Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Social Defeat Stress Modell för ungdomar C57BL/6 han- och honmöss

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/66455
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2,3,4,5
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2Douglas Mental Health University Institute, McGill University, 3Department of Psychiatry, McGill University, 4Department of Neurology and Neurosurgery, Faculty of Medicine, McGill University, 5Ludmer Centre for Neuroinformatics & Mental Health, McGill University

Summary

Vi utvecklade en accelererad stressmodell för social förlust för tonåringar C57BL/6, som fungerar på både hanar och honor och tillåter exponering under diskreta tonårsperioder. Exponering för denna modell inducerar socialt undvikande, men endast i en undergrupp av besegrade han- och honmöss.

Abstract

Sociala motgångar i tonåren är vanliga och kan ha en negativ inverkan på den psykiska hälsan. Modellering av social stress hos unga han- och hongnagare behövs för att förstå dess effekter på pågående hjärnutveckling och beteenderesultat. Chronic Social Defeat Stress Paradigm (CSDS) har använts i stor utsträckning för att modellera social stress hos vuxna C57BL/6-hanmöss genom att utnyttja det aggressiva beteendet som en vuxen hangnagare uppvisar mot en inkräktare som invaderar dess territorium. En fördel med detta paradigm är att det gör det möjligt att kategorisera besegrade möss i motståndskraftiga och mottagliga grupper baserat på deras individuella skillnader i socialt beteende 24 timmar efter den senaste nederlagssessionen. Att implementera denna modell på C57BL/6-möss i tonåren har varit en utmaning eftersom vuxna eller tonåriga möss vanligtvis inte attackerar manliga eller kvinnliga möss i tidig tonår och eftersom tonåren är en kort period i livet som omfattar diskreta temporala sårbarhetsfönster. Denna begränsning övervanns genom att anpassa en accelererad version av CSDS för att användas för unga han- och honmöss. Detta 4-dagars stressparadigm med 2 fysiska attacksessioner per dag använder en C57BL/6 manlig vuxen för att förbereda CD-1-musen för aggressivitet så att den lätt attackerar den manliga eller kvinnliga tonårsmusen. Denna modell kallades accelererad social nederlagsstress (AcSD) för tonårsmöss. Ungdomars exponering för AcSD inducerar socialt undvikande 24 timmar senare hos både hanar och honor, men bara hos en undergrupp av besegrade möss. Den här sårbarheten inträffar trots att antalet attacker är konsekventa mellan sessioner mellan motståndskraftiga och mottagliga grupper. AcSD-modellen är tillräckligt kort för att tillåta exponering under diskreta perioder inom tonåren, tillåter segregering av möss enligt närvaron eller frånvaron av socialt undvikande beteende, och är den första tillgängliga modellen för att studera social nederlagsstress hos unga C57BL/6-honmöss.

Introduction

Paradigmet för kronisk social nederlagsstress används ofta för att modellera social stress hos vuxna >65 hangnagare efter förlossningen (PND). Detta paradigm är baserat på det naturliga aggressiva beteendet hos en vuxen gnagare när en inkräktare invaderar dess territorium. Denna modell används på en mängd olika gnagararter, inklusive råttor, hamstrar och möss 1,2,3,4,5,6,7,8,9, och består av en kombination av fysisk aggression och psykologisk stress som varar i cirka 10 dagar, under vilken en inkräktande gnagare experimenterar med några minuters fysisk aggression från den bosatta gnagaren. De två gnagarna stannar kvar i den boendes hembur, åtskilda av en avdelare som tillåter sensorisk men inte fysisk kontakt7. I musförsök är de vanligaste bofasta/aggressormössen pensionerade uppfödare schweiziska CD-1-möss, som uppvisar ett robust territoriellt beteende mot inkräktande möss 6,7. För inkräktarmöss är den bäst karakteriserade stammen inavelsen C57BL/6 stam 2,4,5. Den besegrade musen utsätts för en ny angripare varje dag för att förhindra tillvänjning till angriparen. Kontrollmöss hålls med olika artfränder varje dag. 24 timmar efter den senaste nederlagssessionen testas experimentella möss i ett socialt interaktionstest (SIT) där de kan utforska ett öppet fält i frånvaro (inget mål) eller närvaro av en ny CD-1-mus (mål). Kontrollmöss tillbringar mer tid i interaktionszonen med målet jämfört med den icke-målinriktade delen av uppgiften. Besegrade möss klassificeras som mottagliga (ratio<1) eller resilienta (ratio>1) enligt ett förhållande för social interaktion (tid tillbringad i interaktionszonen med aggressorn närvarande/tid tillbringad i interaktionszonen med aggressorn frånvarande). Denna procedur ger ett användbart verktyg för att studera individuella skillnader i reaktion på stress.

Fram till de senaste åren har stressmodellen för kronisk social förlust främst använts på vuxna hanmöss eftersom de accentuerade manliga dominanshierarkierna innebär att man slåss mot hanar men inte mot honor 6,7. Dessutom attackerar hangnagare vanligtvis inte honor; Istället ägnar de sig åt parningsbeteenden10. Trots dessa hinder har olika strategier utvecklats för att anpassa det kroniska stressparadigmet för sociala nederlag för vuxna honmöss. Till exempel är den kaliforniska musmodellen för socialt nederlag baserad på den naturliga aggressionen hos denna monogama art från båda könen när de försvarar sitt territorium 9,11. Andra tillvägagångssätt fokuserar på att inducera aggressivt beteende hos CD-1-mössen genom att stimulera deras ventromediala hypotalamus att ha ett konsekvent aggressivt beteende10,12, eller genom att applicera hanurin på de experimentella vuxna honmössen för att ta emot attacker från CD-1-aggressorer13. Denna förhöjda och konsekventa aggression hos CD-1-mössen är avgörande för att den experimentella inkräktaromen ska visa tydliga beteendemässiga tecken på underordning inför de upprepade attackerna från angriparenunder den tid som interaktionen pågår.

Anpassning av modellen för kronisk social förlust för användning hos ungdomar C57BL/6 möss
Tonåren är en period som kännetecknas av en betydande psykosocial mognad, som utvecklas parallellt med förändringar i hjärnans mikro- och makroarkitektur, särskilt i prefrontala cortex. Hos både människor och gnagare finns det liten konsensus om den specifika starten och slutet av tonårsperioden14,15. Dessutom finns det kritiska sårbarhetsfönster inom tonåren för upplevelseinducerade störningar av pågående hjärn- och kognitiv utveckling 16,17,18,19. Puberteten och tonåren förekommer samtidigt, men dessa termer är inte synonyma. Puberteten betecknar början på sexuell mognad, medan tonåren representerar en bredare fas som kännetecknas av den gradvisa övergången från ett ungdomligt tillstånd till att uppnå självständighet20. Olika grupper har föreslagit att tonåren hos möss sträcker sig från avvänjning (PND 21) till vuxen ålder (PND 60)21. Särskilt kan tidiga tonåren kallas den första och andra veckan efter avvänjning (PND 21-34) och mitten av tonåren som PND 35-48-perioden. Dessa intervall omfattar diskreta utvecklingsperioder avseende till exempel utvecklingen av dopaminsystemet 22,23,24, sårbarhet för läkemedelseffekter på utvecklande neuronala nätverk 17,25,26,27 och distinkta beteendeegenskaper 16,20,28,29,30 . – Herr talman,

Kampbeteende från den bosatta musen krävs för protokollet för socialt nederlag. Men precis som med honmöss engagerar sig hanar vanligtvis inte i aggressiva interaktioner med möss i tidiga tonåren, möjligen för att de inte uppfattar dem som ett hot. De flesta studier som undersöker effekterna av kronisk social förlust hos ungdomar C57BL/6-möss har utförts under mitten av tonåren 31,32,33,34,35; andra specificerar inte den postnatala dagen för ungdomarnas exponering36,37, eller förlänger dagarna för nederlaget till tidig vuxen ålder38 eller tillåter inte sensorisk kontakt39; Andra studier på tonårsmöss använder andra stammar40,41. Egenskaperna hos dessa studier med kronisk social nederlagsstress hos tonårsmöss sammanfattas i tabell 1.

Vår forskargrupp är intresserad av att rikta in sig på specifika exponeringsfönster hos ungdomar, inklusive tidiga tonår, hos C57BL/6-möss. På grund av den korta varaktigheten av de olika tonårsperioderna utformades en modifierad version av den accelererade versionen av det kroniska stressparadigmet för social nederlag. Denna modell kallades accelererad social nederlagsstress (AcSD) för tonårsmöss. Tidigare forskning visar att det finns signifikanta könsskillnader i känslighet för social stress i tonåren hos råttor 8,26,43,44,45, liksom i de skadliga effekterna av social stress på mentala hälsobanor hos människor 46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56. AcSD-modellen fungerar också effektivt för tonårsmöss, vilket gör det möjligt för dem att undersöka potentiella könsspecifika konsekvenser samt utforska den neurobiologiska grunden.

Tabell 1: Studier där stressparadigm för social förlust användes hos unga hanmöss. Stam och art: California Mus: Peromyscus californicus. C57BL/6: Mus musculus black 6 inavlad musstam. C57BL/6J: M. musculus black 6 inavlad musmodell tillhandahållen av Jackson's laboratories. CD-1: M. musculus från den schweiziska utavlade albinomusstammen. ICR: M. musculus Institute of Cancer Research utavlade albinomusstammen. OF1: M. musculus Oncins France 1 utavlad albinomusstam.
Förkortningar: wk = vecka; PND = Dag efter födseln; res = motståndskraftig; sus = mottaglig; unsus = oemottaglig. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experimentella procedurer utfördes i enlighet med riktlinjerna från Canadian Council of Animal Care och godkändes av McGill University och Douglas Hospital Animal Care Committee (godkännandenummer för djurförsök: 2005-5084). Alla möss placerades i ett temperatur- och luftfuktighetskontrollerat (21-22 °C; 60 %) kolonirum och i en 12 timmars ljus-mörkercykel (ljuset tändes kl. 8:00) vid Neurophenotyping Centre vid Douglas Mental Health University Institute. Mössen hade fri tillgång till mat och vatten under hela försöket. Möss tilldelades slumpmässigt till varje experimentellt tillstånd. Försöksdjuren erhölls från en kommersiell källa (se Materialförteckning). I tabell 2 sammanfattas djurets egenskaper för varje försöksfas. Totalt användes 489 unga C57BL/6J-möss (259 hanar; 230 honor) i 20 experimentella kohorter.

Tabell 2: Försökspersoner för varje försöksfas. †Om dessa djur inte är allvarligt skadade kan de återanvändas för priming. ‡Om dessa djur inte är allvarligt skadade kan de återanvändas för priming under AcSD, §Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute. För experiment med hanar, #För experiment med honor, om nederlaget är blandat, använd honor för priming. ††Ska inte användas för AcSD. Förkortningar: AcSD = accelererad social nederlagsstress; PND = Postnatal day Klicka här för att ladda ner denna tabell.

1. Acklimatisering

OBS: Denna fas bör pågå i minst 1 vecka.

  1. Köp hanmöss av CD-1 pensionerad uppfödare (se Materialförteckning) som är äldre än 4 månader och dubbelt så många som de unga C57BL/6J-mössen (dvs. om 10 möss kommer att utsättas för stress, köp 20 CD-1-möss).
    OBS: Att skaffa denna mängd CD-1-möss rekommenderas eftersom endast en liten andel av CD-1-mössen visar aggressivt beteende mot tonårsmöss.
  2. Låt CD-1-hanmössen vänja sig vid den nya anläggningen i sin hembur med mat och vatten ad libitum i 1 vecka före screening och priming.
  3. Använd C57BL/6 vid PND >65 (vuxna) och PND 25 ± 3 (ungdomar) (tabell 2) för screening- och primingsessionerna. Skaffa 4 C57BL/6-möss i varje ålder per dag för priming (dvs. för 3 dagars priming, skaffa 12 PND >65 och 12 PND 25 ± 3) för att minska risken för skador eftersom dessa djur kommer att användas upprepade gånger för screening och primingprocess.

2. CD-1 siktning och grundmålning

OBS: Varaktigheten av denna fas är 3 dagars screening (1 dag för honmöss) och 3-4 dagars priming (detta kan öka för honmöss och beroende på CD-1-mössens aggressiva beteende.)

  1. Använd den operativa definitionen av attack för att registrera attackerna på CD-1 enligt beskrivningen nedan.
    1. En attack definieras som när CD-1-musen biter i C57BL/6J-musen och C57BL/6J-musen rör sig bort som svar på bettet. Ett bett definieras som när CD-1-musen sätter tänderna på någon del av C57BL/6J-musens kropp. Att röra sig bort definieras som när C57BL/6J-musen flyttar båda sina baktassar från den position de var i innan CD-1-enheten kopplade in den.
    2. Se till att det finns en skillnad på minst ~2 s mellan separata attacker. Om mer än ett bett inträffar med <2 sekunders mellanrum räknas det som ett anfall.
    3. Om CD-1-musen biter mer än en gång i följd utan avbrott (<~2 s mellanrum), separera försiktigt djuren med en plastlinjal. Om CD-1-musen biter och inte släpper taget, separera djuren försiktigt. Om C57BL/6J-musen fastnar i ett hörn eller kläms fast av CD-1-musen och inte kan röra sig bort som svar på ett bett, separera försiktigt djuren med en linjal. Räkna alla dessa som en attack (upp till separation).
  2. Sållning
    1. Använd nitrilundersökningshandskar för all djurhantering och undvik att använda parfym eller doftämnen.
    2. Utför den 1:a dagen av screeningen endast med vuxna C57BL/6 hanmöss som inkräktare (PND >65) i CD-1-mössens hembur. Undersök alltid CD-1-mössen innan ett nytt experiment.
    3. Introducera en vuxen hane C57BL/6 mus PND >65 i hemburen på en CD-1 hanmus i 3 minuter. Registrera latensen till den första aggressionen och hur många aggressioner som utförs (se tilläggstabell 1).
    4. Från den 2:a till den sista screeningdagen, introducera en vuxen man C57BL/6 PND>65 i 1 minut (begränsning till 30 s om CD-1 är mycket aggressiv) och byt sedan ut den mot en tonåring C57BL/6 PND 25 ± 3 i 5 minuter.
      OBS: Det är viktigt att utföra screeningen med unga möss eftersom inte alla möss som attackerar den vuxna C57BL/6-hanmusen kommer att attackera den unga C57BL/6. Faktum är att CD-1-möss som angriper tonårsmöss inte alltid angriper vuxna C57BL/6-hanar.
    5. Om experimentet är för aggressivitet mot honmöss, utför screening och priming med unga honmöss, även om försöksmössen inkluderar båda könen.
    6. Registrera latensen till den första aggressionen, antalet attacker och de skador som alla C57BL/6-möss har fått (se tilläggstabell 2).
    7. Registrera alla typer av interaktioner: jaga, klättra beteenden, sniffa, putsa eller bita. Registrera dig om CD-1 inte närmar sig de unga C57BL/6-mössen; Om detta beteende upprepas i 2 dagar, ta inte med CD-1 i priming.
    8. För primingfasen, välj alla CD-1-möss som visar beteenden som att jaga, klättra, sniffa, följa, putsa eller bita tonåringen C57BL/6.
    9. Behåll de icke-valda CD-1-mössen och använd dem för testet för social interaktion (SIT).
      OBS: Territoriellt beteende ökar med tiden; därför kan de icke-selekterade CD-1-mössen bli aggressiva mot tonårsmöss i nästa experiment.
  3. Priming CD-1 aggressivt beteende
    1. Håll de CD-1-möss som valts ut för priming i sin hembur fram till den sista dagen för priming.
    2. Introducera en vuxen manlig C57BL/6J-mus PND >65 i 30 sekunder i CD-1-hemburen och byt sedan ut den mot en tonåring C57BL/6 PND 25 ± 3-mus i 5 minuter.
    3. Registrera latensen till den första aggressionen, antalet attacker och eventuell interaktion (se tilläggstabell 3).
    4. Utför priming 2 gånger om dagen i 3-4 dagar samtidigt som nederlagen är planerade (9:00 och 14:00).
      OBS: Inte alla CD-1-möss kommer att attackera de unga mössen under de första dagarna, särskilt om primingen är riktad mot honmöss. Antalet dagar för priming kan öka eller minska beroende på det aggressiva beteendet som CD-1-mössen uppvisar.
    5. För att minska antalet primingdagar, återanvänd CD-1-möss som tidigare har genomgått ett socialt nederlagsexperiment med hanmöss. Om CD-1-möss inte visar ökad aggression, förläng dagarna för priming tills kriterierna uppnås.
    6. Minska antalet dagar för priming om CD-1-mössen visar extremt aggressivt beteende (C57BL/6-möss visar överdriven skada) för att förhindra allvarliga skador under socialt nederlag.
    7. För nästa fas av experimentet, välj de CD-1-möss som attackerar de unga mössen minst 10x (hanar) eller 5x (honor) under 2 dagar i följd.

3. AcSD-protokoll

OBS: Denna fas består av 3 dagars tillvänjning och 4 dagars exponering för AcSD.

  1. Tillvänjning
    1. Ställ in råttburarna för socialt nederlag (Figur 1A-F). Dela upp råttburarna i 2 fack med hjälp av lämpliga avdelare av akrylglas (Figur 1B,D; se Materialtabell).
    2. Tillsätt strö av hårt träflis på båda sidor av buren, lägg till en bomullsfyrkant per sida som strömaterial (Figur 1D). Se till att trådtoppen är säkrad med bindemedelsklämmor (Figur 1E). Se till att råttburen är täckt med locket, utan skyddsbomull (Figur 1F).
    3. Placera en CD-1-mus per bur på ena sidan av buren. Placera en tagg på utsidan av buren för enkel identifiering av varje mus.
    4. Inhyss de utvalda CD-1-mössen i apparaten för social förlust (Figur 1F) 2 eller 3 dagar innan AcSD-protokollet startar (för att förbättra CD-1-revirbeteendet).
    5. Utför en primingsession 1 dag före experimentet; Detta är viktigt för att hålla aggressionen konsekvent.
  2. Besegra sessioner
    1. Utför 2 sessioner per dag (första sessionen: 9 på morgonen, andra sessionen: 2 på morgonen) i 4 dagar, 8 sessioner totalt. Gör ett schema för att säkerställa att angriparen kommer att vara olika för varje session (se tilläggstabell 4 och tilläggstabell 5).
    2. Väg C57BL/6 ungdomsmusen innan du för in den på CD-1-sidan av buren. Introducera en vuxen manlig C57BL/6-mus >65 i 30 sekunder i CD-1-sidan av nederlagsburen och byt sedan ut den mot en tonåring C57BL/6 PND 24-28-mus för en 10 minuter lång nederlagsepisod eller maximalt 10 attacker per session.
    3. Separera djuren efter varje attack med en plastlinjal. Efter varje session av nederlag, kontrollera om det finns skador och behandla dem med smärtlindringskräm. Registrera antalet skadade.
    4. Placera den tonåriga C57BL/6J-musen i det fria facket bredvid en obekant angripare tills nästa session. Upprepa proceduren med en annan angripare varje session.
    5. Starta sessionen med de experimentella möss och aggressormöss som inte parades ihop föregående session. Övervaka skadorna hos vuxna C57BL/6J-hanmöss som används för priming (se tilläggstabell 6).
  3. Följ rekommendationerna nedan för djurskydd och humana endpoints.
    1. Följ standardförfarandet för motsvarande institutionella granskningsnämnd för sociala nederlag och säkerställ konstant veterinärutvärdering.
    2. Övervaka mössens hälsa under hela studien för att undvika djurs lidande och död.
    3. Kontrollera att den perforerade avdelaren är korrekt inställd för att förhindra möss från att korsa till det andra facket.
    4. Meddela veterinärvårdspersonalen när ett djur har ett sår för lämplig övervakning och applicera smärtlindringskräm dagligen tills såret är helt läkt.
    5. Om en skada förvärras (såren ökar i storlek), begränsa attackerna till 5 i nästa session så att du kan återhämta dig. Kontrollera om det finns allvarliga skador. Allvarliga skador definieras som sår som är totalt > 1 cm.
    6. Omedelbart avlägsna och avliva djur som uppvisar en minskning på 15-20 % av deras vikt från den ursprungliga kroppsvikten. minskad/minskad rörelseaktivitet och försämrad grooming; möss med sår > 1 cm; avskuren penis eller bitmärken med svullnad i frambenen.
      OBS: Primär eutanasi utförs via isofluran/CO2-gaskammare följt av sekundär eutanasi utförd genom cervikal dislokation.
  4. Bekämpa möss
    1. Utför 2 sessioner per dag (första sessionen: 9 på morgonen, andra sessionen: 2 på morgonen) i 4 dagar, 8 sessioner totalt. Gör ett schema för att säkerställa att kontrollmössen delar buren med en annan C57BL/6J artfrände varje session (se tilläggstabell 7 och tilläggstabell 8).
      OBS: Kontrollmöss utsätts inte för en angripare. För att efterlikna introduktionen till en ny CD-1-mus varje nederlagssession, paras kontrollmössen ihop med en ny artfrände av samma kön och samma ålder (icke-kullsyskon) varje session.
    2. Inhysta kontrollmössen i apparaten för social förlust (Figur 1) i ett rum som är avskilt från det som finns hos AcSD-mössen.
    3. Placera två kontrollmöss per bur, en på varje sida av buren. Håll mössen på en annan sida av buren eller en helt annan bur, så att de inte känner igen lukten. Rotera kontrollmössen varje session.

Figure 1
Figur 1: Apparat för accelererad social nederlagsstress (AcSD) för tonårsmöss. (A) Från vänster till höger, parade ståltrådstoppar med 0,6 cm avstånd mellan stängerna, klar perforerad polykarbonatavdelare med perforeringsdiameter på 0,6 cm, bindemedelsklämmor för att säkra trådtopparna, klar råttbur med täcklock (utan bomullsskyddsskikt). (B) Upp: jämförelse mellan polykarbonatdelare för kronisk social förlust hos vuxna (vänster) och AcSD hos ungdomar (höger); Dun: Närbild till polykarbonatavdelaren för tonårsmöss. (C) Upp: jämförelse mellan ståltrådstopparna för kronisk social förlust hos vuxna (vänster) och AcSD hos ungdomar (höger); Ner: Närbild på ståltrådstopparna. (D-F) Uppbyggnad av den sociala nederlagsapparaten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Test för social interaktion

  1. Utför SIT efter AcSD som beskrivits tidigare 57,58,59.
    1. Utför SIT 24 timmar efter den sista sessionen av AcSD. Utför SIT under rödljusförhållanden (inte under gulljusförhållanden) mellan 9 och 4.
    2. Ställ in den fyrkantiga huvudarenan och videokameran över huvudet (se Materialtabell). Huvudarenan är uppdelad i 3 områden: zonen för social interaktion (SIZ), hörnen och centrum; Dessa områden ska markeras i arenan med en svart linje (använd en svart permanent markör). Använd följande dimensioner och kriterier för varje område.
      1. Se till att SIZ är det kvadratiska området 14 cm x 9 cm som omger höljet. Hörnen är små, kvadratiska områden (9 cm x 9 cm) i hörnen på väggen mittemot höljet och representerar den punkt som ligger längst bort från SIZ. Mitten är området mellan SIZ och hörnen.
    3. Rengör arenan och inhägnaden med en rengörande väteperoxidaslösning.
    4. Placera identitetsbrickor för varje djur på golvet för analys. Registrera alla djurs beteende för offlineanalys.
  2. Första sessionen för att fastställa baslinjeutforskning
    1. Placera ett tomt trådnätshölje mot en av väggarna i arenan. Placera den experimentella (besegrade eller kontrollerade) tonåriga C57BL/6-musen i mitten av arenan. Låt den utforska arenan fritt i 2,5 min. Hämta musen.
    2. Rengör arenan och inhägnaden med en rengörande väteperoxidaslösning.
  3. Andra sessionen för social interaktion
    1. Placera en obekant CD-1-mus inuti trådnätshöljet. Placera bilagan på samma plats som den föregående sessionen.
    2. Återintroducera samma tonåring C57BL/6-mus på arenan. Låt den utforska arenan fritt i 2,5 min. Hämta mössen.
    3. Rengör arenan och inhägnaden med en rengörande väteperoxidaslösning.
    4. Upprepa processen för alla unga C57BL/6-möss (stressade möss och kontrollmöss) i en balanserad ordning.
    5. Använd mer än en CD-1-mus för SIT för att minska hanteringsstress och bias (t.ex. för en kohort av 30 C57BL/6-möss, använd 4 CD-1-möss). Som motvikt till dem hos de unga mössen.
      OBS: Detta test mäter tillvägagångssättet och/eller undvikande beteendet hos de experimentella mössen mot ett socialt mål, som först beskrevs av Krishnan5 och Golden7.
  4. Analys
    1. Anteckna den tid som tillbringats i interaktionszonen och hörnen under testets båda sessioner.
    2. Beräkna förhållandet mellan social interaktion och den tid som tillbringas i interaktionszonen med den närvarande CD-1-aggressorn dividerat med den tid som tillbringas i interaktionszonen med CD-1-aggressorn frånvarande.
    3. Klassificera stressade möss med en kvot < 1,00 som känsliga och en kvot ≥ 1,00 som motståndskraftiga.
    4. Exkludera djur som inte utforskar arenan under den första sessionen (dvs. tillbringade 0 s i något av de angivna områdena) från alla analyser för att kontrollera skillnader i motorisk aktivitet.
    5. Exkludera alla djur som får 0 attacker i ≥4 sociala nederlagssessioner från alla analyser för att förhindra icke-representativa motståndskraftiga djur.
    6. Uteslut möss (ej mottagliga) som inte tillbringar minst 61 sekunder i interaktionszonen för att säkerställa att höga sociala interaktionsförhållanden återspeglar det faktiska intresset för det sociala målet.
    7. Uteslut möss med poäng för avvikande interaktionsförhållande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Totalt fyra olika experiment utfördes med hjälp av stressmodellen för kronisk social förlust hos ungdomar C57BL/6 hanmöss (PND 21). Denna modell innebar dock viktiga begränsningar för dess användning i tidiga tonåren av C57BL/6-möss.

Utrustning som krävs för ungdomar C57BL/6-möss
Den första begränsningen var att den utrustning som användes för apparaten för social förlust var avsedd för vuxna möss. På grund av sin storlek kunde unga C57BL/6-möss vid PND 21 passera genom perforeringarna av avdelarna till aggressorsidan. Detta avbröt perioden av sensorisk kontakt. Dessutom kunde unga möss fly genom stängerna på ståltrådstopparna. Därför modifierades utrustningen för att förhindra att mössen rymde (Figur 1). Diametern på perforeringarna ändrades från 1,1 cm till 0,6 cm (Figur 1B), och ståltrådstoppen byttes ut från en som hade 1,1 cm avstånd mellan stängerna till en med 0,6 cm avstånd (Figur 1C). Dessutom var locket säkrat med klämmor, och råttburarna var också täckta med plastöverdrag utan skyddande bomull. Flisbädden sattes också på en lämplig nivå för de unga mössen (Figur 1D-F).

AcSD-modellen kräver priming av vuxna hanar CD-1-möss för att säkerställa konsekventa, aggressiva anfall
Den andra och viktigare begränsningen var bristen på konsekvens i CD-1-mössens fysiska aggression mot de unga mössen. Under sessionerna med kroniska sociala nederlag varierade aggressionen från noll aggressiva attacker under 10-minuterssessionen till ett eller två bett som var dödliga på grund av den lilla storleken på de unga mössen. Men om CD-1-mössen användes för mer än ett experiment ökade konsistensen i antalet attacker.

Figur 2B visar antalet attacker per dag för varje experimentell kohort av kronisk social förlust (P0, A0, A1 och A2). En interaktion hittades mellan dag och kohort (Figur 2B, tvåvägs upprepade mätningar ANOVA: F(27, 234) = 3,83, p < 0,0001), huvudeffekt av dag (F(6,288, 163,5) = 6,2, p < 0,0001) och huvudeffekt av kohort (F(3, 26) = 3,8, p = 0,02). Post hoc-test avslöjade skillnader mellan kohorter dag 1, 2, 3 och 7 (Holm-Sidak post hoc-tester: dag 1, P0 vs. A2, p = 0,02; A1 jämfört med A2, p = 0,02; dag 2, A1 vs. A2, p = 0,04; dag, 3 A0 vs. A1, p = 0,007; A1 jämfört med A2, p = 0,04; dag 7, A0 vs. A1, p = 0,04). Alla CD-1-möss i experimenten P0 och A0 slutade attackera under de senaste 3 dagarna. CD-1-möss som användes för experimenten P0 och A0 användes i A1, där det fanns en konsistens i attackerna (Figur 2B), vilket indikerar att CD-1 var mer benägna att bli aggressiva om de utsatts för fysisk interaktion tidigare.

Av denna anledning, som beskrivs i steg 2.1 och 2.2, screenades CD-1-mössen specifikt för deras aggression mot de unga mössen och förbereddes med en vuxen C57BL/6-hane för aggression mot de unga C57BL/6-mössen. Dessutom användes AcSD för att höja åldern från PND 21 till PND 25 och fortfarande rikta in sig på tidiga tonåren.

Under AcSD-sessionerna ökade CD-1-mössen antalet attacker mot de unga mössen i ett mer konsistent mönster som visas i Figur 2D. Till skillnad från paradigmet för kronisk social förlust hittades ingen signifikant interaktion mellan sessionen och den experimentella kohorten (Figur 2D, tvåvägs upprepade mätningar ANOVA: F(35, 483) = 1,33, p = 0,1), det fanns en huvudeffekt av sessionen (F(5,644, 389,5) = 14,15, p < 0,0001) och en huvudeffekt av kohorten (F(5, 69) = 7,91, p < 0,0001); Holm-Sidak post hoc test visade inga signifikanta skillnader mellan kohorterna. En jämförelse av medelvärdet av attacker mellan kohorter avslöjade att denna effekt främst drevs av kohort A7, som hade ett signifikant högre antal attacker (data visas inte, enkelriktad ANOVA F(5, 69) = 7,911, p < 0,0001; Holm-Sidak post hoc-tester : A3 vs. A6, p = 0,04; A7 jämfört med A5, p = 0,002; A7 jämfört med A6, s < 0,0001; A7 jämfört med A8, p = 0,0001).

Tonårsmöss fick fler attacker med primade CD-1-möss under AcSD än tonårsmöss som exponerats för ett kroniskt socialt nederlagsprotokoll (Figur 2E, oparat t-test med Welchs korrigering, t = 15,40, df = 17,87, p < 0,0001) med naiva (icke-primade) CD-1-möss. Attackerna var inte konsekventa under det kroniska sociala nederlagsprotokollet, och i själva verket attackerades flera experimentella möss inte alls.

Figure 2
Figur 2: Jämförelse av antalet attacker per dag mellan kronisk social nederlagsstress och AcSD. (A) Tidslinje för stressmodellen för kronisk social nederlag. (B) Antal attacker per dag för varje experimentell kohort (P0, P1, A1 och A2) under kronisk social nederlagsstress hos unga C57BL/6 hanmöss (tvåvägs upprepade mätningar ANOVA). (C) Tidslinje för den accelererade modellen för social defeat stress (AcSD). (D) Antal attacker per dag för varje experimentell kohort (A3-A8) under AcSD hos unga C57BL/6 hanmöss (tvåvägs upprepade mätningar ANOVA). (E) Det genomsnittliga antalet attacker var signifikant högre för AcSD (oparat t-test med Welchs korrigering, ****p < 0,0001). Alla data visas som medelvärde ± SEM. Förkortningar: CSDS = kronisk social nederlagsstress; SIT = test för social interaktion; PND = postnatal dag; P0, A0-A8 = etiketter för varje experimentell kohort. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Mönster av attacker under AcSD-sessioner påverkar inte den sociala fenotypen 24 timmar senare
Efter exponering för social nederlagsstress visade de flesta unga hanmöss inte socialt undvikande när de testades i SIT (Figur 3B, kronisk social förlust: enkelriktad ANOVA F(2, 43) = 14,57, p < 0,0001. F, AcSD: Kruskal-Wallis test, H(2) = 72,35, p < 0,0001). För ingen av modellerna fanns det några signifikanta skillnader i antalet attacker mellan socialt undvikande och icke-socialt undvikande besegrade möss (Figur 3D, kronisk social förlust: tvåvägs upprepade mätningar ANOVA, F(9, 252) = 4,07, p = 0,21. H. AcSD: tvåvägs upprepade mätningar ANOVA, F(7, 511) = 1,32, p = 0,24). Andelen motståndskraftiga möss var dock högre efter kronisk social förlust än efter exponering för AcSD (Figur 3C,G, 70 % jämfört med 55,26 %, binomialtest (ensidigt), p = 0,0047).

Figure 3
Figur 3: Jämförelse av resultat från sociala interaktionstest (SIT) efter den kroniska sociala nederlagsstressen och AcSD-paradigmen. (A) Tidslinje för den kroniska stressmodellen för socialt nederlag. (B) Fördelning av SIT-poäng efter kronisk social nederlagsstress i tonåren (enkelriktad ANOVA). (C) Andel motståndskraftiga/mottagliga efter kronisk social nederlagsstress i tonåren. (D) Antal attacker efter fenotyp mottagna under kronisk social nederlagsstress, inga signifikanta skillnader mellan resilienta och mottagliga hittades (tvåvägs upprepade mätningar ANOVA). (E) Tidslinje för den accelererade modellen för social nederlagsstress (AcSD). (F) Fördelning av SIT-poäng efter AcSD i tonåren (Kruskal-Wallis). Denna siffra har ändrats från57. (G) Andelen motståndskraftiga/mottagliga efter AcSD i tonåren. Denna siffra har ändrats från57. (H) Antal attacker per fenotyp som mottagits under AcSD; det är ingen skillnad mellan resilient och mottaglig (tvåvägs upprepade mätningar ANOVA). Denna siffra har ändrats från59. **p < 0,001, ****p < 0,0001. Alla data visas som medelvärde ± SEM. Förkortningar: PND = postnatal dag; Nackdel = kontroller; Res = motståndskraftig; Sus = mottaglig. Klicka här för att se en större version av denna figur.

AcSD kan användas på unga C57BL/6 honmöss
Eftersom PND 25 C57BL/6 han- och honmöss inte har nått reproduktiv mognad, kan primade CD-1-möss uppvisa aggressiva attacker mot tonåriga honmöss på samma sätt som de gjorde mot tonåriga hanmöss. Primingfasen måste dock förlängas för att nå ett konstant antal attacker (figur 4A). Som visas i figur 4B hittades ingen interaktion mellan dag och kohort över experimenten (Figur 4B, tvåvägs upprepade mätningar ANOVA: F(35 707) = 1,38, p = 0,07), det fanns en huvudeffekt av sessionen (F(6,286, 634,9) = 16,1, p < 0,0001) och en huvudeffekt av kohorten (F(5, 101) = 11,34, p < 0,0001; Holm-Sidak post hoc-tester : session 2 C4 vs C8, p = 0,03; session 6 C7 vs C4, p = 0,02; C7 jämfört med C5, p = 0,02; session 7 C8 jämfört med C3, p = 0,02; C8 jämfört med C4, p = 0,045). Majoriteten av unga C57BL/6-honmöss som exponerades för AcSD var motståndskraftiga mot socialt undvikande (Figur 4C, Brown-Forsythes ANOVA: F(2 113,4) = 27,2, p < 0,0001), liknande tonårsmöss av hankön. Ingen signifikant skillnad hittades i antalet attacker mellan motståndskraftiga och mottagliga möss (Figur 4E, tvåvägs upprepade mätningar ANOVA, session x fenotypinteraktion: F(7, 714) = 0,73, p = 0,64, huvudeffekt av session F(6,375, 650,3) = 7,02, p < 0,0001, ingen huvudeffekt av fenotyp F(1, 102) = 0,4, p = 0,53).

Figure 4
Figur 4: AcSD hos unga honmöss. (A) Tidslinje för experimentet. (B) Antal attacker per dag genom experiment under AcSD (tvåvägs upprepade mätningar ANOVA). (C) Fördelning av SIT-poäng efter AcSD under tonåren hos honmöss (Brown-Forsythes ANOVA). (D) Andel motståndskraftiga/mottagliga efter AcSD i tonåren (höger). (E) Antal attacker per fenotyp som mottagits under AcSD; inga signifikanta skillnader mellan resilienta och mottagliga möss kunde påvisas (tvåvägs upprepade mätningar ANOVA). Alla data visas som medelvärde ± SEM. (C-E) Dessa siffror har ändrats från59. Förkortningar: SIT = test för social interaktion; PND = postnatal dag; C3-C8 = etiketter för varje experimentell kohort; Nackdel = kontroller; Res = motståndskraftig; Sus = mottaglig. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tilläggstabell 1: Mall för poängsättningsformulär för dag 1 av screening med vuxna. Förkortningar: CD-1 = ID för CD-1-möss som screenas, Exp = Experiment-ID, 3 min = Varaktighet för screeningsessionen för C57BL/6 vuxna möss, BL6 ID = ID för C57BL/6 vuxna möss som används för screening, Lat 1 ADULTS = Latensen för den första attacken från CD-1 mot C57BL/6 vuxenmusen, # aggressioner = Antal attacker utförda av CD-1. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell 2: Mall för poängsättning för screening med vuxna och ungdomar. Förkortningar: Exp = Experiment-ID, 1 min = Varaktighet för screeningsessionen för C57BL/6 vuxna möss, BL6 ID = ID för C57BL/6 vuxna möss som används för screening, Lat 1 ADULTS = Latensen för den första attacken från CD-1 mot C57BL/6 vuxenmusen, # aggressioner = Antal attacker utförda av CD-1, 5 min = Varaktighet för screeningsessionen för C57BL/6 ungdomsmöss, BL6 Ad = ID för C57BL/6 ungdomsmöss som används för screening, Lat 1 Adolescents = Latens för den första attacken från CD-1 mot C57BL/6 ungdomsmus, CD-1 = ID för CD-1-möss screenade. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell 3: Mall för poängsättningsblad för grundfasen. Förkortningar: CD-1 = ID för CD-1-möss som används för priming, Exp = Experiment-ID, 30 sek = Varaktighet för priming-sessionen för C57BL/6 vuxna möss, BL6 ID = ID för C57BL/6 vuxna möss som används för priming, Lat 1 ADULTS = Latens för den första attacken från CD-1 mot C57BL/6 vuxenmus, # aggressioner = Antal attacker utförda av CD-1, Min: 3 = Varaktighet för primingsessionen för C57BL/6 tonårsmöss, BL6 Ad = ID för C57BL/6 tonårsmöss som används för priming, Lat 1 ungdomar = Latenstid för den första attacken från CD-1 mot C57BL/6 ungdomsmus, # monteringar = Antal monteringar som mottagits av C57BL/6 tonårsmöss. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell 4: Mall för poängblad för schemaläggning av socialt nederlag (20 tonårsmöss). Förkortningar: CD1 = ID för CD-1-möss, E = Experiment, H = Luftfuktighet, 1:a = Session 1, 2:a = Session 2, BL6 vuxen = ID för C57BL/6 vuxna möss som används för priming, Vikt = Vikt för C57BL/6 tonårsmöss, # attacker = Antal attacker utförda av CD-1, # sår = Antal sår som C57BL/6 tonårsmöss har fått. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell 5: Exempel på schemaläggning av sociala nederlag. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell 6: Mall för skadeövervakning av vuxna C57BL/6 hanmöss. Förkortningar: 1:a - # sår = Antal sår som mottagits av den vuxna musen C57BL/6 i session 1, 2:a - # sår = Antal sår som mottagits av den vuxna musen C57BL/6 i session 2, BL6 = ID för C57BL/6 vuxna möss som använts för priming. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell 7: Mall för schemaläggning av kontrollgrupp (10 unga möss). Regler för förvrängning: Upprepa inte samma artfränder; En mus kan inte upprepa samma sida av lådan samma dag; Möss måste blandas med möss från olika burar från deras hembur; hemburarna är numrerade; Mössens nummer anges beroende på numret på hemburen; Besegrade och kontrollgrupper tas slumpmässigt från hemburen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell 8: Exempel på schemaläggning av kontrollgruppen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Konsekvent, aggressivt beteende hos CD-1-möss
Under screeningfasen är det mycket viktigt att notera alla beteenden som CD-1 uppvisar (jaga, klättra, sniffa, putsa eller bita) och att noga följa dessa register när du väljer CD-1-möss för AcSD. Det är troligt att en CD-1-mus som interagerar med den unga musen utan att angripa den kommer att utveckla aggressivitet mot unga möss under priming. En CD-1-mus som angriper en vuxen mus men inte närmar sig en ung mus kommer däremot troligen inte att utveckla aggressivitet mot tonårsmöss.

CD-1-primingfasen gör det möjligt att utveckla ett aggressivt beteende mot tonårsmöss. Därför är det viktigt att ha ett korrekt register över beteendena för att kunna välja ut mössen. Dessutom är det viktigt att alltid screena CD-1-mössen innan ett nytt experiment, även om en CD-1-mus har gått igenom ett nederlag tidigare. Vissa CD-1-möss kan sluta attackera tonårsmöss när de lämnas ostörda i sina hemburar under en period, andra kan utveckla ökat revirbeteende eftersom de hålls isolerade.

För priming av CD-1-mössen rekommenderar protokollet 3 dagar. Om naiva CD-1-möss används kan primingen förlängas om CD-1-mössen inte angriper de unga mössen aktivt. För CD-1-möss som har gått igenom socialt nederlag med tonårsmöss kan varaktigheten av denna primingfas minskas.

Screening- och primingfaserna är avgörande för framgångsrika AcSD-sessioner. Till exempel kommer CD-1-möss som har förberetts på rätt sätt att attackera och nå gränsen på 10 attacker snabbare än en mindre aggressiv CD-1-mus, vilket möjliggör korta nederlagsepisoder.

Under AcSD är det viktigt att separera djuren när attackerna är mycket våldsamma (dvs. CD-1-musen släpper inte taget om C57BL/6J-musen); Annars kommer de unga mössen att skadas och attackerna måste begränsas. Behandling av skador är också mycket viktigt för att undvika infektioner; Det rekommenderas att inte använda oljiga salvor för att behandla skador eftersom djuren kommer att slicka bort salvan, tappa hår i processen och exponera skadan.

Felsökning av AcSD som ska användas för ungdomar C57BL/6 han- och honmöss
Stressmodellen för kronisk social förlust innebar viktiga begränsningar för dess användning i tidiga tonåren hos både han- och honmöss av typen C57BL/6. I det här avsnittet beskrivs de ändringar som gjordes för utvecklingen av AcSD-modellen i tonåren.

Utrustning: Den fullständiga listan över utrustning finns i materialtabellen. C57BL/6 tonårsmöss i tidiga tonåren (PND 21-30) var för små för den utrustning som beskrivits tidigare och som tidigare använts i laboratoriet60. Diametern på perforeringarna på avdelarna av akrylglas är tillräckligt stor för att C57BL/6-möss ska kunna passera från ett fack till ett annat, där angriparen finns. För att förhindra detta tillverkades avdelare av akrylglas som har perforeringar med liten diameter. Dessutom behövde ståltrådstoppen säkras med klämmor för att förhindra möss från att fly från burarna. De täcklock som används används vanligtvis för ventilerade burar. I det här fallet användes dessa täcklock utan den skyddande bomullen för att möjliggöra ordentlig ventilation och för att förhindra möss från att fly från buren. Det är viktigt att tänka på att mängden träflisströ som används ska göra det möjligt för unga möss att nå maten och vattenautomaten som är placerad på locket. Stora mängder flis kan dock bli blöta.

Urval av CD-1-möss: I den kroniska modellen screenas CD-1-mössen för aggressivt beteende innan experimentet påbörjas. CD-1-möss väljs ut efter 3 dagars screening och deras aggressiva beteende bedöms. Efter screening väljs de djur ut som har latens för att attackera under 30 sekunder och som visar konsekventa attacker för nästa fas. Men under experimenten med kronisk social förlust upprätthöll CD-1-mössen inte ett konstant antal attacker under 10 dagar (Figur 2B). Därför var man tvungen att ta bort flera CD-1-möss från experimentet på grund av att de inte var aggressiva mot inkräktarmusen. Faktum är att även om endast en liten andel av CD-1-mössen attackerade inkräktarmusen, var några av dessa möss extremt aggressiva och skadade ibland allvarligt hanmössen C57BL/6 PND 21. Därför ändrades screeningen av CD-1-mössen till att selektera aggressiva möss mot tonårsmöss, vilket ökade den fysiska aggressionen.

Konsekvens av fysisk aggression: Konsekvent fysisk aggression leder till att man får ett snabbt och robust nederlag för inkräktaren6. För att standardisera procedurer mellan experiment och experimentatorer användes en operativ definition av attack57, vilket möjliggör exakt kvantitativ mätning av aggressivitet.

Priming aggressivitet: Under experimenten med kroniska sociala nederlag varierade antalet attacker kraftigt och minskade under de sista dagarna av experimentet (Figur 2B). För att öka det aggressiva beteendet hos CD-1-mössen mot de unga C57BL/6-mössen, var CD-1-mössen förberedda på att vara aktivt aggressiva oavsett vilka möss som introducerades i deras hembur. Detta beteende uppnåddes genom att introducera en vuxen C57BL/6 hanmus 1 minut före tonårsmusen, vilket uppmuntrade CD-1-musen att attackera de unga mössen efter att den vuxna musen hade hämtats.

Modellens varaktighet: Unga C57BL/6-möss vid PND 21 är mycket små, och CD-1-möss kan skada dem allvarligt med bara en attack. Därför, för att rikta in sig på tidiga tonåren och fortfarande ha upprepade sessioner av socialt nederlag, valdes en alternativ modell till den klassiska 10-dagars kroniska sociala nederlagsstressen. Den accelererade sociala nederlagsstressen (AcSD)42 består av två sessioner av fysisk aggression per dag, en session på morgonen och en på eftermiddagen, under totalt 4 dagar (8 sessioner). AcSD-modellen tillät en ökning av åldern på de tonåriga mössen från PND 21 till PND 25, fortfarande med fokus på tidiga tonår.

Begränsningar av AcSD i tonåren
AcSD-modellen har vissa begränsningar. Jämfört med den kroniska sociala nederlagsmodellen hos vuxna, kräver AcSD screening av dubbelt så många CD-1-möss från tonåringar C57BL/6-möss. Varaktigheten av primingfasen kan variera beroende på CD-1-mössens aggressiva beteende; som sådan bör AcSD-schemat planeras med förutseende, och alla dessa variabler måste beaktas. Eftersom de flesta unga möss kommer att visa motståndskraft mot socialt undvikande efter exponering för AcSD, bör den experimentella kohorten omfatta minst 20 djur för hanar och 30 för honor för att få ett representativt antal mottagliga möss.

AcSD hos tonårsmöss ger konsekventa resultat i alla experimentella kohorter
Efter att ha exponerats för social stress med både kronisk social förlust och AcSD-protokoll, visade de flesta unga hanmöss motståndskraft mot socialt undvikande. För modellen med kroniska sociala nederlag var det dock inte möjligt att avfärda variationen i antalet attacker från CD-1 som en förväxlingsvariabel. Däremot, för AcSD-experiment, förbereds CD-1-möss före varje nederlagssession för att få ett konsekvent antal attacker över sessionerna (Figur 2D,E). Sammantaget visar alla experimentella kohorter av möss som exponerats för AcSD ett liknande antal attacker över sessioner (Figur 2D); Detta är dock inte fallet för muskohorter som utsätts för den kroniska sociala nederlagsmodellen (Figur 2B).

Att använda den kroniska sociala nederlagsstressen hos vuxna C57BL/6-honmöss har varit utmanande i jämförelse med andra som använder denna modell på andra arter och stammar 9,13,45,61. För AcSD-experiment på unga C57BL/6-honmöss förlängdes primingfasen, vilket säkerställde det aggressiva beteendet hos CD-1-mössen (Figur 4A). Variation kan dock observeras i antalet attacker mellan kvinnliga experimentella kohorter (Figur 4B). Icke desto mindre, i dessa experiment visade alla CD-1-möss aggressivt beteende mot honor. För att öka antalet attacker kan primingen med hanmössen förlängas till 1 min. Liksom hos hanar var andelen unga C57BL/6-honmöss som var motståndskraftiga mot socialt undvikande högre än andelen som visade mottaglighet (Figur 4C,D). Dessutom skilde sig inte antalet angrepp mellan motståndskraftiga och mottagliga möss (Figur 4E), vilket tyder på att fenotypen är oberoende av angrepp. AcSD kan användas på unga C57BL/6-möss och experiment kan göras samtidigt på båda könen med samma CD-1-möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av Canadian Institutes for Health Research (CF Grant Numbers: MOP-74709; PJT 190045), National Institute on Drug Abuse (CF Grant number: R01DA037911), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (CF Grant Number: 2982226). Andrea Pantoja-Urban stöddes av Nationella rådet för humaniora, vetenskap och teknik/Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT) från Mexiko och FRQNT - Merit scholarship program for foreign students (PBEEE). Samuel Richer stöddes av ett stipendium från Integrated Program of Neuroscience vid McGill University. Figurillustrationerna skapades med hjälp av mallar från BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 adolescent mice  In house breeding Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice  Charles River Laboratories Strain Code: 027 Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice  Jackson Labs Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664 Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice  Charles River Laboratories Strain Code: 022 Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution  Virox Animal Health DIN 02537222 Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider  Manufactured by Douglas Hospital, custom order 0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages  Allentown 24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding Inotiv Envigo T.6060 iso-BLOX 2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding Inotiv Envigo Teklad 7090, 7115 Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops STAPLES Item #: 132429, Model #: 24178-CA 51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops Item #: 132367, Model #: 24172-CA 32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream Polysporin Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops  24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure  Johnston industrial plastics 11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena PEXIGLAS 45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas) 
Stopwatch  For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights  Swann SRDVR-44580V  Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software  Topscan 2.0 Clever Systems Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miczek, K. A. A new test for aggression in rats without aversive stimulation: Differential effects of d-amphetamine and cocaine. Psychopharmacology. 60, 253-259 (1979).
  2. Kudryavtseva, N., Bakshtanovskaya, I., Koryakina, L. Social model of depression in mice of c57bl/6j strain. Pharmacol Biochem Behav. 38 (2), 315-320 (1991).
  3. Blanchard, R. J., Mckittrick, C. R., Blanchard, D. C. Animal models of social stress: Effects on behavior and brain neurochemical systems. Physiol Behav. 73 (3), 261-271 (2001).
  4. Berton, O., et al. Essential role of bdnf in the mesolimbic dopamine pathway in social defeat stress. Science. 311 (5762), 864-868 (2006).
  5. Krishnan, V., et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell. 131 (2), 391-404 (2007).
  6. Bartolomucci, A., Fuchs, E., Koolhaas, J. M., Ohl, F. Acute and chronic social defeat: Stress protocols and behavioral testing. Neuromethods. 42, 261-275 (2009).
  7. Golden, S. A., Covington Iii, H. E., Berton, O., Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nat Protoc. 6 (8), 1183-1191 (2011).
  8. Bourke, C. H., Neigh, G. N. Behavioral effects of chronic adolescent stress are sustained and sexually dimorphic. Horm Behav. 60 (1), 112-120 (2011).
  9. Steinman, M. Q., Trainor, B. C. Sex differences in the effects of social defeat on brain and behavior in the California mouse: Insights from a monogamous rodent. Semin Cell Dev Biol. 61, 92-98 (2017).
  10. Takahashi, A., et al. Establishment of a repeated social defeat stress model in female mice. Sci Rep. 7 (1), 12838 (2017).
  11. Wright, E. C., et al. Sexual differentiation of neural mechanisms of stress sensitivity during puberty. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (43), 2306475120 (2023).
  12. Yin, W., et al. Repeated social defeat in female mice induces anxiety-like behavior associated with enhanced myelopoiesis and increased monocyte accumulation in the brain. Brain Behav Immun. 78, 131-142 (2019).
  13. Van Doeselaar, L., et al. Chronic social defeat stress in female mice leads to sex-specific behavioral and neuroendocrine effects. Stress. 24 (2), 168-180 (2021).
  14. Hollenstein, T., Lougheed, J. P. Beyond storm and stress: Typicality, transactions, timing, and temperament to account for adolescent change. Am Psychol. 68 (6), 444 (2013).
  15. Sawyer, S. M., Azzopardi, P. S., Wickremarathne, D., Patton, G. C. The age of adolescence. Lancet Child Adolesc Health. 2 (3), 223-228 (2018).
  16. Adriani, W., Laviola, G. Windows of vulnerability to psychopathology and therapeutic strategy in the adolescent rodent model. Behav Pharmacol. 15 (5), 341-352 (2004).
  17. Reynolds, L. M., et al. Early adolescence is a critical period for the maturation of inhibitory behavior. Cereb Cortex. 29 (9), 3676-3686 (2019).
  18. Reynolds, L. M., et al. Amphetamine disrupts dopamine axon growth in adolescence by a sex-specific mechanism in mice. Nat Commun. 14 (1), 4035 (2023).
  19. Sisk, L. M., Gee, D. G. Stress and adolescence: Vulnerability and opportunity during a sensitive window of development. Curr Opin Psychol. 44, 286-292 (2022).
  20. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neurosci Biobehav Rev. 24 (4), 417-463 (2000).
  21. Reynolds, L. M., Flores, C. Mesocorticolimbic dopamine pathways across adolescence: Diversity in development. Front Neural Circuits. 15, 735625 (2021).
  22. Manitt, C., et al. The netrin receptor dcc is required in the pubertal organization of mesocortical dopamine circuitry. J Neurosci. 31 (23), 8381-8394 (2011).
  23. Reynolds, L. M., et al. Dcc receptors drive prefrontal cortex maturation by determining dopamine axon targeting in adolescence. Biol Psychiatry. 83 (2), 181-192 (2018).
  24. Kalsbeek, A., Voorn, P., Buijs, R., Pool, C., Uylings, H. Development of the dopaminergic innervation in the prefrontal cortex of the rat. J Comp Neurol. 269 (1), 58-72 (1988).
  25. Cuesta, S., et al. Dcc-related developmental effects of abused-versus therapeutic-like amphetamine doses in adolescence. Addict Biol. 25 (4), 12791 (2020).
  26. Bekhbat, M., et al. Adolescent stress sensitizes the adult neuroimmune transcriptome and leads to sex-specific microglial and behavioral phenotypes. Neuropsychopharmacology. 46 (5), 949-958 (2021).
  27. Hammerslag, L. R., Gulley, J. M. Age and sex differences in reward behavior in adolescent and adult rats. Dev Psychobiol. 56 (4), 611-621 (2014).
  28. Wheeler, A. L., et al. Adolescent cocaine exposure causes enduring macroscale changes in mouse brain structure. J Neurosci. 33 (5), 1797-1803 (2013).
  29. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell Tissue Res. 354, 99-106 (2013).
  30. Makinodan, M., Rosen, K. M., Ito, S., Corfas, G. A critical period for social experience-dependent oligodendrocyte maturation and myelination. Science. 337 (6100), 1357-1360 (2012).
  31. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces a depression-like phenotype in adolescent male c57bl/6 mice. Stress. 17 (3), 247-255 (2014).
  32. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces depression-like behavior and alters spine morphology in the hippocampus of adolescent male c57bl/6 mice. Neurobiol Stress. 5, 54-64 (2016).
  33. Latsko, M. S., Farnbauch, L. A., Gilman, T. L., Lynch Iii, J. F., Jasnow, A. M. Corticosterone may interact with peripubertal development to shape adult resistance to social defeat. Horm Behav. 82, 38-45 (2016).
  34. Zhang, F., Yuan, S., Shao, F., Wang, W. Adolescent social defeat induced alterations in social behavior and cognitive flexibility in adult mice: Effects of developmental stage and social condition. Front Behav Neurosci. 10, 149 (2016).
  35. Xu, H., et al. Effects of adolescent social stress and antidepressant treatment on cognitive inflexibility and bdnf epigenetic modifications in the mpfc of adult mice. Psychoneuroendocrinology. 88, 92-101 (2018).
  36. Huang, G. B., et al. Effects of chronic social defeat stress on behaviour, endoplasmic reticulum proteins and choline acetyltransferase in adolescent mice. Int J Neuropsychopharmacol. 16 (7), 1635-1647 (2013).
  37. Hasegawa, S., et al. Dysfunction of serotonergic and dopaminergic neuronal systems in the antidepressant-resistant impairment of social behaviors induced by social defeat stress exposure as juveniles. Int J Neuropsychopharmacol. 21 (9), 837-846 (2018).
  38. Resende, L., et al. Social stress in adolescents induces depression and brain-region-specific modulation of the transcription factor max. Transl Psychiatry. 6 (10), e914 (2016).
  39. Mouri, A., et al. Juvenile social defeat stress exposure persistently impairs social behaviors and neurogenesis. Neuropharmacology. 133, 23-37 (2018).
  40. Rodriguez-Arias, M., et al. Social defeat in adolescent mice increases vulnerability to alcohol consumption. Addict Biol. 21 (1), 87-97 (2016).
  41. Montagud-Romero, S., et al. Repeated social defeat and the rewarding effects of cocaine in adult and adolescent mice: Dopamine transcription factors, probdnf signaling pathways, and the trkb receptor in the mesolimbic system. Psychopharmacology. 234, 2063-2075 (2017).
  42. Wilkinson, M. B., et al. A novel role of the wnt-dishevelled-gsk3β signaling cascade in the mouse nucleus accumbens in a social defeat model of depression. J Neurosci. 31 (25), 9084-9092 (2011).
  43. Hyer, M., et al. Chronic adolescent stress causes sustained impairment of cognitive flexibility and hippocampal synaptic strength in female rats. Neurobiol Stress. 14, 100303 (2021).
  44. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain Behav Immun. 76, 248-257 (2019).
  45. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain Behav Immun. 30, 88-94 (2013).
  46. Dalsgaard, S., et al. Incidence rates and cumulative incidences of the full spectrum of diagnosed mental disorders in childhood and adolescence. JAMA psychiatry. 77 (2), 155-164 (2020).
  47. Pedersen, C. B., et al. A comprehensive nationwide study of the incidence rate and lifetime risk for treated mental disorders. JAMA psychiatry. 71 (5), 573-581 (2014).
  48. Heim, C., Shugart, M., Craighead, W. E., Nemeroff, C. B. Neurobiological and psychiatric consequences of child abuse and neglect. Dev Psychobiol. 52 (7), 671-690 (2010).
  49. Kessler, R. C., Petukhova, M., Sampson, N. A., Zaslavsky, A. M., Wittchen, H. U. Twelve-month and lifetime prevalence and lifetime morbid risk of anxiety and mood disorders in the united states. Int J Methods Psychiatr Res. 21 (3), 169-184 (2012).
  50. Boyd, A., et al. Gender differences in mental disorders and suicidality in europe: Results from a large cross-sectional population-based study. J Affect Disord. 173, 245-254 (2015).
  51. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex differences and stress across the lifespan. Nat Neurosci. 18 (10), 1413-1420 (2015).
  52. Hankin, B. L., Mermelstein, R., Roesch, L. Sex differences in adolescent depression: Stress exposure and reactivity models. Child Dev. 78 (1), 279-295 (2007).
  53. Kim, S., Colwell, S. R., Kata, A., Boyle, M. H., Georgiades, K. Cyberbullying victimization and adolescent mental health: Evidence of differential effects by sex and mental health problem type. J Youth Adolesc. 47, 661-672 (2018).
  54. Filipponi, C., Petrocchi, S., Camerini, A. L. Bullying and substance use in early adolescence: Investigating the longitudinal and reciprocal effects over 3 years using the random intercept cross-lagged panel model. Front Psychol. 11, 571943 (2020).
  55. Brody, G. H., Yu, T., Chen, E., Miller, G. E. Persistence of skin-deep resilience in african american adults. Health Psychol. 39 (10), 921 (2020).
  56. Rijlaarsdam, J., Cecil, C. A., Buil, J. M., Van Lier, P. A., Barker, E. D. Exposure to bullying and general psychopathology: A prospective, longitudinal study. Res Child Adolesc Psychopathol. 49, 727-736 (2021).
  57. Vassilev, P., et al. Unique effects of social defeat stress in adolescent male mice on the netrin-1/dcc pathway, prefrontal cortex dopamine and cognition. eNeuro. 8 (2), (2021).
  58. Vassilev, P., et al. Custom-built operant conditioning setup for calcium imaging and cognitive testing in freely moving mice. eNeuro. 9 (1), (2022).
  59. Pantoja-Urbán, A. H., et al. Gains and losses: Resilience to social defeat stress in adolescent female mice. Biol Psychiatry. 95 (1), 37-47 (2024).
  60. Torres-Berrío, A., et al. Dcc confers susceptibility to depression-like behaviors in humans and mice and is regulated by mir-218. Biol Psychiatry. 81 (4), 306-315 (2017).
  61. Ver Hoeve, E. S., Kelly, G., Luz, S., Ghanshani, S., Bhatnagar, S. Short-term and long-term effects of repeated social defeat during adolescence or adulthood in female rats. Neuroscience. 249, 63-73 (2013).

Tags

Nyckelord: Social Defeat Stress Tonårsmöss C57BL/6 Hane och Kvinna Socialt Undvikande Accelerated Social Defeat Stress (AcSD) modell Hjärnans utveckling Beteendemässiga utfall
Social Defeat Stress Modell för ungdomar C57BL/6 han- och honmöss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantoja-Urbán, A. H., Richer,… More

Pantoja-Urbán, A. H., Richer, S., Giroux, M., Nouel, D., Flores, C. Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL/6 Male and Female Mice. J. Vis. Exp. (205), e66455, doi:10.3791/66455 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter