Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Social Defeat Stress Model for unge C57BL/6 han- og hunmus

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/66455
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2,3,4,5
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2Douglas Mental Health University Institute, McGill University, 3Department of Psychiatry, McGill University, 4Department of Neurology and Neurosurgery, Faculty of Medicine, McGill University, 5Ludmer Centre for Neuroinformatics & Mental Health, McGill University

Summary

Vi udviklede en accelereret social nederlagsstressmodel for unge C57BL/6-mus, som virker hos både mænd og hunner og tillader eksponering i diskrete teenageperioder. Eksponering for denne model inducerer social undgåelse, men kun i en undergruppe af besejrede han- og hunmus.

Abstract

Social modgang i ungdomsårene er udbredt og kan have en negativ indvirkning på mentale sundhedsforløb. Modellering af social stress hos unge mandlige og kvindelige gnavere er nødvendig for at forstå dets virkninger på igangværende hjerneudvikling og adfærdsmæssige resultater. Paradigmet for kronisk social nederlagsstress (CSDS) er blevet brugt i vid udstrækning til at modellere social stress hos voksne C57BL/6 hanmus ved at udnytte den aggressive adfærd, som en voksen hangnaver udviser til en ubuden gæst, der invaderer dens territorium. En fordel ved dette paradigme er, at det gør det muligt at kategorisere besejrede mus i modstandsdygtige og modtagelige grupper baseret på deres individuelle forskelle i social adfærd 24 timer efter den sidste nederlagssession. Implementering af denne model i unge C57BL/6-mus har været udfordrende, fordi voksne eller unge mus typisk ikke angriber tidlige unge han- eller hunmus, og fordi ungdomsårene er en kort periode i livet, der omfatter diskrete tidsmæssige sårbarhedsvinduer. Denne begrænsning blev overvundet ved at tilpasse en accelereret version af CSDS til brug for unge han- og hunmus. Dette 4-dages stressparadigme med 2 fysiske angrebssessioner om dagen bruger en C57BL/6 mandlig voksen til at forberede CD-1-musen til aggressivitet, så den let angriber den mandlige eller kvindelige unge mus. Denne model blev kaldt accelereret social nederlagsstress (AcSD) for unge mus. Unges eksponering for AcSD inducerer social undgåelse 24 timer senere hos både hanner og hunner, men kun hos en undergruppe af besejrede mus. Denne sårbarhed opstår på trods af, at antallet af angreb er ensartet på tværs af sessioner mellem modstandsdygtige og modtagelige grupper. AcSD-modellen er kort nok til at tillade eksponering i diskrete perioder i ungdomsårene, tillader adskillelse af mus i henhold til tilstedeværelsen eller fraværet af social undgåelsesadfærd og er den første tilgængelige model til at studere social nederlagsstress hos unge C57BL/6 hunmus.

Introduction

Paradigmet for kronisk social nederlagsstress bruges i vid udstrækning til at modellere social stress hos voksne postnatale dage (PND) >65 hangnavere. Dette paradigme er baseret på den naturlige aggressive adfærd hos en voksen hangnaver, når en ubuden gæst invaderer dens territorium. Denne model bruges i en række forskellige gnaverarter, herunder rotter, hamstere og mus 1,2,3,4,5,6,7,8,9, og består af en kombination af fysisk aggression og psykologisk stress, der varer omkring 10 dage, hvor en ubuden gæst gnaver eksperimenterer et par minutters fysisk aggression fra den fastboende gnaver. De to gnavere forbliver i beboerens hjemmebur, adskilt af en skillevæg, der tillader sensorisk, men ikke fysisk kontakt7. I museforsøg er de mest almindeligt anvendte residente/aggressormus pensionerede opdrættere schweiziske CD-1-mus, som viser robust territorial adfærd mod ubudne mus 6,7. For de ubudne mus er den bedst karakteriserede stamme indavlen C57BL/6 stamme 2,4,5. Den besejrede mus udsættes for en ny aggressor hver dag for at forhindre tilvænning til aggressoren. Kontrolmus er anbragt med en anden artsfælle hver dag. 24 timer efter den sidste nederlagssession testes eksperimentelle mus i en social interaktionstest (SIT), hvor de kan udforske et åbent felt i fravær (intet mål) eller tilstedeværelse af en ny CD-1-mus (mål). Kontrolmus bruger mere tid i interaktionszonen med målet i forhold til ikke-måldelen af opgaven. Besejrede mus klassificeres som modtagelige (ratio<1) eller modstandsdygtige (ratio>1) i henhold til et socialt interaktionsforhold (tid brugt i interaktionszonen med aggressor til stede/tid brugt i interaktionszonen med aggressor fraværende). Denne procedure giver et nyttigt værktøj til at studere individuelle forskelle som reaktion på stress.

Indtil for nylig er den kroniske sociale nederlagsstressmodel mest blevet brugt til voksne hanmus, fordi de accentuerede mandlige dominanshierarkier involverer kamp mod hanner, men ikke mod hunner 6,7. Desuden angriber hangnavere typisk ikke hunner; i stedet engagerer de sig i parringsadfærd10. På trods af disse forhindringer er der udviklet forskellige strategier til at tilpasse det kroniske sociale nederlagsstressparadigme til voksne hunmus. For eksempel er den californiske musemodel for socialt nederlag baseret på den naturlige aggression af denne monogame art fra begge køn, når de forsvarer deres territorium 9,11. Andre tilgange fokuserer på at inducere aggressiv adfærd hos CD-1-musene ved at stimulere deres ventromediale hypothalamus til at have konsekvent aggressiv adfærd10,12, eller ved at anvende hanurin i de eksperimentelle voksne hunmus for at modtage angreb fra CD-1-aggressorer13. Denne øgede og konsekvente aggression af CD-1-musene er afgørende for, at den eksperimentelle ubudne mus viser klare adfærdsmæssige tegn på underordning over for de gentagne angreb fra aggressoren under interaktionens længde6.

Tilpasning af den kroniske sociale nederlagsmodel til brug i unge C57BL/6-mus
Ungdommen er en periode præget af betydelig psykosocial modning, som udfolder sig parallelt med ændringer i hjernens mikro- og makroarkitektur, især i den præfrontale cortex. Hos både mennesker og gnavere er der ringe konsensus om den specifikke begyndelse og afslutning af ungdomsperioden14,15. Desuden er der kritiske sårbarhedsvinduer i ungdomsårene for oplevelsesinduceret forstyrrelse af igangværende hjerne- og kognitiv udvikling 16,17,18,19. Puberteten og ungdommen forekommer på samme tid, men disse udtryk er ikke synonyme. Puberteten betyder begyndelsen på seksuel modning, mens ungdommen repræsenterer en bredere fase, der er karakteriseret ved det gradvise skift fra en ungdomstilstand til opnåelse af uafhængighed20. Forskellige grupper har foreslået, at ungdomsårene hos mus spænder fra fravænning (PND 21) til voksenalderen (PND 60)21. Især kan tidlig ungdom omtales som den første og anden uge efter fravænning (PND 21-34) og midten af teenageårene som PND 35-48-perioden. Disse intervaller omfatter diskrete udviklingsperioder vedrørende for eksempel udviklingen af dopaminsystemet 22,23,24, sårbarhed over for lægemiddeleffekter på udvikling af neuronale netværk 17,25,26,27 og forskellige adfærdsmæssige karakteristika 16,20,28,29,30 Hr. formand!

Kampadfærd fra den bosiddende mus er påkrævet for den sociale nederlagsprotokol. Men som med hunmus engagerer hanner sig typisk ikke i aggressive interaktioner med tidlige teenagemus, muligvis fordi de ikke opfatter dem som en trussel. De fleste undersøgelser, der undersøger virkningerne af kronisk socialt nederlag hos unge C57BL/6-mus, er blevet udført i midten af teenageperioden 31,32,33,34,35; andre specificerer ikke den postnatale dag for teenagers eksponering36,37, eller forlænger dagene for nederlag til tidlig voksenalder38 eller tillader ikke sensorisk kontakt39; Andre undersøgelser af unge mus bruger forskellige stammer40,41. Karakteristika for disse undersøgelser, der bruger kronisk social nederlagsstress hos unge hanmus, er opsummeret i tabel 1.

Vores forskningsgruppe er interesseret i at målrette specifikke eksponeringsvinduer for unge, herunder tidlig ungdom, hos C57BL/6-mus. På grund af den korte varighed af de forskellige ungdomsperioder blev der designet en modificeret version af den accelererede version af det kroniske sociale nederlagsstressparadigme42. Denne model blev kaldt accelereret social nederlagsstress (AcSD) for unge mus. Tidligere arbejde viser, at der er signifikante kønsforskelle i følsomhed over for social stress i ungdomsårene hos rotter 8,26,43,44,45, såvel som i de skadelige virkninger af social stress på mentale sundhedsbaner hos mennesker 46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56. AcSD-modellen fungerer også effektivt for unge hunmus, hvilket giver dem mulighed for at undersøge potentielle kønsspecifikke konsekvenser samt udforske det neurobiologiske grundlag.

Tabel 1: Undersøgelser ved hjælp af sociale nederlagsstressparadigmer hos unge hanmus. Stamme og art: Californisk mus: Peromyscus californicus. C57BL/6: Mus musculus black 6 indavlet musestamme. C57BL/6J: M. musculus sort 6 indavlet musemodel leveret af Jacksons laboratorier. CD-1: M. musculus fra schweizisk udavlet albinomusestamme. ICR: M. musculus Institute of Cancer Research udavlede albinomusestamme. OF1: M. musculus Oncins Frankrig 1 udavlet albinomusestamme.
Forkortelser: uge = uge; PND = Postnatal dag; res = modstandsdygtig; sus = modtagelig; unsus = umodtagelig. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Canadian Council of Animal Care og godkendt af McGill University og Douglas Hospital Animal Care Committee (godkendelsesnummer for dyreforsøg: 2005-5084). Alle mus blev anbragt i et temperatur- og fugtighedskontrolleret (21-22 °C; 60%) kolonirum og på en 12 timers lys-mørk cyklus (lys tændt kl. 8:00 timer) på neurofænotypningscentret ved Douglas Mental Health University Institute. Musene havde ad libitum adgang til mad og vand under hele forsøgene. Mus blev tildelt tilfældigt til hver eksperimentel tilstand. Forsøgsdyr blev opnået fra en kommerciel kilde (se materialetabel). Tabel 2 opsummerer dyrets karakteristika for hver forsøgsfase. I alt blev 489 unge C57BL/6J-mus (259 hanner; 230 hunner) brugt på tværs af 20 eksperimentelle kohorter.

Tabel 2: Forsøgspersoner for hver forsøgsfase. †Hvis disse dyr ikke er alvorligt skadet, kan de genbruges til priming. ‡Hvis disse dyr ikke er alvorligt skadet, kan de genbruges til priming under AcSD, §Neurofænotyping Center ved Douglas Mental Health University Institute. Til eksperimenter med hanner, #For eksperimenter med hunner, hvis nederlaget er blandet, skal du bruge hunner til priming. ††Må ikke bruges til AcSD. Forkortelser: AcSD = accelereret social nederlagsstress; PND = Postnatal day Klik her for at downloade denne tabel.

1. Akklimatisering

BEMÆRK VENLIGST: Denne fase bør vare mindst 1 uge.

  1. Køb han-CD-1 pensionerede avlsmus (se materialefortegnelsen) ældre end 4 måneder og dobbelt så mange som de unge C57BL/6J-mus (dvs. hvis 10 mus vil blive udsat for stress, skal du købe 20 CD-1-mus).
    BEMÆRK: Det anbefales at erhverve denne mængde CD-1-mus, fordi kun en lille del af CD-1-mus udviser aggressiv adfærd over for unge mus.
  2. Lad CD-1 hanmusene vænne sig til det nye anlæg i deres hjemmebur med mad og vand ad libitum i 1 uge før screening og priming.
  3. Brug C57BL/6 ved PND >65 (voksne) og PND 25 ± 3 (unge) (tabel 2) til screenings- og primingsessionerne. Anskaf 4 C57BL/6 mus i hver alder pr. dag med priming (dvs. i 3 dages priming, erhverv 12 PND >65 og 12 PND 25 ± 3) for at mindske risikoen for skader, fordi disse dyr vil blive brugt gentagne gange til screening og priming-proces.

2. CD-1 screening og priming

BEMÆRK: Varigheden af denne fase er 3 dages screening (1 dag for hunmus) og 3-4 dages priming (dette kan øges for hunmus og afhængigt af CD-1-musenes aggressive adfærd.)

  1. Brug den operationelle definition af angreb til at registrere angrebene fra CD-1 som beskrevet nedenfor.
    1. Et angreb defineres som, når CD-1-musen bider C57BL/6J-musen, og C57BL/6J-musen bevæger sig væk som reaktion på biddet. Et bid defineres som, når CD-1-musen placerer sine tænder på en hvilken som helst del af C57BL/6J-musens krop. At bevæge sig væk defineres som, når C57BL/6J-musen bevæger begge sine bagpoter fra den position, de var i, før CD-1'en gik i indgreb med den.
    2. Sørg for, at der er en forskel på mindst ~2 s mellem separate angreb. Hvis der forekommer mere end ét bid med < s mellemrum, tælles som et angreb.
    3. Hvis CD-1-musen bider mere end én gang i træk uden pause (<~2 s fra hinanden), skal du forsigtigt adskille dyrene med en plastiklineal. Hvis CD-1-musen bider og ikke slipper, skal du forsigtigt adskille dyrene. Hvis C57BL/6J-musen bliver fanget i et hjørne eller sidder fast af CD-1-musen og ikke kan bevæge sig væk som reaktion på et bid, skal du forsigtigt adskille dyrene med en lineal. Tæl alle disse som et angreb (op til adskillelse).
  2. Screening
    1. Brug nitrilundersøgelseshandsker til al håndtering af dyr og undgå brug af parfume eller duftstoffer.
    2. Udfør kun den 1. dag af screeningen med voksne C57BL/6 hanmus som ubudne gæster (PND >65) i CD-1 musenes hjemmebur. Screene altid CD-1-musene før et nyt eksperiment.
    3. Introducer en voksen hanmus C57BL/6 mus PND >65 i hjemmeburet på en CD-1 hanmus i 3 minutter. Registrer latenstiden til den første aggression, og hvor mange aggressioner der udføres (se supplerende tabel 1).
    4. Fra den 2. til den sidste dag af screeningen introduceres en voksen han C57BL/6 PND>65 i 1 minut (grænse til 30 sekunder, hvis CD-1 er meget aggressiv) og derefter byttes den ud med en ung C57BL/6 PND 25 ± 3 i 5 minutter.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at udføre screeningen med unge mus, fordi ikke alle mus, der angriber den voksne C57BL/6 hanmus, vil angribe den unge C57BL/6. Faktisk vil CD-1-mus, der angriber unge mus, ikke altid angribe voksne C57BL/6-hanner.
    5. Hvis eksperimentet er for aggressivitet over for hunmus, skal du udføre screening og priming med unge hunmus, selvom forsøgsmusene inkluderer begge køn.
    6. Registrer latenstiden til den første aggression, antallet af angreb og de sår, som alle C57BL/6-musene har modtaget (se supplerende tabel 2).
    7. Registrer enhver form for interaktion: jagt, monteringsadfærd, sniffing, pleje eller bid. Registrer, hvis CD-1 ikke nærmer sig de unge C57BL/6-mus; hvis denne adfærd gentages i 2 dage, skal du ikke inkludere CD-1 i priming.
    8. Til klargøringsfasen skal du vælge alle de CD-1-mus, der udviser adfærd såsom jagt, monteringsadfærd, sniffing, forfølgelse, pleje eller bide den unge C57BL/6.
    9. Behold de ikke-udvalgte CD-1-mus, og brug dem til den sociale interaktionstest (SIT).
      BEMÆRK: Territoriel adfærd øges med tiden; derfor kan de ikke-udvalgte CD-1-mus blive aggressive over for unge mus i det næste eksperiment.
  3. Klargøring af CD-1 aggressiv adfærd
    1. Huse de CD-1-mus, der er udvalgt til grunding, i deres hjemmebur indtil den sidste dag med grunding.
    2. Introducer en voksen hanmus C57BL/6J mus PND >65 i 30 sekunder til CD-1 hjemmeburet, og skift den derefter ud med en ung C57BL/6 PND 25 ± 3 mus i 5 minutter.
    3. Registrer latenstiden til den første aggression, antallet af angreb og eventuel interaktion (se supplerende tabel 3).
    4. Udfør primingen 2x om dagen i 3-4 dage samtidig med at nederlagene er planlagt (9:00 og 14:00).
      BEMÆRK: Ikke alle CD-1-mus vil angribe de unge mus i løbet af de første dage, især hvis primingen er mod hunmus. Antallet af dage til priming kan stige eller falde afhængigt af den aggressive adfærd, der udvises af CD-1-musene.
    5. For at reducere antallet af primingdage skal du genbruge CD-1-mus, der har været igennem et tidligere socialt nederlagseksperiment med hanmus. Hvis CD-1-mus ikke viser øget aggression, skal du forlænge dagene til priming, indtil kriterierne nås.
    6. Reducer dagene til priming, hvis CD-1-musene viser ekstrem aggressiv adfærd (C57BL/6-mus viser overdreven sår) for at forhindre alvorlige skader under socialt nederlag.
    7. Til den næste fase af eksperimentet skal du vælge de CD-1-mus, der angriber de unge mus mindst 10 gange (hanner) eller 5 gange (hunner) i 2 på hinanden følgende dage.

3. AcSD-protokol

BEMÆRK VENLIGST: Denne fase består af 3 dages tilvænning og 4 dages eksponering for AcSD.

  1. Tilvænning
    1. Sæt rotteburene op til socialt nederlag (Figur 1A-F). Opdel rotteburene i 2 rum ved hjælp af passende akrylglasdelere (figur 1B,D; se materialetabel).
    2. Tilføj hårdt træflisstrøelse på begge sider af buret, tilføj en bomuldsfirkant pr. side som strøelsesmateriale (Figur 1D). Sørg for, at trådtoppen er fastgjort med bindeclips (Figur 1E). Sørg for, at rotteburet er dækket af dækslet uden den beskyttende bomuld (Figur 1F).
    3. Placer en CD-1-mus pr. bur på den ene side af buret. Placer et mærke på ydersiden af buret for nem identifikation af hver mus.
    4. Placer de udvalgte CD-1-mus i det sociale nederlagsapparat (figur 1F) 2 eller 3 dage før AcSD-protokollen starter (for at forbedre CD-1-territorialadfærd).
    5. Udfør en priming-session 1 dag før eksperimentet; Dette er vigtigt for at holde aggressionen konsekvent.
  2. Nederlag sessioner
    1. Udfør 2 sessioner om dagen (første session: 9, anden session: 2) i 4 dage, 8 sessioner i alt. Lav en tidsplan for at sikre, at angriberen vil være forskellig for hver session (se supplerende tabel 4 og supplerende tabel 5).
    2. Vej C57BL/6 teenagemusen, før du introducerer den til CD-1-siden af buret. Introducer en voksen hanmus >65 i 30 sekunder i CD-1-siden af nederlagsburet, og skift den derefter ud med en ung C57BL/6 PND 24-28-mus til en 10 minutter lang nederlagsepisode eller maksimalt 10 angreb pr. session.
    3. Adskil dyrene efter hvert angreb med en plastiklineal. Efter hver nederlagssession skal du kontrollere for skader og behandle dem med smertelindringscreme. Registrer antallet af skader.
    4. Placer den unge C57BL/6J-mus i det frie rum ved siden af en ukendt aggressor indtil næste session. Gentag proceduren med en anden aggressor hver session.
    5. Start sessionen med de eksperimentelle og aggressormus, der ikke blev parret den forrige session. Overvåg skaderne hos de voksne C57BL/6J-hanmus, der blev brugt til priming (se supplerende tabel 6).
  3. Følg nedenstående anbefalinger for dyrevelfærd og humane endepunkter.
    1. Følg standardproceduren for det tilsvarende institutionelle vurderingsudvalg for sociale nederlag og sørg for konstant veterinær evaluering.
    2. Overvåg musenes sundhed under hele undersøgelsen for at undgå dyrs lidelse og død.
    3. Kontroller, at den perforerede skillevæg er korrekt indstillet for at forhindre mus i at krydse til det andet rum.
    4. Giv dyrlægepersonalet besked, når et dyr har et sår, for passende overvågning, og påfør smertestillende creme dagligt, indtil såret er helt helet.
    5. Hvis en skade forværres (sår øges i størrelse), skal du begrænse anfaldene til 5 i næste session, så du kan komme dig Tjek for alvorlige kvæstelser. Alvorlige kvæstelser defineres som sår på i alt > 1 cm.
    6. Fjern og aflive straks dyr, der har en reduktion på 15%-20% af deres vægt fra den oprindelige kropsvægt; reduceret/nedsat bevægelsesaktivitet og nedsat pleje; mus med sår > 1 cm; afskåret penis eller bidemærker med hævelse af forbenene.
      BEMÆRK: Primær aflivning udføres via isofluran/CO2-gaskamre efterfulgt af sekundær aflivning udført ved cervikal dislokation.
  4. Styr mus
    1. Udfør 2 sessioner om dagen (første session: 9, anden session: 2) i 4 dage, 8 sessioner i alt. Lav en tidsplan for at sikre, at kontrolmus deler buret med en anden C57BL/6J-artsfælle hver session (se supplerende tabel 7 og supplerende tabel 8).
      BEMÆRK VENLIGST: Kontrolmus udsættes ikke for en aggressor. For at efterligne introduktionen til en ny CD-1-mus hver nederlagssession, parres kontrolmus med en ny konspecifik af samme køn og samme alder (ikke-kuldkammerat) hver session.
    2. Placer kontrolmusene i det sociale nederlagsapparat (figur 1) i et separat rum fra AcSD-musenes.
    3. Placer to kontrolmus pr. bur, en på hver side af buret. Huse musene i en anden side af buret eller helt andet bur, så de ikke genkender lugten. Drej kontrolmusene hver session.

Figure 1
Figur 1: Apparat til accelereret social nederlagsstress (AcSD) for unge mus. (A) Fra venstre mod højre, parrede ståltrådstoppe med 0,6 cm afstand mellem stængerne, klar perforeret polycarbonatskillevæg med perforeringsdiameter på 0,6 cm, bindemiddelclips til fastgørelse af trådtoppe, klart rottebur med dæklåg (uden bomuldsbeskyttelseslag). (B) Op: sammenligning mellem polycarbonatdelerne for kronisk socialt nederlag hos voksne (venstre) og AcSD hos unge (højre); Ned: tæt på polycarbonatskillevæggen til unge mus. (C) Op: sammenligning mellem ståltrådstoppene for kronisk socialt nederlag hos voksne (venstre) og AcSD hos unge (højre); Ned: Nærbillede af ståltrådstoppene. (D-F) Samling af det sociale nederlagsapparat. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Test af social interaktion

  1. Udfør SIT efter AcSD som beskrevet tidligere 57,58,59.
    1. Udfør SIT 24 timer efter den sidste session af AcSD. Udfør SIT under røde lysforhold (ikke under gult lys) mellem kl. 9 og 4.
    2. Indstil den firkantede hovedarena og videokameraet (se materialefortegnelsen). Hovedarenaen er opdelt i 3 områder: den sociale interaktionszone (SIZ), hjørnerne og centrum; Disse områder skal markeres i arenaen med en sort streg (brug en sort permanent markør). Brug følgende dimensioner og kriterier for hvert område.
      1. Sørg for, at SIZ er det firkantede område på 14 cm x 9 cm, der omgiver kabinettet. Hjørnerne er små, firkantede områder (9 cm x 9 cm) i hjørnerne af væggen modsat indhegningen og repræsenterer det fjerneste punkt fra SIZ. Centrum er området mellem SIZ og hjørnerne.
    3. Rengør arenaen og kabinetterne med en rensende hydrogenperoxidaseopløsning.
    4. Anbring identifikationsmærker for hvert dyr på gulvet til analyse. Registrer al dyreadfærd til offlineanalyse.
  2. Første session for at bestemme baseline-udforskning
    1. Placer et tomt trådnet mod en af arenaens vægge. Placer den eksperimentelle (besejrede eller kontrollerede) unge C57BL/6-mus midt i arenaen. Lad den udforske arenaen frit i 2,5 min. Hent musen.
    2. Rengør arenaen og kabinetterne med en rensende hydrogenperoxidaseopløsning.
  3. Anden session for social interaktion
    1. Placer en ukendt CD-1-mus inde i trådnetkabinettet. Placer kabinettet på samme sted som den forrige session.
    2. Genintroducer den samme unge C57BL/6-mus til arenaen. Lad den udforske arenaen frit i 2,5 min. Hent musene.
    3. Rengør arenaen og kabinetterne med en rensende hydrogenperoxidaseopløsning.
    4. Gentag processen for alle unge C57BL/6-mus (stressede mus og kontrolmus) i en modvægtig rækkefølge.
    5. Brug mere end én CD-1-mus til SIT for at mindske håndteringsstress og bias (f.eks. til en kohorte på 30 C57BL/6-mus, brug 4 CD-1-mus). Opvej dem blandt de unge mus.
      BEMÆRK: Denne test måler forsøgsmusenes tilgang og/eller undgåelsesadfærd mod et socialt mål, som først beskrevet af Krishnan5 og Golden7.
  4. Analyse
    1. Registrer den eller de tid, der er brugt i interaktionszonen og hjørnerne under begge sessioner af testen.
    2. Beregn det sociale interaktionsforhold som den tid, der bruges i interaktionszonen med den tilstedeværende CD-1-aggressor, divideret med den tid, der er brugt i interaktionszonen med CD-1-aggressoren fraværende.
    3. Klassificer stressede mus med et forhold < 1,00 som modtagelige og et forhold ≥ 1,00 som modstandsdygtige.
    4. Ekskluder dyr, der ikke udforsker arenaen under den første session (dvs. tilbragte 0 s i et af de udpegede områder) fra alle analyser for at kontrollere forskelle i bevægelsesaktivitet.
    5. Ekskluder alle dyr, der modtager 0 angreb i ≥4 sociale nederlagssessioner fra alle analyser for at forhindre ikke-repræsentative modstandsdygtige dyr.
    6. Ekskluder mus (ikke modtagelige), der ikke tilbringer mindst 61 s inden for interaktionszonen for at sikre, at høje sociale interaktionsforhold afspejler den faktiske interesse for det sociale mål.
    7. Ekskluder mus med outlier interaction ratio-scorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I alt fire forskellige eksperimenter blev udført ved hjælp af den kroniske sociale nederlagsstressmodel i unge C57BL/6 hanmus (PND 21). Denne model præsenterede imidlertid vigtige begrænsninger for dens anvendelse i tidlige unge C57BL/6-mus.

Udstyr, der kræves ændringer til unge C57BL/6-mus
Den første begrænsning var, at det udstyr, der blev brugt til det sociale nederlagsapparat, var designet til voksne mus. På grund af deres størrelse var unge C57BL/6-mus ved PND 21 i stand til at passere gennem perforeringerne af skillevæggene til aggressorsiden. Dette afbrød perioden med sansekontakt. Derudover var unge mus i stand til at flygte gennem tremmerne på ståltrådstoppene. Derfor blev udstyret modificeret for at forhindre musenes flugt (figur 1). Perforeringernes diameter blev ændret fra 1,1 cm til 0,6 cm (figur 1B), og ståltrådstoppen blev udskiftet fra en, der havde 1,1 cm afstand mellem stængerne, til en med 0,6 cm afstand (figur 1C). Derudover blev toppen fastgjort med clips, og rotteburene blev også dækket med plastikovertræk uden beskyttende bomuld. Flisstrøelsen blev også sat på et passende niveau for de unge mus (figur 1D-F).

AcSD-modellen kræver priming af voksne han-CD-1-mus for at sikre konsistente, aggressive anfald
Den anden og vigtigere begrænsning var manglen på konsistens i CD-1-musenes fysiske aggression mod de unge mus. Under de kroniske sociale nederlagssessioner varierede aggressionen fra nul aggressive angreb i løbet af 10 minutters sessionen til et eller to bid, der var dødelige på grund af den lille størrelse af de unge mus. Men hvis CD-1-musene blev brugt til mere end ét eksperiment, steg konsistensen i antallet af angreb.

Figur 2B viser antallet af anfald pr. dag for hver eksperimentel kohorte med kronisk socialt nederlag (P0, A0, A1 og A2). Der blev fundet en interaktion mellem dag og kohorte (figur 2B, tovejs gentagne mål ANOVA: F(27, 234) = 3,83, p < 0,0001), hovedeffekt af dag (F(6,288, 163,5) = 6,2, p < 0,0001) og hovedeffekt af kohorte (F(3, 26) = 3,8, p = 0,02). Post hoc-test afslørede forskelle mellem kohorter på dag 1, 2, 3 og 7 (Holm-Sidak post hoc-test: dag 1, P0 vs. A2, p = 0,02; A1 vs. A2, p = 0,02; dag 2, A1 vs. A2, p = 0,04; dag, 3 A0 vs. A1, p = 0,007; A1 vs. A2, p = 0,04; dag 7, A0 vs. A1, p = 0,04). Alle CD-1 mus i eksperiment P0 og A0 holdt op med at angribe i de sidste 3 dage. CD-1-mus, der blev brugt til eksperimenter P0 og A0, blev brugt i A1, hvor der var en konsistens i angreb (figur 2B), hvilket indikerer, at CD-1 var mere tilbøjelige til aggression, hvis de blev udsat for fysiske interaktioner før.

Af denne grund, som beskrevet i trin 2.1 og 2.2, blev CD-1-musene screenet specifikt for deres aggression over for de unge mus og primet med en voksen C57BL/6-han for aggression mod de unge C57BL/6-mus. Desuden blev AcSD brugt til at øge alderen fra PND 21 til PND 25 og stadig målrette mod tidlig ungdom.

Under AcSD-sessionerne øgede CD-1-mus antallet af angreb mod de unge mus i et mere konsistent mønster som vist i figur 2D. I modsætning til det kroniske sociale nederlagsparadigme blev der ikke fundet nogen signifikant interaktion mellem sessionen og den eksperimentelle kohorte (figur 2D, tovejs gentagne målinger ANOVA: F(35, 483) = 1,33, p = 0,1), der var en hovedeffekt af session (F(5,644, 389,5) = 14,15, p < 0,0001) og en hovedeffekt af kohorte (F(5, 69) = 7,91, p < 0,0001); Holm-Sidak post hoc-test afslørede ikke signifikante forskelle mellem kohorter. En sammenligning af gennemsnittet af anfald mellem kohorter afslørede, at denne effekt for det meste var drevet af kohorte A7, som havde et signifikant højere antal anfald (data ikke vist, envejs ANOVA F(5, 69) = 7,911, p < 0,0001; Holm-Sidak post hoc-tests : A3 vs. A6, p = 0,04; A7 vs. A5, p = 0,002; A7 vs. A6, p < 0,0001; A7 vs. A8, p = 0,0001).

Unge mus modtog flere angreb med primede CD-1-mus under AcSD end unge mus udsat for en kronisk social nederlagsprotokol (figur 2E, uparret t-test med Welchs korrektion, t = 15,40, df = 17,87, p < 0,0001) ved hjælp af naive (ikke-primede) CD-1-mus. Angrebene var ikke konsekvente under den kroniske sociale nederlagsprotokol, og faktisk blev flere forsøgsmus slet ikke angrebet.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning af antallet af anfald pr. dag mellem kronisk social nederlagsstress og AcSD. (A) Tidslinje for den kroniske sociale nederlagsstressmodel. (B) Antal angreb pr. dag for hver eksperimentel kohorte (P0, P1, A1 og A2) under kronisk social nederlagsstress hos unge C57BL/6 hanmus (tovejs gentagne målinger ANOVA). (C) Tidslinje for den accelererede sociale nederlagsstressmodel (AcSD). (D) Antal anfald pr. dag for hver eksperimentel kohorte (A3-A8) under AcSD hos unge C57BL/6 hanmus (tovejs gentagne målinger ANOVA). (E) Det gennemsnitlige antal anfald var signifikant højere for AcSD (uparret t-test med Welchs korrektion, ****p < 0,0001). Alle data er vist som middelværdi ± SEM. Forkortelser: CSDS = kronisk social nederlagsstress; SIT = test af social interaktion; PND = postnatal dag; P0, A0-A8 = etiketter for hver eksperimentel kohorte. Klik her for at se en større version af denne figur.

Angrebsmønster under AcSD-sessioner påvirker ikke social fænotype 24 timer senere
Efter eksponering for socialt nederlag viste de fleste unge hanmus ikke social undgåelse, når de blev testet i SIT (figur 3B, kronisk socialt nederlag: envejs ANOVA F(2, 43) = 14,57, p < 0,0001. F, AcSD: Kruskal-Wallis-test, H(2) = 72,35, p < 0,0001). For begge modeller var der ingen signifikante forskelle i antallet af angreb mellem socialt undgående og ikke-social-undgående besejrede mus (figur 3D, kronisk socialt nederlag: tovejs gentagne mål ANOVA, F(9, 252) = 4,07, p = 0,21. H. AcSD: tovejs gentagne mål ANOVA, F(7, 511) = 1,32, p = 0,24). Andelen af modstandsdygtige mus var dog højere efter kronisk socialt nederlag end efter AcSD-eksponering (figur 3C,G, 70 % vs. 55,26 %, binomial test (ensidig), p = 0,0047).

Figure 3
Figur 3: Sammenligning af social interaktionstest (SIT) score efter den kroniske sociale nederlagsstress og AcSD-paradigmerne. (A) Tidslinje for den kroniske sociale nederlagsstressmodel. (B) Fordeling af SIT-score efter kronisk social nederlagsstress i ungdomsårene (envejs ANOVA). (C) Andel af modstandsdygtige/modtagelige efter kronisk social nederlagsstress i ungdomsårene. (D) Antal angreb efter fænotype modtaget under kronisk social nederlagsstress, der blev ikke fundet signifikante forskelle mellem modstandsdygtige og modtagelige (tovejs gentagne målinger ANOVA). (E) Tidslinje for den accelererede sociale nederlagsstressmodel (AcSD). (F) Fordeling af SIT-score efter AcSD i ungdomsårene (Kruskal-Wallis). Dette tal er ændret fra57. (G) Andelen af modstandsdygtige/modtagelige efter AcSD i ungdomsårene. Dette tal er ændret fra57. (H) Antal anfald efter fænotype modtaget under AcSD der er ingen forskel mellem modstandsdygtig og modtagelig (tovejs gentagne målinger ANOVA). Dette tal er ændret fra59. **p < 0,001, ****p < 0,0001. Alle data er vist som gennemsnit ± SEM. Forkortelser: PND = postnatal dag; Con = kontroller; Res = modstandsdygtig; Sus = modtagelig. Klik her for at se en større version af denne figur.

AcSD kan bruges til unge C57BL/6 hunmus
Fordi PND 25 C57BL/6 han- og hunmus ikke har nået reproduktiv modenhed, kunne primede CD-1-mus præsentere aggressive angreb mod unge hunmus, som de gjorde mod unge hanmus. Priming-fasen måtte dog forlænges for at nå et ensartet antal angreb (figur 4A). Som vist i figur 4B blev der ikke fundet nogen interaktion mellem dag og kohorte på tværs af eksperimenter (figur 4B, tovejs gentagne målinger ANOVA: F(35.707) = 1.38, p = 0.07), der var en hovedeffekt af sessionen (F(6.286, 634.9) = 16.1, p < 0.0001) og en hovedeffekt af kohorten (F(5, 101) = 11.34, p < 0.0001; Holm-Sidak post hoc-tests : session 2 C4 vs C8, p = 0,03; session 6 C7 vs C4, p = 0,02; C7 vs C5, p = 0,02; session 7 C8 vs C3, p = 0,02; C8 vs C4, p = 0,045). Størstedelen af unge C57BL/6 hunmus udsat for AcSD var modstandsdygtige over for social undgåelse (figur 4C, Brown-Forsythe's ANOVA: F(2,113,4) = 27,2, p < 0,0001), svarende til unge hanmus. Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel i antallet af angreb mellem modstandsdygtige og modtagelige mus (figur 4E, tovejs gentagne målinger ANOVA, session x fænotypeinteraktion: F(7, 714) = 0,73, p = 0,64, hovedeffekt af session F(6,375, 650,3) = 7,02, p < 0,0001, ingen hovedeffekt af fænotype F(1, 102) = 0,4, p = 0,53).

Figure 4
Figur 4: AcSD i unge hunmus. (A) Tidslinje for eksperimentet. (B) Antal angreb pr. dag pr. eksperiment under AcSD (tovejs gentagne målinger ANOVA). (C) Fordeling af SIT-score efter AcSD i ungdomsårene hos hunmus (Brown-Forsythe's ANOVA). (D) Andel af modstandsdygtige/modtagelige efter AcSD i ungdomsårene (højre). (E) Antal angreb efter fænotype modtaget under AcSD; der blev ikke fundet signifikante forskelle mellem modstandsdygtige og modtagelige mus (tovejs gentagne målinger ANOVA). Alle data er vist som gennemsnit ± SEM. (C-E) Disse tal er ændret fra59. Forkortelser: SIT = social interaktionstest; PND = postnatal dag; C3-C8 = etiketter for hver eksperimentel kohorte; Con = kontroller; Res = modstandsdygtig; Sus = modtagelig. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel 1: Scoringsarkskabelon for dag 1 af screening med voksne. Forkortelser: CD-1 = ID for screenede CD-1-mus, Exp = Eksperiment-ID, 3 min = Varighed af screeningssessionen for C57BL/6 voksne mus, BL6 ID = ID for C57BL/6 voksne mus brugt til screening, Lat 1 ADULTS = Latency for det første angreb fra CD-1 mod C57BL/6 voksenmusen, # aggressioner = Antal angreb udført af CD-1. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: Scoringsarkskabelon til screening med voksne og unge. Forkortelser: Exp = Eksperiment-ID, 1 min = Varighed af screeningssessionen for C57BL/6 voksne mus, BL6 ID = ID for C57BL/6 voksne mus brugt til screening, Lat 1 ADULTS = Latens af det første angreb fra CD-1 mod C57BL/6 voksenmus, # aggressioner = Antal angreb udført af CD-1, 5 min = Varighed af screeningssessionen for C57BL/6 unge mus, BL6 Ad = ID for C57BL/6 unge mus brugt til screening, Lat 1 Teenagere = Latens af det første angreb fra CD-1 mod C57BL/6 ungdomsmus, CD-1 = ID af CD-1 mus screenet. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 3: Scoringsarkskabelon til primingfasen. Forkortelser: CD-1 = ID for CD-1 mus brugt til priming, Exp = Eksperiment ID, 30 sek = Varighed af priming session for C57BL/6 voksne mus, BL6 ID = ID for C57BL/6 voksne mus brugt til priming, Lat 1 ADULTS = Latens af det første angreb fra CD-1 mod C57BL/6 voksenmus, # aggressioner = Antal angreb udført af CD-1, Min: 3 = Varighed af priming-sessionen for C57BL/6 teenagemus, BL6 Ad = ID for C57BL/6 teenagemus brugt til priming, Lat 1 Teenagere = Latens af det første angreb fra CD-1 mod C57BL/6 teenagemus, # mountings = Antal mountings modtaget af C57BL/6 teenagemus. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 4: Scoringsarkskabelon til social nederlagsplanlægning (20 unge mus). Forkortelser: CD1 = ID for CD-1 mus, E = Eksperiment, H = Fugtighed, 1 st = Session 1, 2nd = Session 2, BL6 voksen = ID for C57BL/6 voksne mus brugt til priming, Vægt = Vægt af C57BL/6 unge mus, # angreb = Antal angreb udført af CD-1, # sår = Antal sår modtaget af C57BL/6 unge mus. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 5: Eksempel på planlægning af socialt nederlag. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 6: Skabelon til skadesovervågning af voksne C57BL/6 hanmus. Forkortelser: 1. - # sår = Antal sår modtaget af C57BL/6 voksen mus i session 1, 2. - # sår = Antal sår modtaget af C57BL/6 voksenmus i session 2, BL6 = ID for C57BL/6 voksne mus brugt til priming. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 7: Skabelon til planlægning af kontrolgruppe (10 unge mus). Regler for scrambling: Gentag ikke den samme konspecifike; en mus kan ikke gentage den samme side af kassen på samme dag; mus skal krypteres med mus fra forskellige bure fra deres hjemmebur; hjemmebure er nummereret; musenumre angives afhængigt af hjemmeburets nummer; Besejrede og kontrolgrupper tages tilfældigt fra hjemmeburet. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 8: Eksempel på planlægning af kontrolgruppe. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Konsekvent, aggressiv adfærd hos CD-1-mus
Under screeningsfasen er det meget vigtigt at notere sig al den adfærd, der vises af CD-1 (jagt, monteringsadfærd, sniffing, pleje eller bid) og nøje at følge disse optegnelser, når du vælger CD-1-musene til AcSD. Det er sandsynligt, at en CD-1-mus, der interagerer med den unge mus uden at angribe den, vil udvikle aggressivitet over for unge mus under priming. I modsætning hertil vil en CD-1-mus, der angriber en voksen mus, men ikke nærmer sig en ung mus, sandsynligvis ikke udvikle aggressivitet over for unge mus.

CD-1-priming-fasen gør det muligt at udvikle aggressiv adfærd over for unge mus. Derfor er det afgørende at have et nøjagtigt register over adfærden for udvælgelsen af musene. Desuden er det vigtigt altid at screene CD-1-musene før et nyt eksperiment, selv når en CD-1-mus har været igennem nederlag før. Nogle CD-1-mus kan stoppe med at angribe unge mus, når de efterlades uforstyrret i deres hjemmebure i en periode, andre kan udvikle øget territorial adfærd, fordi de er anbragt i isolation.

Til priming af CD-1-musene anbefaler protokollen 3 dage. Hvis der anvendes naive CD-1-mus, kan primingen forlænges, hvis CD-1-musene ikke angriber de unge mus aktivt. For CD-1-mus, der havde været igennem socialt nederlag med unge mus, kan varigheden af denne priming-fase reduceres.

Screenings- og priming-faserne er afgørende for vellykkede AcSD-sessioner. For eksempel vil CD-1-mus, der er blevet korrekt primet, angribe og nå 10-angrebsgrænsen hurtigere end en mindre aggressiv CD-1-mus, hvilket giver mulighed for korte nederlagsepisoder.

Under AcSD er det afgørende at adskille dyrene, når angrebene er meget voldsomme (dvs. CD-1-musen slipper ikke C57BL/6J-musen); ellers vil de unge mus blive såret, og angreb skal begrænses. Behandling af skader er også meget vigtig for at undgå infektioner; Det anbefales ikke at bruge olieagtige salver til behandling af skader, fordi dyr vil slikke salven væk, miste hår i processen og udsætte skaden.

Fejlfinding af AcSD til brug for unge C57BL/6 han- og hunmus
Den kroniske sociale nederlagsstressmodel præsenterede vigtige begrænsninger for dens anvendelse i de tidlige ungdomsår hos både han- og hunmus C57BL/6. I dette afsnit beskrives de ændringer, der blev foretaget til udviklingen af AcSD-modellen i ungdomsårene.

Udstyr: Den komplette liste over udstyr er angivet i materialetabellen. C57BL/6 teenagemusene i de tidlige ungdomsår (PND 21-30) var for små til det udstyr, der tidligere er beskrevet, og som tidligere er blevet brugt i laboratoriet60. Diameteren af perforeringerne på akrylglasdelerne er stor nok til, at C57BL/6-mus kan krydse fra det ene rum til det andet, hvor aggressoren befinder sig. For at forhindre dette blev der lavet akrylglasdelere, der har perforeringer med en lille diameter. Derudover skulle ståltrådstoppen fastgøres med clips for at forhindre mus i at undslippe burene. De anvendte dæklåg bruges typisk til ventilerede bure. I dette tilfælde blev disse dæklåg brugt uden den beskyttende bomuld for at tillade ordentlig ventilation og for at forhindre mus i at flygte fra buret. Det er vigtigt at overveje, at mængden af træflisstrøelse, der bruges, skal gøre det muligt for unge mus at nå maden og vanddispenseren placeret på låget. Store mængder flis kan dog blive våde.

Udvælgelse af CD-1-musene: I den kroniske model screenes CD-1-musene for aggressiv adfærd inden eksperimentets begyndelse. CD-1-mus udvælges efter 3 dages screening, og deres aggressive adfærd vurderes. Efter screening udvælges de dyr, der har latenser til at angribe under 30 år, og som viser konsekvente angreb, til næste fase. Men under de kroniske sociale nederlagseksperimenter opretholdt CD-1-musene ikke et ensartet antal angreb i 10 dage (figur 2B). Derfor måtte flere CD-1-mus fjernes fra forsøget på grund af manglende aggression over for den ubudne mus. Faktisk, mens kun en lille del af CD-1-musene angreb den ubudne mus, var nogle af disse mus ekstremt aggressive og nogle gange alvorligt sårede hanmusene C57BL/6 PND 21. Derfor blev screeningen af CD-1-musene ændret til at selektere aggressive mus mod unge mus, hvilket øgede den fysiske aggression.

Konsistens af fysisk aggression: Konsekvent fysisk aggression fører til at opnå et hurtigt og robust nederlag for den ubudne gæst6. For at standardisere procedurer mellem eksperimenter og eksperimenter blev der brugt en operationel definition af angreb57, hvilket muliggjorde præcis kvantitativ måling af aggressivitet.

Priming af aggressivitet: Under de kroniske sociale nederlagseksperimenter varierede antallet af angreb meget og faldt i løbet af eksperimentets sidste dage (figur 2B). For at øge CD-1-musenes aggressive adfærd over for de unge C57BL/6-hanmus blev CD-1-musene primet til at være aktivt aggressive, uanset hvilke mus der blev introduceret til deres hjemmebur. Denne adfærd blev opnået ved at introducere en voksen C57BL/6 hanmus i 1 minut før den unge mus, hvilket opmuntrede CD-1-musen til at angribe de unge mus, efter at den voksne var blevet hentet.

Modellens varighed: Unge C57BL/6-mus ved PND 21 er meget små, og CD-1-mus kan skade dem alvorligt med blot et enkelt angreb. For at målrette mod de tidlige teenageår og stadig have gentagne sessioner med socialt nederlag blev der derfor valgt en alternativ model til den klassiske 10-dages kroniske sociale nederlagsstress. Den accelererede sociale nederlagsstress (AcSD)42 består af to sessioner med fysisk aggression om dagen, en session om morgenen og en om eftermiddagen, i alt 4 dage (8 sessioner). AcSD-modellen tillod en stigning i alderen på de unge mus fra PND 21 til PND 25, stadig kun rettet mod tidlige teenageår.

Begrænsninger af AcSD i ungdomsårene
AcSD-modellen har nogle begrænsninger. Sammenlignet med den kroniske sociale nederlagsmodel hos voksne kræver AcSD screening af dobbelt så mange CD-1-mus af unge C57BL/6-mus. Varigheden af primingfasen kan variere afhængigt af CD-1-musenes aggressive adfærd; som sådan bør AcSD-tidsplanen planlægges med forventning, og alle disse variabler skal overvejes. Da de fleste unge mus vil vise modstandsdygtighed over for social undgåelse efter AcSD-eksponering, bør forsøgskohorten omfatte mindst 20 dyr for hanner og 30 for hunner for at opnå et repræsentativt antal modtagelige mus.

AcSD i unge mus giver konsistente resultater på tværs af eksperimentelle kohorter
Efter at have været udsat for social stress med både kronisk socialt nederlag og AcSD-protokoller, viste de fleste unge hanmus modstandsdygtighed over for social undgåelse. For den kroniske sociale nederlagsmodel var det imidlertid ikke muligt at kassere variationen i antallet af angreb fra CD-1 som en forvirrende variabel. I modsætning hertil, til AcSD-eksperimenter, primes CD-1-mus før hver nederlagssession for at opnå et ensartet antal angreb på tværs af sessioner (figur 2D,E). Samlet set viser alle de eksperimentelle kohorter af mus, der er eksponeret for AcSD, et lignende antal angreb på tværs af sessioner (figur 2D); dette er dog ikke tilfældet for musekohorter, der er udsat for den kroniske sociale nederlagsmodel (figur 2B).

Brug af den kroniske sociale nederlagsstress hos voksne C57BL/6 hunmus har været udfordrende i sammenligning med andre, der bruger denne model i andre arter og stammer 9,13,45,61. For AcSD-eksperimenter i unge C57BL/6 hunmus blev primingfasen forlænget, hvilket sikrede den aggressive adfærd hos CD-1-musene (figur 4A). Der kan dog observeres variation i antallet af anfald på tværs af kvindelige eksperimentelle kohorter (figur 4B). Ikke desto mindre viste alle CD-1-mus i disse eksperimenter aggressiv adfærd over for hunner. For at øge antallet af angreb kan primingen med hanmusene forlænges til 1 min. Som hos hanner var andelen af unge C57BL/6 hunmus, der var modstandsdygtige over for social undgåelse, højere end dem, der viste modtagelighed (figur 4C,D). Desuden var antallet af angreb ikke forskelligt mellem modstandsdygtige og modtagelige mus (figur 4E), hvilket indikerer, at fænotypen er uafhængig af angreb. AcSD kan bruges til unge C57BL/6 hunmus, og eksperimenter kan udføres på samme tid på begge køn med de samme CD-1-mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af Canadian Institutes for Health Research (CF Grant Numbers: MOP-74709; PJT 190045), National Institute on Drug Abuse (CF Grant number: R01DA037911), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (CF Grant Number: 2982226). Andrea Pantoja-Urban blev støttet af The National Council for Humanities, Science and Technologies/Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT) fra Mexico og FRQNT - Merit scholarship program for udenlandske studerende (PBEEE). Samuel Richer blev støttet af et stipendium fra Integrated Program of Neuroscience ved McGill University. Figurillustrationer blev skabt ved hjælp af skabeloner fra BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 adolescent mice  In house breeding Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice  Charles River Laboratories Strain Code: 027 Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice  Jackson Labs Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664 Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice  Charles River Laboratories Strain Code: 022 Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution  Virox Animal Health DIN 02537222 Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider  Manufactured by Douglas Hospital, custom order 0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages  Allentown 24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding Inotiv Envigo T.6060 iso-BLOX 2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding Inotiv Envigo Teklad 7090, 7115 Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops STAPLES Item #: 132429, Model #: 24178-CA 51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops Item #: 132367, Model #: 24172-CA 32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream Polysporin Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops  24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure  Johnston industrial plastics 11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena PEXIGLAS 45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas) 
Stopwatch  For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights  Swann SRDVR-44580V  Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software  Topscan 2.0 Clever Systems Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miczek, K. A. A new test for aggression in rats without aversive stimulation: Differential effects of d-amphetamine and cocaine. Psychopharmacology. 60, 253-259 (1979).
  2. Kudryavtseva, N., Bakshtanovskaya, I., Koryakina, L. Social model of depression in mice of c57bl/6j strain. Pharmacol Biochem Behav. 38 (2), 315-320 (1991).
  3. Blanchard, R. J., Mckittrick, C. R., Blanchard, D. C. Animal models of social stress: Effects on behavior and brain neurochemical systems. Physiol Behav. 73 (3), 261-271 (2001).
  4. Berton, O., et al. Essential role of bdnf in the mesolimbic dopamine pathway in social defeat stress. Science. 311 (5762), 864-868 (2006).
  5. Krishnan, V., et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell. 131 (2), 391-404 (2007).
  6. Bartolomucci, A., Fuchs, E., Koolhaas, J. M., Ohl, F. Acute and chronic social defeat: Stress protocols and behavioral testing. Neuromethods. 42, 261-275 (2009).
  7. Golden, S. A., Covington Iii, H. E., Berton, O., Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nat Protoc. 6 (8), 1183-1191 (2011).
  8. Bourke, C. H., Neigh, G. N. Behavioral effects of chronic adolescent stress are sustained and sexually dimorphic. Horm Behav. 60 (1), 112-120 (2011).
  9. Steinman, M. Q., Trainor, B. C. Sex differences in the effects of social defeat on brain and behavior in the California mouse: Insights from a monogamous rodent. Semin Cell Dev Biol. 61, 92-98 (2017).
  10. Takahashi, A., et al. Establishment of a repeated social defeat stress model in female mice. Sci Rep. 7 (1), 12838 (2017).
  11. Wright, E. C., et al. Sexual differentiation of neural mechanisms of stress sensitivity during puberty. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (43), 2306475120 (2023).
  12. Yin, W., et al. Repeated social defeat in female mice induces anxiety-like behavior associated with enhanced myelopoiesis and increased monocyte accumulation in the brain. Brain Behav Immun. 78, 131-142 (2019).
  13. Van Doeselaar, L., et al. Chronic social defeat stress in female mice leads to sex-specific behavioral and neuroendocrine effects. Stress. 24 (2), 168-180 (2021).
  14. Hollenstein, T., Lougheed, J. P. Beyond storm and stress: Typicality, transactions, timing, and temperament to account for adolescent change. Am Psychol. 68 (6), 444 (2013).
  15. Sawyer, S. M., Azzopardi, P. S., Wickremarathne, D., Patton, G. C. The age of adolescence. Lancet Child Adolesc Health. 2 (3), 223-228 (2018).
  16. Adriani, W., Laviola, G. Windows of vulnerability to psychopathology and therapeutic strategy in the adolescent rodent model. Behav Pharmacol. 15 (5), 341-352 (2004).
  17. Reynolds, L. M., et al. Early adolescence is a critical period for the maturation of inhibitory behavior. Cereb Cortex. 29 (9), 3676-3686 (2019).
  18. Reynolds, L. M., et al. Amphetamine disrupts dopamine axon growth in adolescence by a sex-specific mechanism in mice. Nat Commun. 14 (1), 4035 (2023).
  19. Sisk, L. M., Gee, D. G. Stress and adolescence: Vulnerability and opportunity during a sensitive window of development. Curr Opin Psychol. 44, 286-292 (2022).
  20. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neurosci Biobehav Rev. 24 (4), 417-463 (2000).
  21. Reynolds, L. M., Flores, C. Mesocorticolimbic dopamine pathways across adolescence: Diversity in development. Front Neural Circuits. 15, 735625 (2021).
  22. Manitt, C., et al. The netrin receptor dcc is required in the pubertal organization of mesocortical dopamine circuitry. J Neurosci. 31 (23), 8381-8394 (2011).
  23. Reynolds, L. M., et al. Dcc receptors drive prefrontal cortex maturation by determining dopamine axon targeting in adolescence. Biol Psychiatry. 83 (2), 181-192 (2018).
  24. Kalsbeek, A., Voorn, P., Buijs, R., Pool, C., Uylings, H. Development of the dopaminergic innervation in the prefrontal cortex of the rat. J Comp Neurol. 269 (1), 58-72 (1988).
  25. Cuesta, S., et al. Dcc-related developmental effects of abused-versus therapeutic-like amphetamine doses in adolescence. Addict Biol. 25 (4), 12791 (2020).
  26. Bekhbat, M., et al. Adolescent stress sensitizes the adult neuroimmune transcriptome and leads to sex-specific microglial and behavioral phenotypes. Neuropsychopharmacology. 46 (5), 949-958 (2021).
  27. Hammerslag, L. R., Gulley, J. M. Age and sex differences in reward behavior in adolescent and adult rats. Dev Psychobiol. 56 (4), 611-621 (2014).
  28. Wheeler, A. L., et al. Adolescent cocaine exposure causes enduring macroscale changes in mouse brain structure. J Neurosci. 33 (5), 1797-1803 (2013).
  29. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell Tissue Res. 354, 99-106 (2013).
  30. Makinodan, M., Rosen, K. M., Ito, S., Corfas, G. A critical period for social experience-dependent oligodendrocyte maturation and myelination. Science. 337 (6100), 1357-1360 (2012).
  31. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces a depression-like phenotype in adolescent male c57bl/6 mice. Stress. 17 (3), 247-255 (2014).
  32. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces depression-like behavior and alters spine morphology in the hippocampus of adolescent male c57bl/6 mice. Neurobiol Stress. 5, 54-64 (2016).
  33. Latsko, M. S., Farnbauch, L. A., Gilman, T. L., Lynch Iii, J. F., Jasnow, A. M. Corticosterone may interact with peripubertal development to shape adult resistance to social defeat. Horm Behav. 82, 38-45 (2016).
  34. Zhang, F., Yuan, S., Shao, F., Wang, W. Adolescent social defeat induced alterations in social behavior and cognitive flexibility in adult mice: Effects of developmental stage and social condition. Front Behav Neurosci. 10, 149 (2016).
  35. Xu, H., et al. Effects of adolescent social stress and antidepressant treatment on cognitive inflexibility and bdnf epigenetic modifications in the mpfc of adult mice. Psychoneuroendocrinology. 88, 92-101 (2018).
  36. Huang, G. B., et al. Effects of chronic social defeat stress on behaviour, endoplasmic reticulum proteins and choline acetyltransferase in adolescent mice. Int J Neuropsychopharmacol. 16 (7), 1635-1647 (2013).
  37. Hasegawa, S., et al. Dysfunction of serotonergic and dopaminergic neuronal systems in the antidepressant-resistant impairment of social behaviors induced by social defeat stress exposure as juveniles. Int J Neuropsychopharmacol. 21 (9), 837-846 (2018).
  38. Resende, L., et al. Social stress in adolescents induces depression and brain-region-specific modulation of the transcription factor max. Transl Psychiatry. 6 (10), e914 (2016).
  39. Mouri, A., et al. Juvenile social defeat stress exposure persistently impairs social behaviors and neurogenesis. Neuropharmacology. 133, 23-37 (2018).
  40. Rodriguez-Arias, M., et al. Social defeat in adolescent mice increases vulnerability to alcohol consumption. Addict Biol. 21 (1), 87-97 (2016).
  41. Montagud-Romero, S., et al. Repeated social defeat and the rewarding effects of cocaine in adult and adolescent mice: Dopamine transcription factors, probdnf signaling pathways, and the trkb receptor in the mesolimbic system. Psychopharmacology. 234, 2063-2075 (2017).
  42. Wilkinson, M. B., et al. A novel role of the wnt-dishevelled-gsk3β signaling cascade in the mouse nucleus accumbens in a social defeat model of depression. J Neurosci. 31 (25), 9084-9092 (2011).
  43. Hyer, M., et al. Chronic adolescent stress causes sustained impairment of cognitive flexibility and hippocampal synaptic strength in female rats. Neurobiol Stress. 14, 100303 (2021).
  44. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain Behav Immun. 76, 248-257 (2019).
  45. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain Behav Immun. 30, 88-94 (2013).
  46. Dalsgaard, S., et al. Incidence rates and cumulative incidences of the full spectrum of diagnosed mental disorders in childhood and adolescence. JAMA psychiatry. 77 (2), 155-164 (2020).
  47. Pedersen, C. B., et al. A comprehensive nationwide study of the incidence rate and lifetime risk for treated mental disorders. JAMA psychiatry. 71 (5), 573-581 (2014).
  48. Heim, C., Shugart, M., Craighead, W. E., Nemeroff, C. B. Neurobiological and psychiatric consequences of child abuse and neglect. Dev Psychobiol. 52 (7), 671-690 (2010).
  49. Kessler, R. C., Petukhova, M., Sampson, N. A., Zaslavsky, A. M., Wittchen, H. U. Twelve-month and lifetime prevalence and lifetime morbid risk of anxiety and mood disorders in the united states. Int J Methods Psychiatr Res. 21 (3), 169-184 (2012).
  50. Boyd, A., et al. Gender differences in mental disorders and suicidality in europe: Results from a large cross-sectional population-based study. J Affect Disord. 173, 245-254 (2015).
  51. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex differences and stress across the lifespan. Nat Neurosci. 18 (10), 1413-1420 (2015).
  52. Hankin, B. L., Mermelstein, R., Roesch, L. Sex differences in adolescent depression: Stress exposure and reactivity models. Child Dev. 78 (1), 279-295 (2007).
  53. Kim, S., Colwell, S. R., Kata, A., Boyle, M. H., Georgiades, K. Cyberbullying victimization and adolescent mental health: Evidence of differential effects by sex and mental health problem type. J Youth Adolesc. 47, 661-672 (2018).
  54. Filipponi, C., Petrocchi, S., Camerini, A. L. Bullying and substance use in early adolescence: Investigating the longitudinal and reciprocal effects over 3 years using the random intercept cross-lagged panel model. Front Psychol. 11, 571943 (2020).
  55. Brody, G. H., Yu, T., Chen, E., Miller, G. E. Persistence of skin-deep resilience in african american adults. Health Psychol. 39 (10), 921 (2020).
  56. Rijlaarsdam, J., Cecil, C. A., Buil, J. M., Van Lier, P. A., Barker, E. D. Exposure to bullying and general psychopathology: A prospective, longitudinal study. Res Child Adolesc Psychopathol. 49, 727-736 (2021).
  57. Vassilev, P., et al. Unique effects of social defeat stress in adolescent male mice on the netrin-1/dcc pathway, prefrontal cortex dopamine and cognition. eNeuro. 8 (2), (2021).
  58. Vassilev, P., et al. Custom-built operant conditioning setup for calcium imaging and cognitive testing in freely moving mice. eNeuro. 9 (1), (2022).
  59. Pantoja-Urbán, A. H., et al. Gains and losses: Resilience to social defeat stress in adolescent female mice. Biol Psychiatry. 95 (1), 37-47 (2024).
  60. Torres-Berrío, A., et al. Dcc confers susceptibility to depression-like behaviors in humans and mice and is regulated by mir-218. Biol Psychiatry. 81 (4), 306-315 (2017).
  61. Ver Hoeve, E. S., Kelly, G., Luz, S., Ghanshani, S., Bhatnagar, S. Short-term and long-term effects of repeated social defeat during adolescence or adulthood in female rats. Neuroscience. 249, 63-73 (2013).

Tags

Nøgleord: Social nederlagsstress Unge mus C57BL/6 Mand og kvinde Social undgåelse Acereret Social Defeat Stress (AcSD) model Hjerneudvikling Adfærdsmæssige resultater
Social Defeat Stress Model for unge C57BL/6 han- og hunmus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantoja-Urbán, A. H., Richer,… More

Pantoja-Urbán, A. H., Richer, S., Giroux, M., Nouel, D., Flores, C. Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL/6 Male and Female Mice. J. Vis. Exp. (205), e66455, doi:10.3791/66455 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter