Summary
Здесь мы представляем протокол обследования кандидозной инфекции полости рта у пациентов с первичным синдромом Шегрена, который может быть использован для своевременного лечения и последующего предотвращения связанных с ним осложнений.
Abstract
Первичный синдром Шегрена (pSS) — это аутоиммунное заболевание, характеризующееся такими симптомами, как сухость во рту, сухость глаз и другие систематические симптомы. Из-за гипосаливации, испытываемой пациентами с ПСС, часто возникает дисбактериоз полости рта. Распространенным осложнением ПСС является инфекция кандиды полости рта. В этой статье авторы описывают систематические методы, которые могут эффективно диагностировать кандидозную инфекцию полости рта и идентифицировать штаммы кандиды с помощью слюны, мазков слизистой оболочки полости рта или жидкости для полоскания рта у пациентов с ПСС. Для диагностики кандидозной инфекции полости рта используются агар декстрозы Сабуро (SDA), анализ образования гиф, мазок на гидроксид калия (KOH) и анализ окрашивания калькофтором белым (CFW). Диагностический агар Candida используется для идентификации штаммов Candida . Наконец, тестирование на чувствительность к противогрибковым препаратам используется для определения соответствующего противогрибкового лекарственного лечения. Этот стандартизированный метод может улучшить диагностику, лечение и будущие исследования кандидозных инфекций полости рта, связанных с псС. Ранняя диагностика с использованием этого метода также может предотвратить любые осложнения, возникающие из-за задержки в получении соответствующего лечения.
Introduction
Кандидоз вызывается Candida spp., которые являются условно-патогенными микроорганизмами. Распространенные штаммы включают Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis и Candida dubliniensis1. Оппортунистические инфекции, вызванные Candida spp., включают поверхностные инфекции Candida и инвазивный кандидоз. Инвазивный кандидоз в основном встречается у людей с ослабленным иммунитетом; например, у пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) инвазивный кандидоз может значительно угрожать качеству жизни или даже продолжительностижизни2. Поверхностная кандидозная инфекция, такая как слизисто-кожный кандидоз, чаще встречается у пациентов3.
Кандидоз полости рта, поверхностная кандидозная инфекция, является наиболее распространенной грибковой инфекцией человека. Candida albicans — нормальный комменсал полости рта; сообщалось, что частота носительства Candida spp. колеблется от 20% до 75% в общей популяции без каких-либо симптомов4. Чрезмерный рост Candida может привести к местному дискомфорту у пациентов, такому как изменение вкуса чувствительности, жжение во рту, дисфагия из-за плохого питания, задержка выздоровления и длительное пребывание в больнице. Длительный кандидоз полости рта может привести к тяжелому инвазивному кандидозу, что приводит к значительной заболеваемости и смертности5. Кандидоз полости рта также может увеличить риск развития рака полости рта5. Нарушение функции слюнных желез является одним из факторов риска развития кандидоза полости рта6. Инициацией инфекции является адгезия Candida к стенкам клеток эпителия. За этим следует пролиферация и филаментация Candida , а также образование и созревание биопленки7. Биопленки чрезвычайно трудно искоренить, и они устойчивы к обычному противогрибковому лечению, что делает клиническое лечение проблемой для биопленкоассоциированной инфекции кандиды полости рта 7.
Первичный синдром Шегрена (pSS) — это аутоиммунное заболевание, которое характеризуется сухостью во рту, сухостью глаз и другими систематическими симптомами8. Сухость во рту является наиболее частым симптомом пСС. Слюна обладает важными физиологическими противогрибковыми функциями. С одной стороны, он может разбавлять и очищать ротовую полость, а затем удалять микроорганизмы со слизистой оболочки. С другой стороны, слюна содержит антимикробные белки, такие как лактоферрин, сиалопероксидаза, лизоцим, богатые гистидином полипептиды и специфические антикандидозные антитела, которые могут взаимодействовать со слизистой оболочкой полости рта и предотвращать чрезмерный рост Candida6. Снижение оттока слюны может предрасполагать пациентов с псс к кандидозу полости рта. Обсервационное перекрестное исследование, проведенное у 61 пациента с пСС, показало, что у 13,1% пациентов с ПС наблюдались оральные признаки кандидоза, а было обнаружено, что колониеобразующая единица (КОЕ)/мл Candida albicans значительно и отрицательно коррелирует с уровнями нестимулированной цельной слюны (UWS) и стимулированной цельной слюны (SWS)9.
Методы, представленные в этой рукописи, могут идентифицировать кандидозную инфекцию полости рта на основе характерных морфологических признаков (например, гиф и дрожжевых клеток) в прямом мазке или после культивирования10. Идентификация штамма Candida с помощью диагностического агара Candida основана на образовании разноцветных колоний с различной морфологией, которые возникают в результате расщепления хромогенных субстратов видоспецифичными ферментами11. В этой рукописи представлены систематические методы выявления кандидозной инфекции полости рта, включая традиционное бактериологическое исследование кандиды в полости рта и экспресс-исследование с помощью мазка на гидроксид калия (KOH) и теста на окрашивание калькофтором белым (CFW)10. Кроме того, был введен тест на чувствительность к противогрибковым препаратам, который может помочь в клиническом лечении кандидозной инфекции полости рта. В реальных ситуациях нет необходимости выполнять все методы, представленные в этой рукописи; пероральный метод (методы) обнаружения кандиды может быть выбран в соответствии с целью. Исследование кандидозной инфекции полости рта и определение штаммов Candida у пациентов с псс не только способствуют лечению заболевания, но и помогают оценить характеристику кандидоза полости рта и видовые профили.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные ниже, были одобрены Этическим комитетом Пекинской больницы Тяньтань, Столичный медицинский университет (No KY2023-177-01), и все пациенты, участвующие в этом исследовании, дали информированное согласие.
1. Критерии включения и исключения пациентов
- Критерии включения: Классифицировать пациентов как пациентов с ПСС, если они соответствуют критериям Американского колледжа ревматологии (ACR)/Европейской лиги по борьбе с ревматизмом (EULAR) 2016 года12. В частности, основывать окончательные критерии классификации на взвешенной сумме пяти пунктов: положительный результат на антитела к SSA/Ro и фокальный лимфоцитарный сиаладенит с оценкой фокуса ≥ 1 очаг/4мм2, каждый из которых оценивается по 3 балла; аномальная оценка окрашивания глаз ≥ 5 (или оценка ван Бейстервельда ≥ 4), результат теста Ширмера ≤ 5 мм/5 мин и скорость потока слюны без стимуляции ≤ 0,1 мл/мин, каждый из которых оценивается по 1 баллу. Лица с признаками и/или симптомами, указывающими на СС, которые имеют общий балл ≥ 4 по вышеуказанным пунктам, соответствуют критериям pSS.
- Критерии исключения: исключить пациентов, которые не могут сотрудничать при сборе образцов, и пациентов, получающих лечение от кандидозной инфекции полости рта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что методы, описанные ниже, также подходят для всесторонней характеристики оральных инфекций Candida у лиц с вторичным СС. - Чтобы предотвратить потенциальное загрязнение во время сбора, транспортировки и культивирования образцов Candida , примите тщательные меры предосторожности. Это включает в себя тщательную подготовку эксперимента, использование одноразовых и стерильных материалов, надлежащую маркировку, надежную герметизацию пробирок для отбора проб и проведение экспериментальных процедур в профессиональном шкафу биобезопасности.
2. Забор образцов
- Сбор слюны: Проинструктируйте пациентов держать трубку воронкой и позволять слюне постепенно стекать в трубку вдоль нижней губы. По окончании сбора попросите пациента выплюнуть всю оставшуюся во рту слюну в трубку. Собирайте слюну в течение 15 минут.
- Полоскание рта и взятие мазка: Если у пациента отсутствует или очень низкий нестимулированный поток слюны (менее 0,03 мл/мин), возьмите мазок со слизистой оболочки полости рта с подозрением на кандидозную инфекцию не менее 10 раз, затем попросите пациента использовать 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS; см. Таблицу материалов) для полоскания рта в течение 1 минуты. Храните жидкость для полоскания рта в стерильной пробирке объемом 50 мл и поместите тампон в пробирку для полоскания рта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для пациентов с ПСС с нестимулированным потоком слюны более 0,03 мл/мин шаг 2.2 все еще можно использовать для сбора образцов для выявления инфекции Candida полости рта.
3. Обработка образцов
- Добавьте 1 мл PBS в собранную слюну. Не добавляйте PBS в ополаскиватель для полости рта с PBS. Вибрируйте трубку для полоскания рта с помощью вихря в течение 1 минуты.
4. Кандидозная культура
- Для получения среды агара Сабуранда (SDA) растворите 70 г SDA (см. Таблицу материалов) в 1000 мл двойной дистиллированной воды.
- Стерильно с помощью автоклава при 121 °C в течение 15 мин, поместите 10 мл этой среды SDA в 10-сантиметровую чашку для микробиологических культур (см. Таблицу материалов) и охладите.
- Возьмите 200 мкл образца, приготовленного на этапе 3, и нанесите его на 10-сантиметровые чашки для микробиологических культур, приготовленные с использованием 10 мл среды SDA на этапе 4.2.
- Инкубируйте в течение 48 ч при 37 °C, и колония Candida созреет. Временно храните чашку АСД с колониями Candida при температуре 4 °C. Колонии Candida, культивируемые на чашке SDA, могут храниться в течение 2-4 недель.
5. Идентификация штамма Candida
- Для приготовления среды возьмите 47,7 г порошка диагностического агара Candida (см. Таблицу материалов), поместите его в 1000 мл дважды дистиллированной воды и нагрейте до 100 °C.
- Когда среда слегка закипит, поместите 10 мл в 10-сантиметровую чашку для микробиологических культур и дайте остыть.
- Растворите колонии Candida в 500 μл среды SDA (шаг 4), приостановите и диссоциируйте с помощью пипетирования.
- Поместите 50 мкл образца с колониями Candida (шаг 5.3) в среду, приготовленную на этапе 5.2. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C до тех пор, пока колонии Candida не созреют.
- По цвету и характеру колоний Candida определить штамм (штаммы) приобретенной Candida у пациентов с pSS. Используйте следующие критерии идентификации штаммов Candida : изумрудно-зеленая колония — Candida albicans, сине-серая колония — Candida tropicalis, розовые колонии с нечеткими краями и микроворсинки — Candida krusei, пурпурно-красная маленькая колония — Candida glabrata, молочно-белая колония содержит несколько штаммов, включая Candida parapsilosis.
6. Анализ образования биопленки Candida
- Чтобы получить среду с дрожжевым азотным основанием (YNB)-50 глюкозой (G), весьте 1,34 г YNB (см. Таблицу материалов) и 1,98 г D (+)-глюкозы (см. Таблицу материалов). Растворите их в 200 мл дважды дистиллированной воды.
- Чтобы приготовить среду YNB-100G, возьмите 1,34 г YNB и 3,96 г D(+)-глюкозы и растворите их в 200 мл дважды дистиллированной воды.
- Отфильтровать растворы с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм (см. Таблицу материалов). Фильтрованную среду YNB-50G и YNB-100G можно хранить при температуре 4 °C в течение 3 месяцев.
- Выберите 3 (или более) колонии одного штамма на чашках на шаге 5 и перенесите их в 200 μL среды YNB-50G (шаги 6.1 и 6.3) в 96-луночный планшет (см. Таблицу материалов). Сделайте это для штаммов, наблюдаемых в блюде. Культивирование в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
- Аспирируйте суспензию Candida , добавьте 1 мл PBS, центрифугируйте дрожжевые клетки при 1500 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг 2 раза в той же пробирке.
- Ресуспендируйте клетки в 1 мл среды YNB-100G и приготовьте различные разведения (1:10, 1:100 и 1:1000) клеток. Возьмите 200 мкл суспензии градиентных ячеек и нанесите его на 10-сантиметровую среду SDA методом спиральных пластин13. Покрытие производится с помощью машины, которая наносит известный объем образца на вращающуюся агаровую пластину в постоянно уменьшающемся количестве в виде спирали Архимеда. Культивирование в течение 24-48 ч при 37 °С.
- Рассчитать концентрацию клеток в различных разведениях в соответствии с количеством КОЕ в планшете SDA на основе стандартного метода13. Кратко подсчитайте хорошо разделенные колонии на каждой пластине. Подсчитайте колонии в одном октанте от внешнего края к центру, пока не будет обнаружено по крайней мере 25 колоний. Кроме того, посчитайте оставшуюся часть той дуги, где произошел25-й отсчет. Рассчитайте концентрацию клеток, разделив количество колоний на объем жидкости, соответствующий площади, на которой было получено количество колоний13. Отрегулируйте концентрацию клеток до 1 x 107 клеток/мл.
- Поместите 100 μл клеточной суспензии в YNB-100G в 96-луночный планшет и инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч, встряхивая при 200 об/мин.
- Осторожно выньте надосадочную жидкость, промойте 2 раза PBS и удалите плавающие дрожжевые клетки. Биопленка Candida образуется на дне 96-луночного планшета.
7. Анализ гифального образования
ПРИМЕЧАНИЕ: Только Candida , которая может образовывать гифы (например, Candida albicans), может быть индуцирована для образования гиф. Перейдите к шагу 8 для дальнейшей характеристики Candida , который не может образовывать гифы (например, Candida glabrata).
- Ресуспендируйте суспензию дрожжевых клеток на шаге 6.6 и отрегулируйте концентрацию клеток до 1 x 106 клеток/мл с помощью среды YNB-100G.
- Для приготовления питательной среды RPMI 1640 добавьте 50 мл фетальной сыворотки крупного рогатого скота (см. Таблицу материалов) в 450 мл среды RPMI 1640 (см. Таблицу материалов) и храните при температуре 4 °C для дальнейшего эксперимента.
- Перенесите 2 мкл клеточной суспензии Candida , разведенной в 200 мкл полной питательной среды RPMI 1640, в 96-луночный планшет и культивируйте в течение ночи при 37 °C, чтобы дать возможность сформироваться гифам и дрожжевым клеткам.
8. Тест мазка KOH и анализ окрашивания CFW
- Извлеките 1 μл образцов из этапа 3, шага 6 или шага 7 с помощью прецизионной формованной петли (см. Таблицу материалов) и намажьте область 1 см x 1 см на предметные стекла. Подождите, пока он высохнет при комнатной температуре.
- Для приготовления 10% раствора КОН взвесьте 10 г порошка КОН (см. Таблицу материалов) и растворите его в 100 мл дважды дистиллированной воды.
- Слегка нагрейте предметное стекло спиртовой лампой, пока образец не растворится. Закрасьте предметные стекла, приготовленные на шаге 8.1, 10% KOH (шаг 8.2) и накройте покровным стеклом. Слегка нажмите на крышку, чтобы образец стал прозрачным.
- Визуализируйте гифы и дрожжевые клетки под микроскопом.
- Заморочьте предметные стекла, приготовленные на шаге 8.1, каплей CFW (см. Таблицу материалов), накройте покровным стеклом и подождите 1 мин.
- Визуализируйте гифы с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении 100x и 200x. CFW возбуждается при 355 нм и регистрируется при 300-440 нм. Фотографируйте изображения под выдержкой. Повторите 3 раза, чтобы избежать ложноположительных результатов.
9. Тест на чувствительность к противогрибковым препаратам
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест проводится в соответствии с инструкциями производителя для набора для определения чувствительности к дрожжевым грибам (микроразведение; см. Таблицу материалов).
- Подготовьте колонии Candida (шаг 4) возрастом менее 4 дней с помощью ампулы 0,85% NaCl (см. Таблицу материалов) и получите суспензию, имеющую мутность, эквивалентную 2 Фарландам. Определите мутность по набору стандартов Макфарланда (см. Таблицу материалов). Приготовленную суспензию Кандида используйте мгновенно.
- Пипетку 135 мкл среды ATB F2 в наборе, содержащем 3 x 104 дрожжевых клеток/мл, в каждую чашку тест-полоски и накройте крышкой. Поместите тест-полоску в герметичный контейнер. Культивирование в течение 24 ч при 35 °C.
- Наблюдайте за ростом Candida с помощью визуальной интерпретации (см. инструкцию по эксплуатации). Эталонное значение (эталонный диапазон) см. в руководстве пользователя. Проверьте, достаточно ли растет контрольное отверстие. Если рост контрольного отверстия недостаточен или не растет, то результаты не могут быть прочитаны и требуется еще 24 ч культивации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании 12 пациентов с pSS были отобраны в качестве репрезентативных пациентов и прошли скрининг на оральную кандидозную инфекцию (Таблица 1). Среди этих пациентов у некоторых пациентов наблюдались типичные поражения полости рта, вызванные инфекцией Candida , включая ангулярный хейлит (характеризуется трещинами в уголках рта, шелушением и гиперемией, рисунок 1A), ярко-красный отек слизистой оболочки десны, желтовато-белую волокнистую псевдомембрану (рисунок 1B), атрофию язычных сосочков и ярко-красную дорсальную слизистую оболочку языка (рисунок 1C).
Среди этих 12 пациентов, участвовавших в текущем исследовании, 8 имели оральную кандидозную инфекцию, что было подтверждено ростом колоний Candida на чашках SDA (рисунок 2A-C и дополнительный рисунок 1). Диагностический агар показал, что среди этих пациентов с pSS существуют пероральные кандидозные инфекции Candida albicans, Candida krusei и Candida glabrata (рисунок 2D-F, дополнительный рисунок 2A, B). В некоторых случаях было обнаружено более одного вида Candida, например, комбинированная инфекция Candida albicans и Candida krusei, а также комбинированная инфекция Candida albicans и Candida glabrata (рисунок 2D, дополнительный рисунок 2A, B).
Тест мазка KOH и последующий анализ окрашивания CFW с использованием образцов слюны пациента или мазка слизистой оболочки полости рта могут быстро определить, есть ли у пациента инфекция Candida. В этом исследовании присутствие гиф наблюдалось в обоих образцах полости рта у пациентов с пСС (рис. 3A, B). Результаты были дополнительно подтверждены анализом окрашивания CFW, который показал флуоресцентное положительное окрашивание гиф (рис. 3C, D). Кроме того, гифы пациента с ПСС, инфицированного пероральным Candida albicans, были индуцированы с помощью анализа образования гиф (рис. 4A), а индуцированные гифы наблюдались под флуоресцентным микроскопом в анализе окрашивания CFW (рис. 4D). Кроме того, тест мазка KOH и анализ окрашивания CFW показали положительные грибковые споры и псевдогифы у пациента с ПС с инфекцией Candida krusei (рис. 4B,E), а также грибковые споры у пациента с ПС с инфекцией Candida glabrata (рис. 4C,F) после образования биопленки Candida.
Тестирование на чувствительность к противогрибковым препаратам имеет решающее значение в клиническом ведении инфекций, вызванных кандидозом полости рта, у пациентов с pSS. Здесь три репрезентативных пациента были проверены на чувствительность к противогрибковым препаратам к пяти часто назначаемым препаратам: флуконазолу, итраконазолу, амфотерицину В, вориконазолу и 5-флуконазолу. Результаты интерпретировали в соответствии с рекомендациями производителя. У пациентов с ПСС 1 и 3 наблюдалась чувствительность ко всем тестируемым противогрибковым препаратам (Таблица 1)14,15. У пациента 2 с pSS наблюдалась дозозависимая промежуточная реакция на флуконазол и вориконазол, дозозависимая, промежуточная чувствительность к резистентности к итраконазолу, резистентность к 5-флуконазолу и чувствительность к лечению амфотерицином B (табл. 2)14,15.
Рисунок 1: Репрезентативные оральные проявления инфекции Candida . (A) Ангулярный хейлит (рагады в уголках рта, шелушение и гиперемия). (Б) Эритематозное поражение с отеком на альвеолярной слизистой оболочке десны с желтовато-белой волокнистой псевдомембраной. (В) Атрофическая спинка язычных сосочков с рассеянным и неправильным покрасневшим и ограниченным атрофическим эритемным поражением. Черные стрелки указывают на очаги поражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Идентификация декстрозного агара Сабуро (SDA) и штамма Candida . (А-С) Посев SDA образцов полости рта (слюна, жидкость для полоскания рта PBS или замена слизистой оболочки полости рта) у 3 репрезентативных пациентов с pSS с кандидозной инфекцией. Анализ на идентификацию штамма Candida с использованием диагностического агара Candida показывает пациентов с pSS с пероральными инфекциями (D) Candida albicans плюс Candida Krusei , (E) инфекцией Candida albicans и (F) инфекцией Candida glabrata . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Мгновенный анализ мазка на гидроксид калия (KOH) и анализ на окрашивание калькофтористым белым (CFW). Анализ проводили с использованием образцов полости рта (слюна, жидкость для полоскания рта PBS или замена слизистой оболочки полости рта) у 2 пациентов с репрезентативным pSS. Тест мазка KOH с использованием образца из полости рта пациента (A) pSS 1 и (B) пациента pSS 2. Черные полые стрелки указывают на гифы. Анализ окрашивания CFW с использованием перорального образца пациента (C) pSS 1 и (D) pSS пациента 2. Белые полые стрелки указывают на гифы и споры грибов. Масштабная линейка = 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Мазок на гидроксид калия (KOH), анализ на окрашивание образцов калькофтористым белым (CFW) после посева. Мазок KOH с использованием слюны пациента с pSS с (A) инфекцией Candida albicans, (B) пациента с pSS с инфекцией Candida krusei и (C) пациента с pSS с инфекцией Candida glabrata. Анализ окрашивания CFW индуцированных гиф у пациента с pSS с инфекцией Candida albicans (D), спорами грибов и псевдогифами пациента с (E) pSS с инфекцией Candida krusei и спорами грибов у пациента (F) pSS с инфекцией Candida glabrata. Белые полые стрелки указывают на гифы; Белые сплошные стрелки указывают на псевдогифу. Масштабная линейка = 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Репрезентативная культура декстрозного агара (SDA) Сабуро с использованием образцов полости рта пациента с pSS (слюна, жидкость для полоскания рта PBS или замена слизистой оболочки полости рта). (А-С) Бактериологическое исследование SDA Candida с использованием образцов из полости рта от 3 репрезентативных пациентов с pSS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Идентификация штамма Candida . Идентификация возможной инфицированной Candida у 12 пациентов с pSS с помощью диагностического агара Candida . (A) Идентификация штамма Candida с использованием образцов полости рта от пациентов с pSS 1-6. Пациент с рСС 1: Candida albicans, 2: Candida albicans, 3: Candida albicans и Candida krusei, 4: Candida albicans, 5: Candida albicans и Candida glabrata, 6: пероральная инфекция Candida отсутствует. (B) Идентификация штамма Candida с использованием образцов из полости рта пациентов с pSS 7-12. 7-й пациент с рСС: Candida albicans, 8: Candida albicans и Candida glabrata, 9: пероральная кандидозная инфекция отсутствует, 10: Candida albicans, 11: кандидозная инфекция полости рта отсутствует, 12: кандидозная инфекция полости рта отсутствует. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Таблица 1: Информация о пациентах с первичным синдромом Шегрена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Результаты тестов на чувствительность к противогрибковым препаратам у пациентов14,15. Сокращения: S = чувствительный, I = промежуточный, R = резистентный, SDD = дозозависимый чувствительный, C = концентрация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящей рукописи мы представляем ряд систематических, простых и осуществимых методов выявления инфекций Candida полости рта, идентификации штаммов Candida и тестирования чувствительности к противогрибковым препаратам у пациентов с pSS.
В практических условиях не все методы, представленные в этой рукописи, необходимы. Метод (методы) перорального обнаружения кандиды может быть выбран в зависимости от конкретной цели. Тесты мазка KOH и анализы окрашивания CFW с использованием образцов без культивирования могут быстро и предварительно определить наличие инфекции Candida полости рта у пациентов с pSS. Однако эти методы имеют относительно высокий уровень ложноотрицательныхрезультатов16. Если трудно подтвердить инфекцию, культивирование кандиды имеет важное значение. Лекарственная устойчивость является фактором, который необходимо учитывать во время лечения; некоторые штаммы Candida естественным образом устойчивы к некоторым противогрибковым препаратам, например, Candida krusei естественным образом устойчив к лечению флуконазолом17. Поэтому иногда необходимо выявить штамм Candida . В этом случае штамм Candida можно идентифицировать по диагностическому агару Candida . В настоящее время лекарственно-устойчивый Candida привлекает все больше внимания18. Тест на чувствительность к противогрибковым препаратам может помочь в лечении и, таким образом, максимально избежать лекарственной устойчивости во время лечения. Анализ образования биопленки Candida и анализ образования гиф подходят для исследований, связанных с оральной инфекцией Candida .
Кандидозная инфекция полости рта является одним из наиболее частых осложнений у пациентов с псс4, значительно влияющим на качество их жизни из-за множества симптомов, которые она вызывает. Примечательно, что пациенты с ПС очень восприимчивы к этой инфекции, и эффективное лечение часто требует системной терапии и сотрудничества с пациентом19. Следовательно, инфекции, вызванные кандидозом полости рта, часто рецидивируют в этой популяции. Крайне важно выявить кандидоз полости рта и провести тесты на чувствительность к противогрибковым препаратам, чтобы назначить лечение. Среди методов, подробно описанных в этой рукописи, сбор образцов из полости рта для обнаружения Candida и последующее культивирование являются наиболее важными этапами.
Кроме того, Candida с образованием гиф (например, Candida albicans) может быть легко обнаружен с помощью быстрого теста мазка KOH и анализа окрашивания CFW с использованием собранных образцов без культивирования. Хотя большинство инфекций, вызванных кандидозом полости рта, могут быть обнаружены, а штаммы Candida могут быть идентифицированы с помощью методов, представленных в этой рукописи, некоторые штаммы Candida не могут быть идентифицированы от других, в частности, только с помощью таких методов, как посев SDA, диагностическая культура агара Candida, анализ образования биопленки Candida и анализ образования гиф. Кроме того, некоторые штаммы Candida не могут быть индуцированы к образованию гиф, например, Candida glabrata. Идентификация видов на основе ОТ-ПЦР с рДНК 18s позволяет точно идентифицировать виды Candida на основе их генетического сходства 10,20,21. При необходимости идентификация видов на основе ОТ-ПЦР с 18s рДНК может быть использована, например, в исследованиях кандидозной инфекции полости рта у пациентов с ПСС.
Интраорально проявление инфекции Candida может проявляться в виде эритематозных поражений слизистой оболочки, стоматита зубных протезов и трещин языка. В периоральной области колонизация Candida вызывает сухой, потрескавшийся и эритематозный вид7. Зарегистрированная распространенность клинического кандидоза полости рта широко варьирует у пациентов с СС, от 0% до 80%. Возможные причины большой вариабельности кандидоза полости рта включают отсутствие четкой симптоматики и, что более важно, различные критерии, используемые для диагностики кандидоза полости рта в литературе 8,9,12. Кроме того, сообщается, что пациенты с инфекцией Candida имеют более высокий риск SS, а инфекция Candida может выступать в качестве раннего признака последующего SS22. Ранняя диагностика пСС имеет решающее значение для лечения и патологоанатомического исследования. Поэтому крайне важно обеспечить универсальные, удобные и осуществимые методы выявления кандидозной инфекции полости рта у пациентов с ПСС.
Хотя дисбиоз в микробиоме кишечника, полости рта и влагалища часто встречается у пациентов с ПСС, образцы полости рта демонстрируют наибольшую степень микробнойизменчивости1. В нормальных условиях среднесуточный расход цельной слюны составляет от 1 до 1,5 л2 . До 99% слюны состоит из воды, а оставшийся 1% — из белков и ионов. Сообщается, что слюна играет важную роль в определении состава и активности микробиоты полости рта по нескольким причинам3. Слюна не только непрерывно очищает зубы, выполняя важнейшие функции гигиены полости рта в здоровых условиях, но и образует кондиционирующую пленку на поверхности полости рта. Эта пленка обеспечивает рецепторы для прикрепления бактерий, способствует росту бактерий, снабжая их питательными веществами из гликопротеинов, и поддерживает подходящий pH для роста бактерий. Кроме того, слюна содержит противомикробные и антикандидозные факторы, которые регулируют и формируют микробиоту. Кроме того, слюна содержит антимикробные и антикандидозные факторы, такие как адреномедуллин, статрин, гистатины, α-дефензины, лизоцим, гистатины, лактоферрин и кальпротектин, которые регулируют и формируют микробиоту4. ПС характеризуется аутоиммунной дерегуляцией и железистой гипофункцией. Гипосаливация, снижение слюноотделения, является одним из наиболее распространенных симптомов pSS. Снижение уровня pH и потока слюны являются значимыми факторами риска развития кандидозных инфекцийполости рта 5. Кроме того, инфекции Candida являются вторым наиболее распространенным орофациальным осложнением, связанным с SS6. Авторы предполагают, что увеличение числа инфекций Candida у пациентов с СС может быть связано не только со снижением выработки слюны, но и с иммунологической дерегуляцией, присущей СС.
В заключение следует отметить, что практические и воспроизводимые методы пероральной кандидозной инфекции и тесты на чувствительность к противогрибковым препаратам, представленные в этой рукописи, являются многообещающими для улучшения клинической идентификации и лечения кандидозных инфекций. Кроме того, эти стандартизированные процедуры могут свести к минимуму несоответствия в научных исследованиях, связанных с кандидозом полости рта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (82201084), Китайским фондом постдокторантуры (2022M722232), Пекинским фондом постдокторских исследований (2023-ZZ-020), проектом Мяопу Пекинской больницы Тяньтань, Столичным медицинским университетом (2023MP10) и Общим исследовательским фондом, Советом по исследовательским грантам Гонконга (27111820 и 17116521).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | MERCK | SLGV004SL | |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | axygen | MCT-150-C-S | |
| 10 cm Microbiological Culture Dishes | Jet Bio-Filtration Co. Ltd | TCD000100 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Jet Bio-Filtration Co., Ltd | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | |
| 96-well Microplates | Corning | 3599 | |
| API 0.85% NaCl ampule | BIOMERIEUX | 20070 | |
| Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| CHROMagar Candida | CHROMagar | P002860 | Candida diagnostic agar |
| D(+)-Glucose Monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010518 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26170035 | |
| McFarland Standards Kit | BIOMERIEUX | 70900 | |
| Nunc precision molded loops | ThermoFisher Scientific | 254399 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | C10010500BT | |
| Potassium Hydroxide | Aladdin | P112284-500g | |
| PowerSoil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875119 | |
| Sabourand's Agar Medium | Solarbio | S9710 | |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino acids | Solarbio | Y8040 | |
| Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution) | BIOMERIEUX | 14204 |
References
- Wang, X., et al. Microbiota dysbiosis in primary Sjögren's syndrome and the ameliorative effect of hydroxychloroquine. Cell Rep. 40 (11), 111352 (2022).
- Humphrey, S. P., Williamson, R. T. A review of saliva: normal composition, flow, and function. J Prosthet Dent. 85 (2), 162-169 (2001).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontol 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Vila, T., Rizk, A. M., Sultan, A. S., Jabra-Rizk, M. A. The power of saliva: Antimicrobial and beyond. PLoS Pathog. 15 (11), e1008058 (2019).
- Serrano, J., et al. Risk factors related to oral candidiasis in patients with primary Sjögren's syndrome. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 25 (5), e700-e705 (2020).
- Napeñas, J. J., Rouleau, T. S.
- Mathews, S. A., Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Leung, K. C. M., McMillan, A. S., Cheung, B. P. K., Leung, W. K. Sjögren's syndrome sufferers have increased oral yeast levels despite regular dental care. Oral Dis. 14 (2), 163-173 (2008).
- Lundstrom, I. M., Lindstrom, F. D. Subjective and clinical oral symptoms in patients with primary Sjögren's syndrome. Clin Exp Rheumatol. 13 (6), 725-731 (1995).
- Alam, M. Z., et al. Candida identification: a journey from conventional to molecular methods in medical mycology. World J Microbiol Biotechnol. 30 (5), 1437-1451 (2014).
- Bauters, T. G., Nelis, H. J. Comparison of chromogenic and fluorogenic membrane filtration methods for detection of four Candida species. J Clin Microbiol. 40 (5), 1838-1839 (2002).
- Soto-Rojas, A. E., Villa, A. R., Sifuentes-Osornio, J., Alarcón-Segovia, D., Kraus, A. Oral candidiasis and Sjögren's syndrome. J Rheumatol. 25 (5), 911-915 (1998).
- Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Appl Microbiol. 25 (2), 244-252 (1973).
- Biomerieux. ATB FUNGUS 3 Sensitivity test for yeast-like fungi. REF 14204. Biomerieux. , (2014).
- Zhang, L., et al. The widely used ATB FUNGUS 3 automated readings in China and its misleading high MICs of Candida spp. to Azoles: Challenges for developing countries' clinical microbiology labs. PLoS One. 9 (12), e114004 (2014).
- Hu, L., Zhou, P., Zhao, W., Hua, H., Yan, Z. Fluorescence staining vs. routine KOH smear for rapid diagnosis of oral candidiasis-A diagnostic test. Oral Dis. 26 (5), 941-947 (2020).
- Samaranayake, L. P. Candida krusei infections and fluconazole therapy. Hong Kong Med J. 3 (3), 312-314 (1997).
- Lee, Y., Puumala, E., Robbins, N., Cowen, L. E. Antifungal drug resistance: Molecular mechanisms in Candida albicans and beyond. Chem Rev. 121 (6), 3390-3411 (2021).
- Rihab, B., Lina, E. H., Noémie, S. T., Jean, S., Marjolaine, G. The experience of dry mouth and screening for Sjogren's syndrome by the dentist: patient-reported experiences. BMC Oral Health. 23 (1), 1010 (2023).
- Panpetch, W., et al. Oral Candida administration in a Clostridium difficile mouse model worsens disease severity but is attenuated by Bifidobacterium. PLoS One. 14 (1), e210798 (2019).
- Alwaily, E. R., Abood, M. S., Al Uobody, R. M. Diagnosis of oral candidiasis in patients under 12 years: 18S rRNA as a marker of molecular characterization of Candida tropicalis. Arch Razi Inst. 78 (1), 475-483 (2023).
- Chen, C. L., et al. Candida infection as an early sign of subsequent Sjögren's syndrome: A population-based matched cohort study. Front Med (Lausanne). 8, 796324 (2022).
