de vol dans un contexte de peur. En utilisant ce protocole, nous avons constaté que les comportements de vol des souris dans le contexte de la peur sont déclenchés par des stimuli saillants et dépendent du contexte. Les caractéristiques du comportement en vol n’ont pas été bien étudiées, car il n’y avait pas de protocole approprié pour observer les comportements en vol. Ce protocole sera l’une des méthodes appropriées pour étudier les comportements défensifs actifs dans un contexte de peur.

Récemment, plusieurs protocoles ont été introduits en plus du protocole actuel. Plusieurs jours de conditionnement avec SCS induisent de manière stable des comportements de vol lors des présentations de signauxchez les souris et les rats 10,11,12,13,14. De plus, sept associations répétitives CS-US dans une journée ont permis aux rats femelles de montrer des dards, une sorte de comportement de vol9. Ces protocoles sont tous fiables, tout comme celui présenté ici, bien que les protocoles, y compris le présent, présentent des avantages et des inconvénients en fonction de l’objectif de chaque étude. Par exemple, le sujet peut estimer la proximité des menaces avec la présentation SCS, qui est composée de deux stimuli en série suivis d’un choc du pied. Si une étude vise à étudier l’effet pur des caractéristiques CS sur l’expression des comportements de vol, le protocole SCS n’est pas le meilleur. Cependant, avec le protocole SCS, la transition entre le gel et le vol se produit toujours dans un court laps de temps (en 20 s). Par conséquent, pour une étude qui se concentre sur la transition d’un comportement défensif passif à un comportement défensif actif et vice versa, le protocole SCS fonctionne mieux. Le protocole utilisant sept fois l’association CS-US fonctionne mieux pour l’étude des comportements défensifs actifs des rats femelles, tandis que pour les rats mâles, certaines modifications seraient nécessaires.

Ce protocole utilise une présentation de son pur saillant au lieu du SCS ; ainsi, ce protocole convient à l’étude de l’effet de divers CS (tonalité avec diverses enveloppes ou formes de tonalité telles que rampe/amortissement) pour déclencher des comportements de vol. Nous avons démontré qu’au moins l’intensité tonale, l’un des caractères CS, a une influence critique sur l’expression des comportements de vol15. Ensuite, on s’attend à ce que diverses caractéristiques de CS aient des effets différents sur les comportements de vol. Le point le plus important de notre protocole est le calibrage du haut-parleur pour la présentation des stimuli sonores. Souvent, les haut-parleurs disponibles dans le commerce dans des boîtiers de conditionnement de la peur ne sont pas bien calibrés et les paramètres ne sont pas fiables. Il est fortement recommandé d’utiliser un haut-parleur fiable avec un calibrage fin pour cette expérience. Concernant les jours de conditionnement, il est possible d’allonger le nombre de jours d’entraînement en réduisant le nombre d’essais dans une journée. Par exemple, le protocole présenté ici utilisait un calendrier de cinq essais par jour pendant deux jours. Au lieu de cela, quatre essais par jour pendant trois jours fonctionnent également. Le calendrier pourrait être modifié en fonction de l’objectif de chaque étude.

Enfin, les comportements défensifs actifs introduits dans ces protocoles sont différents des comportements défensifs actifs observés dans l’expérience d’évitement actif (évitement de navette). Le comportement d’évasion lors de l’évitement actif ressemble plus à une habitude, et une fois qu’il est appris, le sujet continue à s’échapper 3,16,17, tandis que le vol dans ce protocole ressemble à un comportement de panique, et le sujet cesse de présenter des comportements de fuite une fois qu’il remarque qu’aucun US ne suit CS 10,11,12,13,14,15. De plus, ces comportements de fuite de type panique sont distincts de la suppression comportementale rapportée dans la suppression du léchage dans un contexte effrayant18,19, alors que les deux sont des comportements défensifs induits par la peur. Ces comportements de fuite de panique ont été négligés et mal étudiés. En utilisant les nouveaux protocoles 9,10,11,12,13,14,15, y compris le présent, le corrélat neuronal des comportements de panique sera élucidé.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par les subventions KAKENHI JP22K15795 (à T.F.), JP22K09734 (à N.K.), JP21K07489 (à R.Y.), Kanazawa Medical University (C2022-3, D2021-4, à R.Y.) et The Naito Foundation (à T.F.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Audio speaker Fostex FT17H
Amplifier Sony TA-F500
CMOS camera Sanwa Supply Inc. CMS-V43BK
Fear conditioning chamber Panlab S.L.U. LE116
Food pellets Nosan Labo MR standard
LED Yamazen LT-B05N
Microphone ACO type 4156N
Scramble shocker Panlab S.L.U. LE 100-26
Sound card Behringer UMC202
Sound software Syntrillium Software Cool Edit 2000
Transducer Panlab S.L.U. LE 111

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References

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 202

Erratum

Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 05/17/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice. The Abstract section was updated from:

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.4 or 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.

to:

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.

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